Analysis of 1p/19q co-deletion using a semi-automated chromogenic in situ hybridization method compared with fluorescence in situ hybridization

Abstract

現在，乏突起膠腫の診断において1pおよび19qの共欠失の有無は必須の評価項目とされている。この共欠失は通常FISH法によって検索されているが，作業手順が煩雑で，かつ標本を長期保存することが困難であるという問題がある。そこで光学顕微鏡で観察可能なCISH法を半自動化するための基礎検討を行った。対象としてFISH法により1p/19q共欠失解析が既に行われた20例を用いて，semi-automated CISH（saCISH）法を実施した。この方法では前処理を自動免疫染色装置で行い，標識プローブをハイブリダイズさせた後，再び自動免疫染色装置により標識プローブに対する染色を行い，欠失する染色体を赤色，対照となる染色体を茶色で発色させて可視化した。作製した標本において各シグナルをカウントし，比率を算出した。saCISH法とFISH法の判定結果と比較したところ，全例で一致が確認された。各比率から求めた相関係数はR = 0.95，0.92であった。saCISH法はFISH法と比較すると作業時間が約100分から35分へ短縮するとともに標本作製の前処理を自動化することで煩雑さを改善した。しかし，saCISH法ではシグナルが重なると赤色シグナルが茶色にみえること，非特異的な色素沈着によるシグナルカウントへの影響などの問題が示された。従って，標識プローブの発色方法の改善が必要であると考えられた。

Translated Abstract

The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System explicitly describes the importance of noting 1p and 19q co-deletion status in the pathological diagnosis of oligodendrogliomas. Although 1p/19q co-deletion can be detected using fluorescence in situ hybridization (FISH), this approach has complex sample preparation requirements, and there are challenges in long-term FISH sample storage. In the present study, we therefore developed a semi-automated chromogenic in situ hybridization (saCISH) method, which can be observed under an optical microscope. We used a sample set of 20 cases in which 1p/19q co-deletion analysis had already been performed using FISH. For the saCISH method, we first automated the pre-treatment process using an immunostainer; this was followed by the hybridization of labeled probes. Subsequently, automated immunostaining of the labeled probes was conducted, with missing chromosomes colored in red and reference chromosomes colored in brown. In the prepared samples, we then counted each signal and calculated the ratios of 1p/1q and 19q/19p. The saCISH method had a reduced handling time compared with FISH, from approximately 100 minutes to 35 minutes, and improved the complexity of specimen preparation by automating the pre-processing steps. However, challenges were identified with the saCISH method, including a tendency for red signals to appear brown when signals overlapped, and the potential interference of non-specific pigment deposition when identifying signals. Further improvements in the color development method for labeled probes are therefore necessary.

I　 背景・目的

2016年に脳腫瘍におけるWorld Health Organization（WHO）分類が改訂された。この改訂では病理形態学的な診断だけでなく，分子生物学的な解析結果を付記することが必要となりパラダイム・シフトが起きた。最新の2021年WHO分類でも分子生物学的な解析の必要性は増し，脳腫瘍の病理診断に必須となっている。この分子生物学的な解析対象の1つに1番染色体短腕（1p）と19番染色体長腕（19q）の共欠失がある。この共欠失の解析は一般にfluorescence in situ hybridization（FISH）法により行われているが，蛍光を用いるため蛍光顕微鏡が必要となる。また，解析に使用したFISH標本は長期にわたって保管することができない。さらに，作業は手順が煩雑で，かつ解析担当者の技量に依存するため，人員確保や検査・解析の標準化においても課題がある。

そこで，病理部門で使用されている汎用性の高い自動免疫染色装置を用いて，前処理および発色工程を半自動化したchromogenic in situ hybridization（CISH）法（semi-automated CISH; saCISH）の基礎検討を行った。

II　 方法

対象として，2016年から2022年までに乏突起膠腫の診断を確定するため，あるいはそれを除外するためにFISH法により1p/19q共欠失解析が行われ，共欠失ありと判定された10例，共欠失なしと判定された10例，合わせて20例の神経膠腫を用いて，saCISH法における解析結果を比較・検討した。判定はFISH，saCISHそれぞれ蛍光・光学顕微鏡BX41（Olympus）を用いて行った。いずれも油浸対物100倍で標本の観察を行い，重なりのない核のシグナルをカウントし，1p/1qおよび19q/19pの比率を算出した。欠失とする判定基準は0.8未満とした¹⁾。また，両方法の前処理，ハイブリダイゼーション，ハイブリダイゼーション後の作業手順についても比較・検討した。

なお，本研究は，熊本大学生命倫理に関する倫理委員会にて承認された（倫理第2645号）。

1． FISH法

FISH法はホルマリン固定パラフィン包埋（formalin fixed paraffin embedded; FFPE）検体を4 μmで薄切し，パラフィンプレトリートメントキット（Abbott）の作業手順に従って前処理を行った。簡単に述べると，脱パラフィン後，室温にて0.2 mol/L塩酸による前処理を行った。その後，37℃にて0.5 g/L Vysis Proteaseを用いて酵素処理を行った。プローブはVysis LSI 1p36/LSI 1q25 and LSI 19q13/19p13 Dual-Color Probe Sets（Abbott）を各10 μL添加し，ハイブリダイゼーションはThermoBrite（Leica Biosystems）を用いて一晩行った。ハイブリダイゼーション後，手順に従った洗浄を行い，4',6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）（Abbott）を10 μL添加し，核を染色した。標本は蛍光にて観察を行った。

2． saCISH法

saCISH法はFFPE検体を4 μmで薄切し，自動免疫染色装置BOND-III（Leica Biosystems）を用いて，熱処理・酵素処理を行った。その後，スライドを風乾し，digoxigenin（DIG）/dinitrophenyl（DNP）標識されたZytoDot 2C Glioma 1p/19q Probe Set（ZytoVision GmbH）を用手法にて各10 μL添加し，ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションの反応時間はFISH法と同様にThermoBriteを用いて一晩行った。ハイブリダイゼーション後洗浄はBOND-IIIを用いて，BOND FISH Kit（Leica Biosystems）の専用プロトコルを使用した。シグナル検出は，DIG/DNP標識プローブに対する2重免疫染色にて行った。抗体は抗DIG/DNP抗体（ZytoVision GmbH）をBOND Primary Antibody Diluent（Leica Biosystems）を用いて64倍希釈して使用し，10分間反応させた。検出キットはChromoPlex 1 Dual Detection（Leica Biosystems）のキット専用プロトコルを使用し，1pおよび19qを赤色，1qおよび19pを茶色に発色させた。核はヘマトキシリンで染色し，カウントする核を選別した。標本は光顕的に観察した。

3． 統計解析

FISH法とsaCISH法による判定結果を比較するための統計解析は，GraphPad Prism 9.5.1（GraphPad Software）を用いて，対応する2標本における両側t検定を行い，有意水準は0.05と設定した。回帰直線および相関係数も同様に，作成した散布図よりGraphPad Prismを用いて求めた。

III　 成績・結果

1． FISH法とsaCISH法との結果の比較

今回のsaCISH法では，FISH標本と同様にシグナルを明瞭に観察することが可能で（Figure 1）。共欠失判定結果は全例で一致していた（Table 1）。FISH法とsaCISH法で算出した比率を比較するため，欠失あり（deletion; del）と欠失なし（retained copy number; ret）に分けて統計解析を行った。その結果，1p/1q del，1p/1p ret，19q/19p del，19q/19p retはそれぞれp = 0.1021，0.6605，0.7010，0.3434となり，有意差は認められなかった（Figure 2）。さらに，FISH法とsaCISH法で得られたシグナルの比率から散布図を作成し，回帰直線と相関係数を求めた結果，1p/1q，19q/19pともに高い相関を示していた（R = 0.945727, 0.920706）（Figure 3）。

Figure 1　 Signals detected in the nuclei by saCISH and FISH method

The saCISH method indicated that red signals represented 19q, and brown signals represented 19p (A). In the case of 1p/19q co-deletion (A, B), (×1,000, oil immersion), there was a potential error where the red dye was mistakenly identified as brown (C, closed arrowhead). In contrast, FISH showed overlapping signals turning into yellow (D). Additionally, the saCISH method tended to exhibit tiny non-specific signals (C, open arrow).

Abbreviations: saCISH (semi-automated chromogenic in situ hybridization), FISH (fluorescence in situ hybridization)

Table 1　Results of 1p/1q and 19q/19p ratios, and 1p/19q status in 20 brain tumor cases

Case No.	FISH			saCISH
	1p/1q	19q/19p	Status	1p/1q	19q/19p	Status
1	0.667	0.705	DEL	0.655	0.637	DEL
2	1.014	1.058	RET	1.009	0.990	RET
3	0.930	1.092	RET	0.993	0.893	RET
4	0.955	0.955	RET	1.000	1.008	RET
5	0.598	0.571	DEL	0.577	0.625	DEL
6	0.637	0.588	DEL	0.623	0.577	DEL
7	1.041	1.015	RET	0.994	0.932	RET
8	1.131	1.019	RET	0.951	0.942	RET
9	0.607	0.585	DEL	0.595	0.614	DEL
10	0.620	0.607	DEL	0.597	0.649	DEL
11	1.000	0.981	RET	1.013	0.957	RET
12	0.735	0.710	DEL	0.745	0.734	DEL
13	1.360	0.768	RET	1.486	0.735	RET
14	0.968	0.980	RET	1.053	0.895	RET
15	0.539	0.554	DEL	0.554	0.526	DEL
16	0.875	0.935	RET	0.806	0.904	RET
17	0.611	0.621	DEL	0.585	0.611	DEL
18	0.749	0.576	DEL	0.581	0.609	DEL
19	1.161	0.827	RET	0.979	1.016	RET
20	0.624	0.577	DEL	0.578	0.594	DEL

Abbreviations: FISH (fluorescence in situ hybridization), saCISH (semi-automated chromogenic in situ hybridization), DEL (co-deletion), RET (retained copy number)

Figure 2　 Comparison of ratios in saCISH and FISH method

No statistically significant difference was observed between the calculated ratios of saCISH and FISH using a two-tailed paired t-test (with a significance level of 0.05)

Abbreviations: saCISH (semi-automated chromogenic in situ hybridization), FISH (fluorescence in situ hybridization), del (deletion), ret (retained copy number)

Figure 3　 The scatterplot of saCISH and FISH method

The vertical axis was for saCISH ratio, and the horizontal for FISH ratio. The left panel (A) showed the ratio of 1p/1q, and the right panel (B) showed the ratio of 19q/19p. The regression lines and the correlation coefficients (R) on the scatterplots were displayed.

Abbreviations: saCISH (semi-automated chromogenic in situ hybridization), FISH (fluorescence in situ hybridization)

2． FISH法とsaCISH法の反応時間，作業時間

FISH法，saCISH法ともに，ハイブリダイゼーションにかかる反応時間に差は無かった。しかし，作業時間はFISH法では約100分間を要するが，saCISH法では35分間と約1/3の時間に短縮した（Table 2）。

Table 2　Protocols of saCISH and FISH method

			reagent	reaction time (min)	handling time (min)
saCISH	1	Deparafinization	BOND-lll protocol, BOND Dewax Solution	80	5
	2	Pretreatment	BOND-lll protocol, Epitope Retrieval Solution
	3	Protease	BOND-lll protocol, BOND Enzyme
	4	Hybridization	ZytoDot 2C Glioma SPEC 1p36/1q25, SPEC 19q13/19p13 Probe	overnight	20
	5	Post-wash	BOND-lll protocol, BOND FISH Kit	30	5
	6	Detection	BOND-lll protocol, Leica ChromoPlex 1 Dual Detection, anti-DIG/DNP antibody	85	5
					35
FISH	1	Deparafinization	Xylene, pure ethanol	40	25
	2	Pretreatment	HCl, Vysis Pretreatment Solution	60	15
	3	Protease	Vysis Protease	30–60	20
	4	Hybridization	Vysis LSI 1p36/LSI 1q25, LSI 19q13/LSI 19p13 dual color Probe	overnight	20
	5	Post-wash	SSC, NP-40	15	15
	6	Counterstain	DAPI	5	5
					100

Abbreviations: saCISH (semi-automated chromogenic in situ hybridization), FISH (fluorescence in situ hybridization)

IV　 考察

1p/19q共欠失は2016年の脳腫瘍WHO分類第4版（改訂版）で新たに採用された分子生物学的な指標で，最新である2021年に出版されたWHO分類第5版にも反映されている。神経膠腫における1p/19q共欠失の存在は古典的な乏突起膠腫の組織像とよく相関するため診断的価値があり，かつ予後が良好で治療反応性が高いことを示唆する^2),3)。そのため，乏突起膠腫あるいはこれと鑑別を要する神経膠腫の病理診断では，1p/19q共欠失解析が行われる。実際，2017年に行われた日本脳外科学会の調査では95.2%の施設が成人神経膠腫の診療に1p/19qの解析が必要であると回答している。しかし，自施設でFISH法により解析が実施可能であると答えた施設は20.5%にとどまっていた⁴⁾。自施設でのFISH法導入が難しい理由として，①標本作製作業が煩雑なこと，②蛍光顕微鏡を用いること，③費用が高いこと，④作業手順の標準化が容易でないことなどが考えられる⁵⁾。

saCISH法における長所の1つとして，シグナルの比率を光学顕微鏡下で観察可能とすることが挙げられる。特に通常の免疫組織化学染色標本と同様に組織構築や細胞像を観察しながらシグナルをカウントすることが可能である点は大きなメリットであるといえる。また，シグナルは退色しにくいため，標本も長期間にわたって保管可能である⁵⁾。我々の検討では一致率は100%であったが，Lassら⁶⁾の検討では，1p/19q共欠失解析におけるFISH法とCISH法の一致率は93%であった。彼らは不一致の要因を検討し，CISH法はFISH法に比べ，①マイクロサテライト分析による共欠失解析との一致率が特に高く，②同時に実施した免疫組織化学染色標本と合わせて観察して比較することが容易で，解析対象領域を正確に絞り込めるという点において有用性があると述べている。

ただし，今回の検討ではsaCISH法の課題も浮き彫りとなった。すなわち，シグナル検出に使用した色素が茶色と赤色であったため，両者が重なると茶色にみえることが明らかとなった（Figure 1C矢頭）。田中ら⁷⁾は，CISH法の一種であるdual color in situ hybridization（DISH）法を用いた乳癌のHER2遺伝子増幅の検討の結果から，増幅したシグナルの重積がカウントの結果に影響する可能性を指摘している。そこで我々はsaCISH法で算出した比率をFISH法と比較して検討したが，統計学的な有意差は認められなかった。この結果はシグナルが重なることで生じるカウントの誤差は，算出された比率にほとんど影響しないことを示しているが，実施に当たっては留意する必要がある。

今回のsaCISH法による検討では極めて微小な粒子の沈着がみられる症例があることが確認された（Figure 1C矢印）。田中ら⁷⁾は乳癌に対するDISH法においてこれと同様の粒子状の非特異的な反応が背景にみられたことを報告している。本来のシグナルと比較すると大きさや沈着している場所などが明らかに異なるため，これら微小な粒子と真のシグナルを判別することは容易であると考えられるが，粒子が凝集した場合は真のシグナルと誤認される可能性も否定できないことから，粒子の沈着を防ぐ工夫が必要であると考えられた。

今回の検討では，反応時間はFISH法，saCISH法ともにオーバーナイトでハイブリダイゼーションを行うため大差が生じなかった。しかし，操作を行う作業時間については，saCISH法はFISH法の約100分間から35分間へと大幅に短縮していた。さらにsaCISH法では既存の自動免疫染色装置を用いるため，専用の機器の新規導入や専用試薬が不要で，導入コスト，新たな試薬の調整や精度管理手順の策定などの負担が少ない，FISHで必要とされるスキル習得が不要で，一般的な自動免疫染色装置の使用方法に精通していれば実施可能である，などのメリットも期待できる。

V　 結語

saCISH法による1p/19q共欠失解析は，FISH法と比較して作業工程の簡素化が可能で，検査室の業務負担を軽減しながら高い精度で実施可能だが，非特異的な反応を防いでシグナルを明瞭に検出するための改善が必要である。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献

• 1)   Van  den Bent MJ et al.: Chromosomal anomalies in oligodendroglial tumors are correlated with clinical features. Cancer, 2003; 97: 1276–1284.
• 2)  WHO Classification of Tumours Editorial Board: WHO classification of tumours. Central Nervous System Tumours, 5th ed., IARC Press, Lyon, 2021.
• 3)  小森 隆司，廣瀬 隆則（編）：腫瘍病理鑑別診断アトラス脳腫瘍，第1版，文光堂，東京，2017.
• 4)   橋本  直哉，他：WHO 2016脳腫瘍分類と分子診断―国内の現状と展望―．脳外誌，2019; 28: 674–685.
• 5)   Arnould  L et al.: Agreement between chromogenic in situ hybridisation (CISH) and FISH in the determination of HER2 status in breast cancer. Br J Cancer, 2003; 88: 1587–1591.
• 6)   Lass  U et al.: Chromogenic in situ hybridization is a reliable alternative to fluorescence in situ hybridization for diagnostic testing of 1p and 19q loss in paraffin-embedded gliomas. Brain Pathology, 2013; 23: 311–318.
• 7)   田中  京子，他：乳癌におけるDual Color in situ Hybridization法によるHER2遺伝子増幅の検出―FISH法との比較―．医学検査，2014; 63: 453–459.