RNA精製の必要がないAmpdirectTM 2019-nCoV検出キットの基礎的性能評価ならびにサイクル閾値の測定者間差についての検討

伊達 卓司; 戸田 宏文; 山出 健二; 上野 稔; 吉冨 一恵; 吉田 耕一郎; 上硲 俊法

doi:10.14932/jamt.24-15

Abstract

本研究はRNA精製の必要がないAmpdirect^TM 2019-nCoV検出キット（株式会社島津製作所）の基本性能評価ならびにサイクル閾値の測定者間差について検討を行った。併行精度試験ならびに室内再現精度試験はEDX SARS-CoV-2 Standard（バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社）を2濃度に調整した試料を測定し，サイクル閾値の変動係数（coefficient of variation; CV）が2%以下の安定した結果であった。検出限界試験はEDX SARS-CoV-2 Standardを6濃度に調整した試料を測定し，N1遺伝子が250 copies/mL，N2遺伝子が750 copies/mLと，COVID-19の検査室診断に十分な検出限界であった。2022年11月から2023年2月に測定された臨床検体を用いた国立感染症研究所の病原体検出マニュアルに準拠した方法との比較では，全体一致率は96.3%（104検体/108検体）であった。不一致の4検体は，サイクル閾値が36以上の低ウイルス量の検体であった。サイクル閾値の測定者間差の検討では，サイクル閾値のCVは各々0.79～1.33%に収束しているものの，測定者間のサイクル閾値は多重比較検定により，有意差が認められた（p < 0.05）。本試薬は良好な基本性能を有し，SARS-CoV-2の検査室診断のツールとして臨床検査室での幅広い利用が期待できると考えられる一方で，サイクル閾値の定量的な評価には，測定者間差を考慮する必要があると考えられた。

Translated Abstract

This study evaluated the basic performance of the Ampdirect^TM 2019-nCoV detection kit (Shimadzu Corporation), which does not require RNA purification and inter-measurer reproducibility of cycle thresholds. Within-run imprecision (repeatability) and within-laboratory imprecision (total precision) tests were performed on samples of EDX SARS-CoV-2 Standard (Bio-Rad Laboratories, Inc.) adjusted to two concentrations. The Coefficient of Variation (CV) of the cycle thresholds was stable at less than 2%. For the limit of detection test, samples of EDX SARS-CoV-2 Standard adjusted to 6 concentrations were measured. The limit of detection was 250 copies/mL for the N1 gene and 750 copies/mL for the N2 gene, which were sufficient for laboratory diagnosis of COVID-19. Comparison with the method according to the pathogen detection manual of the National Institute of Infectious Diseases using clinical samples measured from November 2022 to February 2023 showed an overall agreement rate of 96.3% (104/108 samples). Four discrepancy samples had low viral loads with cycle thresholds of 36 or higher. Inter-measurer reproducibility of cycle thresholds showed that the CV of cycle thresholds converged between 0.79% and 1.33%, respectively. However, significant differences in cycle thresholds between measurers were found by multiple comparison test (p < 0.05). This reagent has good basic performance and is expected to be widely used in clinical laboratories as a tool for laboratory diagnosis of SARS-CoV-2. On the other hand, it was necessary to consider inter- measurer reproducibility for quantitative evaluation of the cycle threshold.

I　はじめに

新型コロナウイルス感染症（coronavirus disease 2019; COVID-19）は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; SARS-CoV-2）を病原体として発症することが知られている。COVID-19の臨床検査には核酸増幅検査，抗原検査，および抗体検査があるが，このうち核酸増幅検査はSARS-CoV-2検出のゴールドスタンダードとされている¹⁾。核酸増幅検査は，RNAの抽出・精製，ターゲット遺伝子の増幅，増幅産物の分離・検出など工程が多く，その操作は煩雑であった。そのため，用手法で行われる核酸増幅検査は数時間を費やし，結果の正確度および精密度に測定者の技量が大きく影響する可能性がある^1),2)。

Ampdirect^TM 2019-nCoV検出キット（株式会社島津製作所）は，生体試料に含まれる核酸増幅反応を阻害する物質を抑制する技術を用いることでRNAを精製することなく直接reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）が可能な試薬である³⁾。そのため操作工程が少なく簡便であり，測定者の技量による測定誤差を最小限に留められる可能性がある。今回，我々はAmpdirect^TM 2019-nCoV検出キットの基本性能評価，国立感染症研究所の病原体検出マニュアルに準拠した方法（以下，感染研法）⁴⁾との成績比較および臨床検査担当者を対象に，結果の測定者間差の有無について検討したので報告する。

II　対象および方法

1．試料の調製

基本性能評価（併行精度試験，室内再現精度試験および検出限界試験）はEDX SARS-CoV-2 Standard（バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社）を適宜，調製して使用した。

併行精度試験ならびに室内再現精度試験に用いた試料は，200,000 copies/mLのEDX SARS-CoV-2 StandardとEDX SARS-CoV-2 Standardを0.9%滅菌生理食塩水（大塚製薬株式会社）で5,000 copies/mLに調整した2濃度を用いた。

検出限界試験に用いた試料は，EDX SARS-CoV-2 Standard（200,000 copies/mL）を10 Mリン酸Buffer（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）で2,000 copies/mL，1,000 copies/mL，750 copies/mL，500 copies/mL，250 copies/mLおよび100 copies/mLに調整した6濃度を用いた。

臨床検体を用いた感染研法との成績比較は2022年11月から2023年2月に測定された日常臨床検査終了後の陽性検体35検体（唾液；16検体，鼻咽頭ぬぐい液；19検体），ならびに陰性検体73検体（唾液；41検体，鼻咽頭ぬぐい液；32検体）を用いた。唾液はダルベッコリン酸緩衝液生理食塩水（シグマアルドリッチ合同会社）で4倍希釈し，3,000 gで60秒遠心した上清を用いた。鼻咽頭ぬぐい液は滅菌スワブで採取した鼻咽頭擦過物を1 mLの0.9%滅菌生理食塩水に懸濁した懸濁液を鼻咽頭ぬぐい液として用いた。RNAの抽出・精製はQIAamp Viral RNA Mini kit（キアゲン株式会社）を用いた。

測定者間差の検討は日常臨床検査終了後の唾液残余検体をN1遺伝子のサイクル閾値が約33になるように，0.9%滅菌生理食塩水にて調整した試料を用いた。

なお，室内再現精度試験ならびに測定者間差の検討に用いた試料は調整後，試験日まで−80℃で凍結保存した。

2． PCR

Ampdirect^TM 2019-nCoV検出キットは添付文書に従い実施した。すなわち，RNAの抽出は試料5 μLに2019-nCoV Sample Treatment Reagentを5 μL加え，90℃で300秒間サーマルサイクラーにて加熱した。PCR反応液の調製は1試料あたり2019-nCov Reagent Aを6.5 μL，2019-nCoV Reagent Bを6.5 μL，2019-nCoV Reagent Cを2.0 μLを混和した。RT-PCRはRNA抽出液10 μLにPCR反応液15 μLを加えた25 μLを用いた。RT-PCR反応は逆転写が42℃で600秒，前加熱が95℃で60秒，1 Step amplificationは95℃で5秒，60℃で30秒を45サイクルである。内部コントロール（internal control; IC），N1遺伝子およびN2遺伝子の検出には，それぞれr-phycoerythrin cytosine 5（Cy5；励起：650 nm，発光：670 nm），fluorescein（FAM；励起：495 nm，発光：520 nm），およびcarboxy-x-rhodamine（ROX；励起：575 nm，発光：600 nm）の蛍光波長を用いた。判定はICが40サイクル以下で蛍光強度の増加が認められ，N1遺伝子ならびにN2遺伝子の両方もしくはいずれかの遺伝子が40サイクル以下で蛍光強度の増加が認められた場合を陽性とした。ただし，ICの蛍光強度の増加がなくとも，N1遺伝子とN2遺伝子の両方にて蛍光強度の増加が認められた場合には陽性と判定した。リアルタイムPCR装置はcobas z480 system（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いた。

感染研法はTaKaRa Primer/ProbeN2（2019-nCoV）（タカラバイオ株式会社）を用いて測定した。PCR反応液の調整は1試料あたりOne Step Prime Script III RT-qPCR Mix（2×）を10 μL，5×NID_2019-nCOV_N_Primer/Probe mixを4 μL，RNase Free H₂Oを1 μLを混和した。調整したPCR反応液15 μLに試料5 μLを加え，測定した。RT-PCRの反応は逆転写が52℃で300秒，熱変性が95℃で10秒，PCRが95℃で5秒，60℃で30秒を45サイクルである。N2遺伝子の検出にはFAMの蛍光波長を用いた。判定は40サイクル以下で蛍光強度の増加が認められた場合を陽性とした。リアルタイムPCR装置はcobas z480 systemを用いた。

3．併行精度試験

併行精度試験はEDX SARS-CoV-2 Standardを調整した試料を15回同時に測定し，N1遺伝子ならびにN2遺伝子のサイクル閾値の平均値，標準偏差（standard deviation; SD），および変動係数（coefficient of variation; CV）を評価した。

4．室内再現精度試験

室内再現精度試験はEDX SARS-CoV-2 Standardを調整した試料を7日間測定し，N1遺伝子ならびにN2遺伝子のサイクル閾値の平均値，SD，およびCVを評価した。

5．検出限界試験

検出限界試験はEDX SARS-CoV-2 Standardを調整した試料を3回同時に測定し，N1遺伝子ならびにN2遺伝子が3回とも検出された最小の濃度を検出限界とした。

6．感染研法との比較⁴⁾

感染研法との比較は日常臨床検査で使用しているAmpdirect^TM 2019-nCoV検出キットの結果について，陽性一致率，陰性一致率および全体一致率を比較した。

7．測定者間差の検討

測定者間差の検討は日常臨床検査業務を担う臨床検査技師7名を対象とした。測定は7名の担当者が，サイクル閾値調整済唾液検体から20個の測定用試料を作製し，3重測定した。測定結果のN1遺伝子ならびにN2遺伝子のサイクル閾値の平均値，SD，およびCVを評価した。また，測定者間差の統計学的評価には多重比較検定を行った。

8．統計学的解析

統計学的解析はExcel 2016（マイクロソフト社）とStatFlex ver. 7（株式会社アーテック）を用いた。多重比較検定はScheffe法を用い，有意差の判定基準はp < 0.05とした。

III　結果

1．併行精度試験

200,000 copies/mLの試料におけるN1遺伝子およびN2遺伝子のサイクル閾値の平均値は28.85および28.35，SDは0.05および0.08，CVは0.17%および0.29%であった。5,000 copies/mLの試料におけるN1遺伝子およびN2遺伝子のサイクル閾値の平均値は34.24および33.95，SDは0.27および0.20，CVは0.78%および0.58%であった（Table 1）。

Table 1　Comparison of cycle thresholds for within-run imprecision (repeatability) and within-laboratory imprecision (total precision) with artificial RNA solutions using the Ampdirect^TM 2019-nCoV detection kit

	Within-run imprecision (repeatability)				Within-laboratory imprecision (total precision)
	200,000 copies/mL		5,000 copies/mL		200,000 copies/mL		5,000 copies/mL
	N1 gene	N2 gene	N1 gene	N2 gene	N1 gene	N2 gene	N1 gene	N2 gene
Mean of Ct values	28.85	28.35	34.24	33.95	28.98	28.60	34.86	34.54
Max. of Ct values	28.96	28.52	34.82	34.29	29.20	28.86	35.27	35.44
Min. of Ct values	28.77	28.22	33.76	33.61	28.77	28.22	34.22	34.07
SD	0.05	0.08	0.27	0.20	0.15	0.20	0.43	0.46
CV（%）	0.17	0.29	0.78	0.58	0.51	0.71	1.23	1.33

Ct, cycle threshold; Max., maximum; Min., minimum; SD, standard deviation; CV, coefficient of variation

2．室内再現精度試験

200,000 copies/mLの試料におけるN1遺伝子およびN2遺伝子のサイクル閾値の平均値は28.98および28.60，SDは0.15および0.20，CVは0.51%および0.71%であった。5,000 copies/mLの試料におけるN1遺伝子およびN2遺伝子のサイクル閾値の平均値は34.86および34.54，SDは0.43および0.46，CVは1.23%および1.33%であった（Table 1）。

3．検出限界試験

検出限界試験はN1遺伝子が250 copies/mL，N2遺伝子が750 copies/mLであった（Table 2）。

Table 2　Limit of detection testing with artificial RNA solutions using the Ampdirect^TM 2019-nCoV detection kit

	2,000 copies/mL		1,000 copies/mL		750 copies/mL		500 copies/mL		250 copies/mL		100 copies/mL
	N1 gene	N2 gene	N1 gene	N2 gene	N1 gene	N2 gene	N1 gene	N2 gene	N1 gene	N1 gene	N1 gene	N2 gene
Ct values	35.42	34.34	35.92	35.78	36.26	36.03	37.37	N.D.	37.71	N.D.	39.09	N.D.
	34.37	33.99	35.61	35.27	36.28	35.90	36.65	35.78	37.53	N.D.	N.D.	N.D.
	35.48	35.18	37.26	36.31	37.00	37.06	36.76	35.81	38.46	36.85	N.D.	N.D.

N.D., not detected; Ct, cycle threshold

4．感染研法との比較

感染研法との比較は陽性一致率が89.7%（35/39検体），陰性一致率が94.5%（69/73検体），全体一致率が96.3%（104/108検体）であった（Table 3）。

Table 3　Comparison of the Ampdirect^TM 2019-nCoV detection kit with the National Institute of Infectious Diseases (NIID) Pathogen Detection Manual using clinical samples

		NIID		total
		positive	negative	total
Ampdirect^TM 2019-nCoV detection kit	positive	35	0	35
Ampdirect^TM 2019-nCoV detection kit	negative	4*	69	73
total		39	69	108

*The cycle thresholds for the four samples that were negative for the Ampdirect^TM 2019-nCoV detection kit and positive for the NIID were all above 36.

5．測定者間差の検討

測定者7名のN1遺伝子およびN2遺伝子のサイクル閾値の平均値は32.90～33.28および32.53～32.97，SDは0.26～0.42および0.30～0.43，CVは0.79～1.26%および0.93～1.33%であった（Figure 1）。

Figure 1　 Distribution of cycle thresholds among measurers using Ampdirect^TM 2019-nCoV detection kit

Ct, cycle threshold; Max., maximum; Min., minimum; SD, standard deviation; CV, coefficient of variation

A: N1 gene

B: N2 gene

*p < 0.05, **p < 0.01

サイクル閾値の測定者間の解析はN1遺伝子が7名中6名，N2遺伝子が7名全員に有意差を認めた。また，N1遺伝子は有意差を認めた測定者間の4箇所がp < 0.05，1箇所がp < 0.01，N2遺伝子は有意差を認めた測定者間の6箇所がp < 0.05，2箇所がp < 0.01であった（Figure 1）。

IV　考察

本研究ではAmpdirect^TM 2019-nCoV検出キットの基本性能評価ならびに測定者間差について検討した。Ampdirect^TM 2019-nCoV検出キットの併行精度試験および室内再現精度試験は，高RNA濃度ならびに低RNA濃度に調製した人工RNA溶液の2試料において，CVが2%以下の良好な成績であった。これは，全自動遺伝子解析装置や用手法によるRNA精製が必要なSARS-CoV-2核酸増幅検査試薬と比較しても同等以上の基本性能であった^5),6)。このことから本試薬は急性期の高ウイルス量の検体や回復期の低ウイルス量の検体においても，安定したサイクル閾値を示すことができると考えられた。

検出限界はN1遺伝子が250 copies/mL，N2遺伝子が750 copies/mLであった。Satoら⁷⁾の報告ではN1遺伝子ならびにN2遺伝子の検出限界がそれぞれ1.0 copies/reaction（200 copies/mL）ならびに4.2 copies/reaction（840 copies/mL）であり，本研究と同様の結果であった。本試薬の検出限界は一般的なCOVID-19患者の鼻腔内のウイルス量より小さく⁸⁾，COVID-19の検査室診断に十分な検出限界を有していると考えられた。

臨床検体を用いた感染研法との比較では全体の一致率が96.3%であった。これはRNA精製を必要とする他のSARS-CoV-2核酸増幅検査試薬における感染研法との一致率と同程度であった⁹⁾。Ampdirect^TM 2019-nCoV検出キット陰性／感染研法陽性となった4検体は，いずれもサイクル閾値が36以上の低ウイルス量の検体であった。感染研法のN2遺伝子の検出限界はEDX SARS-CoV-2 Standardを用いて算出したところ400 copies/mL程度であり（data not shown），Ampdirect^TM 2019-nCoV検出キットの検出限界と同程度であった¹⁰⁾。他方，感染研法は140 μLのサンプルをRNAの抽出・精製に用いて純度の高いRNAを測定しているのに対し⁴⁾，Ampdirect^TM 2019-nCoV検出キットは5 μLのサンプルを熱処理した粗RNAを測定している。結果の不一致が生じた原因は測定に持ち込まれる検体量とRNAの純度の違いが，検出限界付近のウイルスRNAの増幅に影響したと考えられた。SARS-CoV-2検出の核酸増幅検査は，ターゲット遺伝子のプライマー結合領域に生じた変異や欠損のために，ターゲット遺伝子のプライマーがミスマッチを起こし，ターゲット遺伝子の不検出や検出サイクルの遅延を引き起こすことがある¹¹⁾。outbreak.info（https://outbreak.info/）¹²⁾によると相関性試験期間の我々の施設が位置する大阪府内の主要な変異株はBA.5，ならびにBF.5であったが，BA.5.2はUS CDC 2019-nCoV real-time PCRプライマーを用いたCepheid Xpert Xpress SARS-CoV-2 assayにおいて，N2遺伝子の1塩基変異によるN遺伝子の不検出が報告されている¹³⁾。本試薬もアメリカ疾病予防管理センター（Centers for Disease Control and Prevention; CDC）のプライマーを使用していることから¹⁴⁾，感染研法との結果の不一致が生じた原因として，ターゲット遺伝子のプライマー結合領域の変異や欠損によるターゲット遺伝子のプライマーのミスマッチも影響した可能性が考えられた。

測定者間差の検討は核酸増幅検査が急速に普及した本邦において，精度保証の観点から重要な課題の一つである。本邦ではサイクル閾値を感染性の評価に活用する試みが示され，カットオフ値としてサイクル閾値34付近の精度管理が重要になっている^15),16)。Ampdirect^TM 2019-nCoV検出キットは定性試薬ではあるものの，ウイルス量に応じたサイクル閾値を得ることができるため，得られたサイクル閾値を定量的な評価に利用できることが報告されている¹⁷⁾。本研究の結果から，Ampdirect^TM 2019-nCoV検出キットは良好な基本性能を有する核酸増幅検査試薬であるものの，サイクル閾値には測定者間差が認められたことからサイクル閾値を定量的な評価に用いる場合は測定者間差の有無を考慮する必要があると考えられた。測定者間差が認められた原因は，少量の試薬および試料を扱ったことによりサンプリング量に誤差が生じたためと考えられた¹⁸⁾。

V　結語

本研究により，Ampdirect^TM 2019-nCoV検出キットは良好な基本性能を有し，臨床検体の評価においても感染研法と同等の性能が示された。本試薬は操作工程が少なく，簡便でSARS-CoV-2の検査室診断のツールとして臨床検査室での幅広い利用が期待できる。一方，サイクル閾値を定量的な評価に用いる場合は測定者間差を有する場合があることを考慮する必要があると考えられた。

本研究は近畿大学医学部の倫理委員会の承認を得て行った（承認番号：R03-111）。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

謝辞

本検討にご協力頂いた近畿大学病院中央臨床検査部の皆様に深謝いたします。

文献

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