Case Report
Two cases of anti-LW in which DTT treatment ID-DiaCell was useful for confirming false positive reactions with stored anti-CD38 antibody drugs
2025 Volume 74 Issue 1 Pages 232-239
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2025 Volume 74 Issue 1 Pages 232-239
【はじめに】当院では抗CD38抗体薬投与による不規則抗体検査の偽陽性反応の確認として，不規則抗体スクリーニング（以下，SC）赤血球のDTT処理をロット変更毎に実施し，保存している。また，DTT処理赤血球は不規則抗体の化学的性質確認にも有用である。今回，不規則抗体検査において抗LWが疑われ，DTT処理SC赤血球による確認が有用であった2症例を報告する。【症例1】70歳代女性。末梢性T細胞リンパ腫で治療中。B型RhD陽性，SC陰性。1カ月後Hb低下のため，赤血球製剤2単位依頼。SC陽性となり同定検査の結果，抗D様反応がみられた。DTT処理SC赤血球による不規則抗体検査で陰性化し，抗LWと判断した。計6単位の赤血球製剤で輸血副反応は発生しなかった。【症例2】90歳代女性。骨髄異形成症候群。O型RhD陽性，不規則抗体陽性。同定検査で抗D様の反応がみられ，DTT処理SC赤血球による不規則抗体検査で陰性化し，抗LWと判断した。計16単位の赤血球製剤で輸血副反応は発生しなかった。【考察】抗LWは臨床的意義のある抗体ではないが，RhD陽性赤血球との交差適合試験では不適合となる場合が多く，LW抗原がより少ないRhD陰性赤血球の使用が望ましいと考える。DTT処理赤血球による反応性確認は，抗D様自己抗体と抗LWの鑑別に重要である。今回，抗CD38抗体薬投与の偽陽性反応確認用DTT処理赤血球が抗LWの判断に有用であった。
Introduction: At our hospital, we prepare and store dithiothreitol (DTT)-treated irregular antibody screening (SC) blood cells for each lot change as confirmation of false-positive reactions to anti-CD38 antibody drug administration for irregular antibody testing. DTT-treated erythrocytes are useful to confirm the chemical properties of irregular antibodies. Here, we describe two cases in which anti-Landsteiner–Wiener (LW) was suspected in an irregular antibody test, and DTT-treated SC erythrocytes were useful for confirmation. Case 1 is a woman in her 70s who is positive for type B RhD and negative for SC. After 1 month, two red blood cell transfusion units were requested because of low Hb levels. Irregular antibody SC was positive, and the identification test showed an anti-D-like reaction. The irregular antibody SC test with DTT-treated SC erythrocytes was negative and anti-LW. Six red blood cell units were transfused and no adverse reactions occurred. Case 2 is a woman in her 90s with myelodysplastic syndrome who is positive for RhDO and irregular antibodies. The identification test showed an anti-D-like reaction, which was negative in the irregular antibody test with DTT-treated SC erythrocytes, and was anti-LW. Sixteen red blood cell units were transfused and no adverse reactions occurred. Discussion: Anti-LW is not a clinically significant antibody but has cross-match incompatibility. Moreover, RhD-negative erythrocytes with less LW antigen should be used because reactive confirmation by DTT-treated erythrocytes is important for differentiating anti-LW from anti-D-like autoantibodies. DTT-treated erythrocytes used to confirm false-positive reactions to anti-CD38 antibody drugs were useful for detecting anti-LW.
抗CD38抗体薬は現在，ダラツムマブとイサツキシマブが国内で承認されており，多発性骨髄腫を含む造血器悪性腫瘍の腫瘍細胞表面に発現するヒトCD38抗原に結合することで，抗悪性腫瘍効果を発揮するヒト型免疫グロブリンG1κモノクローナル抗体である1),2)。抗CD38抗体薬の問題点としてCD38が赤血球上にも弱発現していることで，輸血検査において間接抗グロブリン試験（以下，IAT）を原理とする不規則抗体検査や交差適合試験で偽陽性反応を呈してしまうことが挙げられる。抗CD38抗体薬投与患者に対して行ったIATの陽性反応が真の陽性なのか偽陽性なのかを確認するためには，赤血球にジチオトレイトール（以下，DTT）処理を行った上での再検査が重要である。当院においては，不規則抗体スクリーニング（以下，SC）赤血球試薬ID-DiaCellのDTT処理を行うことにより，不規則抗体検査偽陽性の確認に用いている。また，当院では多発性骨髄腫患者が多く診療されており，抗CD38抗体薬投与患者への輸血依頼が日常的であるため，SC赤血球試薬Lot変更毎にDTT処理を実施し，処理後のSC赤血球を使用期限まで保存し，抗CD38抗体薬投与患者のSCの偽陽性反応時の再検査に迅速に対応している。偽陽性（陰性）であれば，赤血球製剤の適合性確認はコンピュータクロスマッチを採用している。また，LW式血液型は，LandsteinerとWienerによって発見され，Rh式血液型とは遺伝学的に独立しているが，両者は密接な関係をもっている。LW式血液型においてヒトの抗LWはLW陰性の遺伝子型のヒトが産生するアロ抗体3)，自己免疫性溶血性貧血の温式自己抗体4)，一過性にLW陰性となった人に出現する一過性のアロ抗体5)などの報告がある。抗LWを検出するためには，不規則抗体検査で抗D様の反応パターンを示すこと，臍帯血赤血球との反応性差異，DTT処理赤血球にて感受性を認めることなどがある。今回我々は，抗CD38抗体薬の偽陽性確認試験に用いている保存用DTT処理SC赤血球によって抗LWと確定できた2症例を経験したので報告する。
不規則抗体スクリーニング赤血球：ID-DiaCell（BIO RAD）
DTT：（±）－ジチオトレイトール（和光純薬）
※0.01 mol/L PBS pH 7.3を用いて0.2 mol/L DTT溶液とした
カード：マイクロタイピングシステム（BIO RAD）
洗浄：0.01 mol/L PBS pH 7.3およびID-CellStab（BIO RAD）
細胞保護液：ID-CellStab（BIO RAD）
陰性反応：抗K血清（ORTHO）
陽性反応：抗E血清（ORTHO）
2． 赤血球のDTT処理①ID-DiaCellの1 mLを分取し，遠心機で1,000 G 1分間遠心し，赤血球沈渣とする
②赤血球沈層を0.01 mol/L PBS pH 7.3にて2回洗浄
③赤血球沈層に0.2 mol/L DTTを50 μL加え，37℃，20分でインキュベーション
④処理後の赤血球を0.01 mol/L PBS pH 7.3にて2回，ID-CellStabで2回洗浄
⑤洗浄済み赤血球沈層にID-CellStab 1 mLを加えて再浮遊し，DTT処理赤血球とする
※DTT溶液の調製には，0.01 mol/L PBS pH 7.3を用いた
3． DTT処理赤血球有効性確認Figure 1に当院で実施しているDTT処理赤血球有効性確認方法を示す。DTT処理K抗原陽性SC赤血球と抗K血清を無希釈で反応させた場合2+～3+程度の凝集反応を示すことが多い（カード一番左側）ことから輸血検査で使用している生理食塩液で5倍程度に希釈している。以下4点を確認することでDTT処理赤血球の有効性を担保している。
左写真：前Lot，有効期限切れ翌日。右写真：新Lot，使用前。
左からDTT処理赤血球×抗K血清，DTT処理赤血球×抗K血清（5倍希釈），比較対照：DTT未処理赤血球×抗K血清（5倍希釈），DTT処理赤血球×抗E血清。5倍希釈においても完全に陰性化しなかったがDTT処理の効果ありと判断した。※抗K血清の抗体価は128倍であった。
①比較対照はDTT処理前K抗原陽性SC赤血球と抗K血清（5倍希釈）との反応が陽性であることを確認。
②DTT処理K抗原陽性SC赤血球と抗K血清（5倍希釈）との反応が比較対照より反応減弱（概ね1+以上の減弱）していることでDTTの有効性確認（DTT処理により感受性を示すK抗原が変性することを確認）。
③DTT処理E抗原陽性SC赤血球と抗E血清との反応を確認することで，DTTに感受性を示さない赤血球抗原に対する不規則抗体が検出可能（1+以上の陽性反応）であることを確認。
④前LotのSC赤血球（有効期限切れ）を上記で作製した新Lotの0.2 mol/L DTT処理SC赤血球使用開始のタイミングと同時並行で有効性確認を実施し，使用期限までDTT処理SC赤血球が問題なく使用できていたことを確認。
70歳代女性，既往歴は肺結核，睡眠時無呼吸，高血圧等。血液型検査の結果はB型RhD陽性，RhタイピングCcDEe。妊娠歴あり，輸血歴不明。末梢性T細胞リンパ腫（PTCL）の治療目的にて入院，1カ月前の検査では，不規則抗体陰性，直接抗グロブリン試験（DAT）は広範囲（1+），IgG（−），C3b・C3d（1+）であった（Figure 2）。入院から約2週間後にTHP-COP療法が開始された。その時に依頼された不規則抗体検査にて不規則抗体陽転化，自己対照陽性，直接抗グロブリン試験陽性で広範囲（3+），IgG（1+），C3b・C3d未検査，ID-Dia Panel（BIO RAD）による同定検査の結果，抗D様の反応を認めた（Figure 3）。さらに，抗CD38抗体薬偽陽性反応確認用のDTT処理SC赤血球にて陰性化したため，抗LW（自己抗体）と判断した。治療経過中，Hbが6.3 g/dLと低下し，赤血球製剤2単位が依頼された。赤血球製剤はRhD陰性赤血球製剤を選択し，交差適合試験は適合であった。輸血後に輸血副反応は認められなかった。その後，イストダックス療法（Romidepsin）開始後（入院加療後48日目）からLD上昇を認めているが，これは投与終了後にLDが低下していること，Hbの低下も顕著ではないことから，本加療における副反応の一部であると考えられた。治療中合計8単位の赤血球製剤輸血後，溶血性輸血反応（以下，HTR）はみられず，貧血は改善され，不規則抗体検査も最終的に陰性化した（Figure 4）。
B型RhD陽性，不規則抗体は陰性，直接抗グロブリン試験は広範囲（+），IgG（−），C3b・C3d（+）
※C3b･C3dは試験管法にて実施。
治療から2週間後の不規則抗体同定検査。反応像の下記はD抗原アンチグラムを示す。直接抗グロブリン試験（IgG）は初診時には陰性であったが陽転化した。
THP-COP：エンドキサン・ドキソルビジン・オンコビン・プレドニンの4剤を組み合わせた悪性リンパ腫に対する治療法。Romidepsin：末梢性T細胞リンパ腫に対する治療法。
90歳代女性，既往歴は高血圧症。妊娠歴あり，輸血歴不明。臀部2度熱傷で緊急搬送され，皮膚科にて入院加療中に汎血球減少が発覚。血液内科に紹介となり，後日，骨髄異形成症候群（MDS）と診断された。入院時にHb 5.3 g/dLと貧血があり，翌日に赤血球製剤2単位が依頼された。血液型はO型RhD陽性，直接抗グロブリン試験陰性（Figure 5），不規則抗体検査陽性であり，ID-DiaPanel（BIO RAD）による同定検査の結果，抗D様の反応を認めた。自己対照は陰性であった。不規則抗体の性状確認では，酵素法（パパイン2段法）は陽性を示した。抗CD38抗体薬偽陽性反応確認用のDTT処理SC赤血球にて陰性化したため抗LWと判断した。赤血球製剤は交差適合試験で適合となったO型RhD陽性赤血球2単位を投与した。HTRは発生しなかった。その翌日に再度，赤血球製剤2単位が依頼され，O型RhD陽性赤血球と交差適合試験を実施したところ不適合となったため，急遽O型Rh D陰性赤血球製剤を血液センターに発注した（Figure 6）。O型RhD陰性赤血球2単位との交差適合試験は適合となり，輸血実施となった。投与された製剤に関してHTRは発生しなかった。入院期間中に4単位のO型RhD陰性赤血球製剤を投与され，Hb値は徐々に上昇した。また，退院中に外来にて2回不規則抗体検査を実施したが，その期間の不規則抗体検査は陰性化しており，Hb値も正常域まで回復した。その後，定期的に赤血球輸血が必要となった際に依頼された不規則抗体検査は陽転化し，抗LWを再び検出した。205日後，発熱により再入院となり，Hb 5.3 g/dL，PLT 16 × 103/μLであったため，2単位のO型RhD陰性赤血球製剤と30単位のO型RhD陽性血小板製剤を4日間投与されたが，Hb値は上昇に乏しく，血小板輸血も効果がみられず，210日後に肺炎にて永眠された。外来及び再入院期間中に投与された赤血球製剤，血小板製剤によるHTRは発生しなかった（Figure 7）。
O型RhD陽性，SCは陽性であり，酵素法（パパイン2段法）陽性，直接抗グロブリン試験は陰性であった。※DP：部分凝集（陽性と判断した）。
入院時の不規則抗体同定検査，反応像の下記はD抗原アンチグラムを示す。入院翌日の交差適合試験はRhD陽性赤血球と適合であった。入院2日後の交差適合試験ではRhD陽性赤血球とは不適合（右），RhD陰性赤血球とは適合（左）となった。※不適合となった結果は除外（赤×で表記）した。
退院時には不規則抗体が陰性化したが，再入院時には不規則抗体検査にて抗D様の陽性反応がみられた。輸血副反応はみられなかった。
多発性骨髄腫に対して，抗CD38抗体薬（ダラツムマブ，イサツキシマブ）による治療が行われており，投与患者においては不規則抗体検査や交差適合試験などのIATに干渉する。陽性反応の真偽確認にはDTT処理赤血球による再検査は必須である。今回，pH 7.3のPBSを用いてDTT溶液を作製した。pH 8.0のPBSを用いてDTT溶液を作製することが一般的だが，pH 7.3でのDTT溶液作製については大阪法においても実施されている6)。当院ではDTT反応時間を20分にしている。0.2 mol/Lにおいては約5分後からCD38抗原が不活化することが確認されており，本来の目的である多発性骨髄腫のCD38抗原を失活させるため反応時間として20分は妥当であると考える7)。またDTT処理赤血球の保存方法についても，奥田らの報告8)もあり確立されている。当院では0.2 mol/LのDTT処理SC赤血球をロット毎に作製し，使用期限まで保存している。Disbro又はHuganらの報告9),10)では12～14日間0.2 mol/L DTT処理SC赤血球保存が可能であったとされている。Maioranaら11)は30日間有効であり，さらに0.2 mol/L DTT処理によるK抗原の変性は部分的だと報告している。当院では有効期限（概ね4週間）まで使用し，Lot変更時に前LotのDTT処理赤血球の有効性確認を再度行い，使用前と同様の結果であることを確認することで，有効期限内の0.2 mol/L DTT処理赤血球の有効性を担保している。0.2 mol/L DTTの有効性を確認するためにK抗原が変性され陰性化することを確認しているが，Maioranaらの報告11)にもあるように高力価の抗K血清では，完全に陰性化することは難しい。0.2 mol/L DTT処理SC赤血球の本来の目的はK抗原の陰性化ではなく，CD38抗原の破壊であり，DTT効果を判定する指標として市販の抗K血清試薬を使用しているに過ぎない。当院ではDTT処理前SC赤血球と市販の抗K血清を比較対照として反応減弱（概ね1+以上）を確認しており，比較対照を同時に検査することが重要であると考える。目視判定にはなるが，これまでSC赤血球の有効期限切れの翌日に実施したDTT処理赤血球有効性確認で精度管理上問題となるようなDTT処理赤血球と抗K及びE血清による予期せぬ反応を示したことはない。しかし，DTT処理赤血球使用中に万が一予期せぬ反応がみられた場合には，0.2 mol/L DTT処理SC赤血球の有効性確認を実施し，不適であればDTT処理赤血球の再作製を検討する必要があると考える。DTT処理赤血球はDTT濃度，方法，保存期限などにおいて様々な報告があり，自施設で使用する試薬赤血球及び細胞保護液，機器，院内診療科の影響による検査状況などを考慮し最適な方法を実施するべきであると考える。今回，抗D様反応を認めた2症例に対して，抗CD38抗体薬投与患者の偽陽性反応に使用している0.2 mol/L DTT処理赤血球を利用して陰性を確認することで抗LWと判断した。LW抗原は臍帯血との反応性［成人RhD（−）RBC < 臍帯RhD（−）RBC < 成人RhD（+）RBC < 臍帯RhD（+）RBC］確認も抗LW確定の一助となるが，一般病院での実施は困難であり，0.2 mol/L DTT処理SC赤血球による反応性確認は汎用性の面でも優れていると考える。抗LWは妊娠やリンパ腫，白血病等の血液疾患において後天的かつ一過性にLW抗原の発現が低下し，血漿（血清）中に自己抗体としての抗LW（LWaまたはLWab）が一過性に産生される場合がある12)。抗LWが同種抗体か自己抗体かを区別することは難しいが，我が国で検出される抗LWの多くは自己抗体であるといわれている13)。今回の症例1においては抗体検出時に自己対照が陽性となったことから，抗LWは病態の進行により産生された温式自己抗体だと考えられる。症例2に関しては一過性にLW抗原が陰性となり，抗LWが出現したことが考えられる。一般病院ではLWの抗原性確認も難しく，両症例の抗原性を確認することはできなかった。また両症例とも通常のRhD陽性であることから，weak DやPartial D等のRhD血液型変異型による同種抗Dの可能性については否定的であると考える。抗LWはHTRや胎児新生児溶血性疾患（HDFN）の原因となることはほとんどなく，多くの抗LW保有者は，交差適合試験不適合のRhD陽性赤血球が問題なく輸血されている。HDFNが発生したと報告された文献は検索する限り，Daviesらの報告14)のみであった。萩山ら15)は，RhD陽性血を輸血後，血清中に抗体価が4倍から1倍に低下し，赤血球解離液の抗体価が4倍から16倍へ上昇したものの輸血後の検査値に異常を認めず，HTRはみられなかったと報告している。今回の2症例においてもHTRは認められなかった。また，症例2では当初RhD陽性赤血球製剤との交差適合試験は適合であったが，2単位投与後のRhD陽性赤血球製剤との交差適合試験にて不適合となった。製剤赤血球中のLW抗原量の違いによるものなのか，抗LWの抗体価上昇による不適合かは不明であるが，RhD陽性赤血球との交差適合試験では不適合となる場合があり，緊急輸血の場合以外はRhD陰性赤血球製剤の選択も考慮する必要がある。日常の精度管理を適切に実施することを前提に，0.2 mol/L DTT処理SC赤血球を保存していることで，不規則抗体検査で抗D様反応がみられた場合の追加検査対応にも利活用でき，迅速な輸血製剤準備に寄与することできると考えられた。
今回，DTT処理SC赤血球を保存することで，抗CD38抗体薬投与患者の不規則抗体検査だけでなく，抗D様反応がみられた2症例の不規則抗体検査の精査においても，抗LWと判断することができ有用であった。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
