Technical Article
Consideration of visualization using the CISH (chromogenic in situ hybridization) method after HER2 FISH
2024 Volume 73 Issue 4 Pages 708-718
Details
2024 Volume 73 Issue 4 Pages 708-718
当院ではhuman epidermal growth factor receptor type 2 fluorescence in situ hybridization（HER2 FISH）の蛍光観察を2～4人で行っている。しかし，境界域（equivocal）や判定困難な症例の場合は観察に長時間を要し，励起光の照射による蛍光の褪色が進みシグナルの確認が困難になる場合がある。そこでHER2 FISH施行後のchromogenic in situ hybridization（CISH）法による明視野でのVisualization（可視化）を検討した。検討の結果，（1）カクテル抗体（抗Rhodamine抗体 <×2,000>，抗Fluorescein抗体 <×200>）室温30分，（2）AP標識抗IgGポリクローナル抗体（Histofine Simple Stain AP <R>）室温30分，（3）BCIP/NBT室温1～3分，（4）PO標識モノクローナル抗IgG抗体（Histofine Simple Stain MAX PO <M>）室温30分，（5）AEC室温10分，乾燥後（6）水溶性Aquatex封入，で可視化が可能となった。この方法であれば，褪色や保存スペースの問題点の軽減，標本のデジタル化を含めた臨床医への提供，内部精度管理や教育への利用など，有用性は高いと考える。
At our hospital, 2 to 4 people perform fluorescence observation to determine HER2 FISH (human epidermal growth factor receptor type 2 fluorescence in situ hybridization). However, in the case of equivocal or difficult-to-diagnose cases, observation takes a long time, and the fluorescence fades due to excitation light irradiation, making it difficult to confirm the signal under direct vision. Therefore, we investigated visualization using the CISH (chromogenic in situ hybridization) method after HER2 FISH. As a result of the study, (1) cocktail antibodies (anti-Rhodamine monoclonal antibody <×2,000>), anti-Fluorescein antibody <×200>) were incubated at room temperature for 30 minutes, (2) AP-labeled anti-IgG polyclonal antibody (Histofine Simple Stain AP <R>) was incubated at room temperature. 30 minutes, (3) BCIP/NBT 1–3 minutes at room temperature, after washing (4) PO-labeled monoclonal anti-IgG antibody (Histofine Simple Stain MAX PO <M>) 30 minutes at room temperature, (5) AEC 10 minutes at room temperature, after drying (6) Visualization became possible with the protocol of water-soluble Aquatex encapsulation. We believe it will be highly useful, including reducing problems with fading and storage space at −20°C, providing virtualization to clinicians, and using it for internal quality control and education.
Fluorescence in situ hybridization（FISH）法は，蛍光標識したDNAプローブと試料染色体上の目的とするDNAとをハイブリダイズさせ，蛍光顕微鏡にて蛍光シグナルを判定する方法である。
当院では乳癌検体を主体とし一部の胃癌および大腸癌症例において，2020年より院内にて検査を実施している。
使用キットは，株式会社常光の組織検査用腫瘍マーカーキットのヒストラHER2 FISHキットであり，本キットはFISH法によるHER-2/neu遺伝子の増幅を測定するものである。HER-2/neu DNAプローブは，HER-2/neu遺伝子（17q11.2-q2）に特異的なDNAプローブであり，ローダミン（赤色）で直接標識されている。また，Ch17 DNAプローブ（chromosome17 centromeric probe; Ch17）は，17番染色体のセントロメア領域にあるアルファサテライトDNA配列に特異的なDNAプローブであり，fluorescein（緑色）で直接標識されている。
ハイブリダイゼーションの結果を観察するためには，落射型の蛍光顕微鏡を用いて暗視野で鏡検するが，equivocal等で判定に苦慮し蛍光観察に時間を要する場合や，複数人でカウントする場合に褪色が進み，シグナルの確認が困難になる症例も多くみられる。褪色防止のためにも，また客観的な解析のためにもスライド標本をデジタル化することが望ましいが，シグナルを蛍光発色させ，油浸レンズで観察するFISH法ではそれも難しい。Chromogenic in situ hybridization（CISH）法1)～8)，silver-enhanced in situ hybridization（SISH）法9)～11)，dual color in situ hybridization（DISH）法12)～14)など明視野で観察できるin situ hybridization（ISH）法も存在しており，市販されているキットも多数ある。しかし，それらはあらかじめプローブにジゴキシゲニンやハプテンが標識されているものが多い。一方，われわれは，観察し終えたFISHスライドガラスを−20℃で冷凍し長期にわたり保存しているが，そのスペース確保にも苦慮している。そこで，FISH法の判定終了後におけるデジタル化ならびに永久保存を目的に明視野での可視化を検討し，良好な結果を得ることができたので報告する。
材料は，当院における手術材料から作製されたHER2 in-houseコントロールアレイ切片（1+, 2+, 3+）ならびに，精度管理用試料HER2 4in1コントロールスライド（ロシュ・ダイアグノスティックス社），HER2コントロールスライド：SK-BR-3/3+，SR/−（ニチレイ）を用いた。まず，ヒストラHER2 FISHキット（常光）によるFISH法を添付文書に従い行った。ヒストラHER2 FISHキットのHER-2/neu DNAプローブはRhodamine（赤色）で直接標識されており，一方のCh17 DNAプローブはfluorescein（緑色）で直接標識されていることから，それぞれに対する一次抗体はRhodamine antibody：11H10（Gene Tex社）抗体とFluorescein/Oregon Green Polyclonal Antibody（Invitrogen）抗体を使用した。蛍光での判定後，下記について検討を行った。また，条件決定後，凍結保存しておいた診断済みの過去の症例を用いて染色した。
1． 基質の選択（Table 1）| カバーガラス剥離（アセトン） | ||||
| TBS-T（洗浄） | ||||
| 3%過酸化水素水（+） | 3%過酸化水素水（−） | 5分 | 3%過酸化水素水（+） | 3%過酸化水素水（−） |
| TBS-T（洗浄） | ||||
| 抗Rhodamineモノクローナル抗体（×4,000） | 30分 | 抗Fluoresceinポリクローナル抗体（×400） | ||
| TBS-T（洗浄） | ||||
| Histofine Simple Stain MAX PO（M） | Histofine Simple Stain AP（M） |
30分 | Histofine Simple Stain MAX PO（R） |
Histofine Simple Stain AP（R） |
| TBS-T（洗浄） | ||||
| （a-1）DAB，（a-2）AEC | （a-3）NF，（a-4）PR， （a-5）BCIP/NBT |
1～15分 | （b-1）DAB，（b-2）AEC | （b-3）NF，（b-4）PR， （b-5）BCIP/NBT |
| 流水水洗 5分 | ||||
| 風乾 | ||||
| 封入 | ||||
NF; new fuchsin, PR; permanent red
アセトンでカバーガラス周囲のマニキュアを除去しカバーガラスを外した後，0.05% Tween20含有Tris-buffered saline（TBS-T）にて核染色に用いた蛍光色素である4',6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）（Vector Laboratories）を洗い落とし，下記の方法で染色を行った。
a） Rhodamineに対する染色Human epidermal growth factor receptor type 2（HER2）は，予備実験にて確定した4,000倍希釈Rhodamine antibody抗体を30分間反応させた。
二次抗体はペルオキシダーゼ標識であるHistofine MAX-PO（M）（ニチレイ）とアルカリホスファターゼ標識であるHistofine Simple Stain AP（M）（ニチレイ）の両者をそれぞれ30分間反応させた。ペルオキシダーゼに対する基質には（a-1）3,3'-Diaminobenzidine（DAB）（ニチレイ）と（a-2）3-Amino-9-Ethyl Carbazole（AEC）（ニチレイ）を用いた。アルカリホスファターゼに対する基質には（a-3）ニューフクシン基質キット（ニチレイ），（a-4）Liquid Permanent Red（DAKO），（a-5）5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/Nitroblue Tetrazolium Tablet（BCIP/NBT）（Roche）を用いた。
b） Fluoresceinに対する染色Ch17は，予備実験にて確定した400倍希釈Fluorescein/Oregon Green Polyclonal Antibody抗体を30分間反応させた。
二次抗体はペルオキシダーゼ標識であるHistofine Simple Stain MAX-PO（R）（ニチレイ）とアルカリホスファターゼ標識であるHistofine Simple Stain AP（R）（ニチレイ）をそれぞれ30分間反応させた。
ペルオキシダーゼに対する基質には（b-1）DABと（b-2）AECを用いた。アルカリホスファターゼに対する基質には（b-3）ニューフクシン基質キット，（b-4）Liquid Permanent Red，（b-5）BCIP/NBTを用いた。
なお，ペルオキシダーゼ発色は，3%過酸化水素水で内因性ペルオキシダーゼを除去し，インキュベートはすべてモイストチャンバー内にて常温で行った。また，DAB以外については水溶性封入剤であるAquatex（Merck社）を使用した。
2． 二重染色（Table 2）| 二重染色（一次抗体；カクテル抗体使用） | 二重染色（一次抗体；カクテル抗体使用なし） | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| protocol 1（a） | protocol 2（b） | protocol 3（a） | protocol 4（b） | ||||||
| 1 | カバーガラス剥離 | カバーガラス剥離 | 1 | カバーガラス剥離 | カバーガラス剥離 | ||||
| 2 | 洗浄TBS-T | 洗浄TBS-T | 2 | 洗浄TBS-T | 洗浄TBS-T | ||||
| 3 | 3%過酸化水素水 | 5分 | 3%過酸化水素水 | 5分 | 3 | anti-Fluorescein（P）×400 | 30分 | 3%過酸化水素水 | 5分 |
| 4 | 洗浄TBS-T | 洗浄TBS-T | 4 | 洗浄TBS-T | 洗浄TBS-T | ||||
| 5 | カクテル抗体 | 30分 | カクテル抗体 | 30分 | 5 | Histofine Simple Stain AP（R） | 30分 | anti-Rhodamine（M）×4,000 | 30分 |
| anti-Rhodamine（M）×2,000 | anti-Rhodamine（M）×2,000 | 6 | 洗浄TBS-T | 洗浄TBS-T | |||||
| anti-Fluorescein（P）×200 | anti-Fluorescein（P）×200 | 7 | BCIP/NBT | 1–3分 | Histofine Simple Stain MAX PO（M） | 30分 | |||
| 6 | 洗浄TBS-T | 洗浄TBS-T | 8 | 流水水洗およびDW | 5分 | 洗浄TBS-T | |||
| 7 | Histofine Simple Stain AP（R） | 30分 | Histofine Simple Stain MAX PO（M） | 30分 | 9 | 3%過酸化水素水 | 5分 | AEC | 10分 |
| 8 | 洗浄TBS-T | 洗浄TBS-T | 10 | 洗浄TBS-T | 流水水洗およびDW | 5分 | |||
| 9 | BCIP/NBT | 1–3分 | AEC | 10分 | 11 | anti-Rhodamine（M）×4,000 | 30分 | 洗浄TBS-T | |
| 10 | 流水水洗およびDW | 5分 | 流水水洗およびDW | 5分 | 12 | 洗浄TBS-T | anti-Fluorescein（P）×400 | 30分 | |
| 11 | Histofine Simple Stain MAX PO（M） | 30分 | 洗浄TBS-T | 13 | Histofine Simple Stain MAX PO（M） | 30分 | 洗浄TBS-T | ||
| 12 | 洗浄TBS-T | Histofine Simple Stain AP（R） | 30分 | 14 | 洗浄TBS-T | Histofine Simple Stain AP（R） | 30分 | ||
| 13 | AEC | 10分 | 洗浄TBS-T | 15 | AEC | 10分 | 洗浄TBS-T | ||
| 14 | 流水水洗およびDW | 5分 | BCIP/NBT | 1–3分 | 16 | 流水水洗およびDW | 5分 | BCIP/NBT | 1–3分 |
| 15 | 風乾 | 流水水洗およびDW | 5分 | 17 | 風乾 | 流水水洗およびDW | 5分 | ||
| 16 | 水溶性Aquatex封入 | 風乾 | 18 | 水溶性Aquatex封入 | 風乾 | ||||
| 17 | 水溶性Aquatex封入 | 19 | 水溶性Aquatex封入 | ||||||
一次抗体であるRhodamine antibodyを2,000倍希釈に，Fluorescein/Oregon Green Polyclonal Antibodyを200倍に希釈後，等量混合しカクテル抗体を作製した。まず，アセトンでカバーガラス周囲のマニキュアを除去しカバーガラスを外した後，TBS-TにてDAPIを洗い落とし，3%過酸化水素水で内因性ペルオキシダーゼ除去した。さらに，TBS-Tにて洗浄後，カクテル抗体を30分間反応させた。なお，1．基質の選択においてRhodamineに対する染色は（a-2）の赤色であるAECのみが有効であったため，Fluoresceinに対する染色は対比のコントラストを考え青色であるBCIP/NBTとした。よって，二次抗体以降は下記の方法で比較した。
a．Histofine Simple Stain AP（R）を30分間反応させBCIP/NBT（1錠を10 mLの精製水に溶解：0.4 mg/mL NBT；0.19 mg/mL BCIP；100 mM Tris buffer，pH 9.5；50 mM MgSO4）を1～3分間反応させた。水洗後，続けてHistofine Simple Stain MAX-PO（M）を30分間反応させ基質にはAECを10分間反応させた。
b．Histofine Simple Stain MAX-PO（M）を30分間反応させ基質にはAECを10分間反応させた。水洗後，続けてHistofine Simple Stain AP（R）を30分間反応させBCIP/NBTを1～3分間反応させた。
なお，Rhodamine antibodyとFluorescein/Oregon Green Polyclonal Antibodyをカクテル抗体とせずに染色を行う場合も検討した。その際には，Rhodamine antibodyを4,000倍に，Fluorescein/Oregon Green Polyclonal Antibodyを400倍に希釈後，両者の染色順序を入れ替え，染色を行った。以上の中から最適プロトコールの選定を行った。
3． 検体を用いた検証−20℃保存しているHER2 FISH診断済みの標本（1～3年間保存）のうち陽性検体8例，陰性検体12例を使用して明視野での可視化を行い，2人で各々鏡検し，FISH法との一致率（平均HER2/CEP17比，平均HER2遺伝子コピー数）を検証した。なお，シグナルの計測と判定は，FISH法ならびにCISH法ともに2人の平均値とした。
4． 標本のデジタル化NanoZoomer S360MDスライドスキャナシステムC13220-11MDJ（浜松ホトニクス社）にて，Z-スタック機能を用いて画像をデータベース化した。Z軸を0.5 μmずつ上下4枚の計8枚4 μmでスキャンした。画像閲覧ソフトウエアNDP.view 2（浜松ホトニクス社）にてスキャンされた画像のシグナルをカウントして一致率を比較した。
| fluorescent dyes | Primary antibodies | Preprocessing | Secondary antibodies | chromogenic substrates | time (min) | Mounting medium | result | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| R1-1 | HER2 (Rhodamine) | anti-Rhodamine (M) (×4,000) | H2O2 | Histofine MAX-PO (M) | DAB | 2 | Malinol (water insoluble) | × non-specific reactions |
| R1-2 | H2O2 | Histofine MAX-PO (M) | AEC | 10 | Aquatex (water soluble) | 〇 high sensitivity | ||
| R1-3 | Histofine Simple Stain AP (M) | New Fuchsin | 15 | Aquatex (water soluble) | △ uneven～low sensitivity | |||
| R1-4 | Histofine Simple Stain AP (M) | Permanent Red | 15 | Aquatex (water soluble) | △ uneven～low sensitivity | |||
| R1-5 | Histofine Simple Stain AP (M) | BCIP/NBT | 5 | Aquatex (water soluble) | △～× non-specific reactions | |||
| F1-1 | CEP17 (Fluorescein) | anti-Fluorescein (P) (×400) | H2O2 | Histofine MAX-PO (R) | DAB | 1 | Malinol (water insoluble) | × non-specific reactions |
| F1-2 | H2O2 | Histofine MAX-PO (R) | AEC | 2 | Aquatex (water soluble) | 〇 high sensitivity | ||
| F1-3 | Histofine Simple Stain AP (R) | New Fuchsin | 2 | Aquatex (water soluble) | 〇 high sensitivity | |||
| F1-4 | Histofine Simple Stain AP (R) | Permanent Red | 5 | Aquatex (water soluble) | 〇 high sensitivity | |||
| F1-5 | Histofine Simple Stain AP (R) | BCIP/NBT | 2 | Aquatex (water soluble) | 〇 high sensitivity |
抗Rhodamine抗体においてはAECのみ有効であり，抗Fluorescein/Oregon Green抗体においてはDAB以外のAEC，NF，Permanent Red，BCIP/NBT全て染色性は良好であった。
ペルオキシダーゼに対する基質においてDABは非特異反応が強く，シグナルも濃淡にばらつきがみられた。AECでは非特異反応は弱くシグナルに特異的に染めることができた。アルカリホスファターゼに対する基質では，ニューフクシン，Permanent Red，BCIP/NBTいずれにおいても，シグナルの染色性は弱く濃淡にばらつきがみられた。
b） 抗Fluorescein/Oregon Green Polyclonal Antibody抗体ペルオキシダーゼに対する基質においてDABは非特異反応が強かったが，AECおよびアルカリホスファターゼに対する基質であるニューフクシン，Permanent Red，BCIP/NBTはすべて，シグナルは強く，濃淡のばらつきもみられなかった。ただし，発色するまでの時間はきわめて短く，長めに反応させることで非特異反応も強くなった。
2． 二重染色（Table 4, Figure 2–5）| 1 | カバーガラス剥離 | |
| 2 | 洗浄TBS-T | |
| 3 | 3%過酸化水素水 | 5分 |
| 4 | 洗浄TBS-T | |
| 5 | カクテル抗体 | 30分 |
| 抗Rhodamineモノクローナル抗体（×2,000） | ||
| 抗Fluoresceinポリクローナル抗体（×200） | ||
| 6 | 洗浄TBS-T | |
| 7 | Histofine Simple Stain AP（R） | 30分 |
| 8 | 洗浄TBS-T | |
| 9 | BCIP/NBT | 1～3分 |
| 10 | 流水水洗～DW | 5分 |
| 11 | Histofine Simple Stain MAX PO（M） | 30分 |
| 12 | 洗浄TBS-T | |
| 13 | AEC | 10分 |
| 14 | 流水水洗～DW | 5分 |
| 15 | 風乾 | |
| 16 | 水溶性Aquatex封入 |
ヒストラHER2 FISHキット（常光）の可視化は可能であった。
a. FISH法とb. 可視化の両者は類似した染色性を呈した。
a. FISH法とb. 可視化の両者は類似した染色性を呈した。
a. FISH法とb. 可視化の両者は類似した染色性を呈した。
a，bともにHER2シグナルは赤色に，CEP17は濃青色に明瞭に染まった。ただし，bではHER2シグナルはBCIP/NBTの影響か赤色が不鮮明で青みがかっていたのに対し，aでは赤はより鮮明であった。また，カクテル抗体を使用しない場合も，カクテル抗体使用時と同様，BCIP/NBTをAECよりも先行して使用するProtocol 3（a）の方が染色性は良好であった。カクテル抗体使用時と未使用時とでは染色性に乖離は認められなかったことから，染色時間が短縮できるカクテル抗体を使用するprotocol 1を推奨プロトコールとした。
3． 検体を用いた検証（Table 5, Figure 6–9）| HER2/CEP比 | HER2 Copies | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| FISH | Visualization | FISH | Visualization | ||
| 陰性 | 1 | 1.2 | 1.2 | 2.3 | 2.2 |
| 2 | 1.0 | 1.1 | 2.0 | 2.1 | |
| 3 | 1.0 | 1.2 | 2.1 | 2.0 | |
| 4 | 1.2 | 1.3 | 2.6 | 2.7 | |
| 5 | 1.3 | 1.4 | 2.3 | 2.3 | |
| 6 | 1.1 | 1.4 | 2.0 | 2.0 | |
| 7 | 1.1 | 1.3 | 2.2 | 2.2 | |
| 8 | 1.5 | 1.6 | 2.4 | 2.4 | |
| 9 | 1.2 | 1.1 | 2.4 | 2.2 | |
| 10 | 1.1 | 1.1 | 2.5 | 2.3 | |
| 11 | 1.3 | 1.2 | 2.0 | 2.1 | |
| 12 | 1.3 | 1.3 | 1.9 | 1.8 | |
| 陽性 | 1 | 2.4 | 2.3 | 5.1 | 4.8 |
| 2 | 9.3 | 8.1 | 18.2 | 19.0 | |
| 3 | 7.5 | 7.1 | 20.0 | 20.0 | |
| 4 | 3.0 | 2.8 | 14.2 | 11.1 | |
| 5 | 4.6 | 4.5 | 8.7 | 9.9 | |
| 6 | 7.1 | 7.7 | 20.0 | 20.0 | |
| 7 | 7.7 | 7.8 | 20.0 | 20.0 | |
| 8 | 6.6 | 5.0 | 13.6 | 10.6 | |
a. FISH法とb. 可視化の両者は類似した染色性を呈した。
a. FISH法とb. 可視化の両者は類似した染色性を呈した。
両者には良好な相関がみられた。
両者には良好な相関がみられた。
過去の保存検体20例（陽性8例，陰性12例）の2人での鏡検によるHER2 FISHとの比較は20例全てにおいて相関がみられた。2人の平均値をTable 5に示す。
4． 標本のデジタル化NanoZoomerにてデジタル化したスライド標本は，シグナルは低倍率においても容易に観察することができた（Figure 10）。マウスホイール操作で，層を切り替えるなどフォーカスを変えて観察することで，蛍光顕微鏡によるFISH法と同様に評価することができた。2人での鏡検によるHER2 FISHとの比較も相関がみられた。
シグナルは低倍率においても容易に観察可能であった。
現在，当院ではHER2 FISHを判定するために蛍光観察を2～4人で行っている。蛍光観察において，境界域（equivocal）や腫瘍内不均一性（heterogeneity）のような判定困難な症例の場合は観察に長時間を要する。American Society of Clinical Oncology（ASCO）/College of American Pathologists（CAP）ガイドラインでも，腫瘍内不均一性がある場合は報告書に記載することを勧めていることからも複数個所の計測が必要となる。Heterogeneous amplificationには，単純なパターン，複雑なパターンがあり，HER2/CEP17比が2.0以上の領域と2.0未満の領域が隣接するもの，増幅細胞と非増幅細胞が混在して領域を分けられないものがある15)。また，Hofmannら16)は，胃癌は，乳癌に比べ腫瘍内不均一性の割合が高いと報告しており，このような症例では，判定に要する時間が大幅に延長することとなる。当院においてFISH画像を取得する際には，標本全体に焦点があった画像を構築するため，まず焦点面をZ軸方向のスタック画像として5～10枚取得し，それを再構成し1枚にする場合が大多数を占める。このような場合，励起光の照射時間は長くなり蛍光の褪色が進みシグナルの確認がさらに困難になる。そこで，株式会社常光のヒストラHER2 FISHキットを用いてHER2 FISH施行後CISH法による可視化を検討した。
今回の検討では，Rhodamineに対する染色は，二次抗体はペルオキシダーゼ標識であるHistofine Simple Stain MAX-PO（M）を用いAEC発色することを優先させたが，モノクローナル抗体のため反応は弱くシグナルは比較的小さいものであった。そこで，2009年，Takeuchiら17)が開発した高感度法であるiAEP®法（intercalated antibody-enhanced polymer）を試みたが，シグナルの大きさは変わらず，非特異反応が強かったため実用的ではないと判断した。
それでも，シグナルは比較的小さいものの，FISH標本と可視化後とで類似した色調（HER2は赤色）となる試薬の最適な組み合わせを導き出すことができた。ただし，BCIP/NBTはきわめて短い時間で発色するため，反応停止のタイミングには留意すべきである。染色時間が長い場合には，青色が全体的にかぶり，AEC発色がくすんだ色になる場合も想定される。
今回，臨床検体を用いた検討において，約1～3年前にFISH法を施行し，凍結保存していた過去の切片では可視化が可能であることが証明された。当院でのHER2 FISH導入が，2020年であったことから，3年以上前の検体での検討は行うことができなかったが，蛍光顕微鏡で観察が可能なFISH法検体であれば，過去検体であっても可視化は可能ではないかと考えられる。
当院では，株式会社常光の「ヒストラHER2 FISHキット」を使用しているため，今回は同キットを用いてFISH法を実施した後の可視化のみ検討を行った。そこで条件設定後，Abbott社の「パスビジョンHER2 DNAプローブキット」を用いて試してみたところ，可視化することができた（Figure 11）。Abbott社のCEP17DNAプローブは蛍光色素Spectrum GreenでFITCの類似蛍光色素である分子式を持っているため，可視化は可能であったとの報告もある4),5)。また，LSI HER2/neu DNAプローブの蛍光色素はSpectrum Orangeで，励起波長や蛍光波長がRhodamineに類似した蛍光色素であるため，可視化が可能になったと考えられる。
a. FISH法とb. 可視化の両者は類似した染色性を呈した。
本検討における方法を用いれば，安価にて可視化が可能となり，複数人での鏡検も容易となる。また，−20℃でのスライドガラスの保存場所の問題も解決される。蛍光下で再鏡検する機会は，学会発表に用いる写真の再撮影時など限られた場面のみであるが，判定基準のコンセンサスも強く求められている現在，複数人による観察が可能であるため判定結果のばらつきも少なく，より確実性の高い指標となると考える。一方，CISH法は，蛍光色素の代わりにDABやBCIP/NBT，ニューフクシンなどで染色体シグナルを可視化する方法で，これまでもジゴキシゲニン標識プローブとアルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を用いた具体的な検討1)～6)，さらにFISH法とCISH法の相関性なども検討報告されている7)～9)。また，異なるハプテン標識をSISH法10)～12)とCISH法により可視化させるDISH法13)もあるが，非常に高価であり導入も難しい。加えて，DISH法はFISH法との有意な相関もあるものの22%で乖離がみられたという報告もある14)。今回考案したCISH法では，比較的低倍率でもシグナルの確認が容易なものもみられ，浸潤癌の観察すべき部分が特定しやすく，一般の光学顕微鏡を使用できることから，広い範囲の施設でも観察することができる。また，形態学的な観察が容易であることから，腫瘍細胞など目的とする細胞の局在とシグナルを同時に観察でき，解析の質の向上などに役立つと思われる。この方法は，転座など融合遺伝子の検出は無理であるが，PD-L1/Ch9やMDM2/Ch12，C-MYC/Ch8，EGFR/Ch7，MET/Ch7のように増幅の有無を確認する場合も同様に有効である。さらに，標本のデジタル化をすることで臨床医へのデータの提供も可能になり，コンサルテーションや症例カンファレンスにも活用できるほか，内部精度管理や教育においても役立つことから有益であると考える。
今回の検討により，HER2 FISH標本における可視化が可能であることが証明された。可視化をすることで，保管場所や蛍光顕微鏡下での褪色などの問題点は軽減され，標本のデジタル化を含めた臨床医への提供，精度管理にも応用でき，有用性は高いものと考える。
本研究は，静岡済生会総合病院の倫理・コンプライアンス委員会の承認を得て行った（承認番号No. 4-2-01）。
本論文の要旨の一部は，第72回日本医学検査学会（2023年）において発表した。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
本研究にあたり，可視化スライド標本をデジタル化するためNanoZoomerへの取り込みなどご協力を頂いた株式会社パソネット様に深謝致します。
