Comparative study of laboratory characteristics in coagulation testing for acquired factor V inhibitors

Abstract

後天性凝固第V因子インヒビター（acquired factor V inhibitor; AFVI）は，血液凝固第V因子（factor V; FV）に対する自己抗体である。後天性凝固因子インヒビターの中でも比較的稀な疾患であることからこれまでにまとまった報告が少なく，プロトロンビン時間（prothrombin time; PT）や活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin time; APTT）そしてクロスミキシング試験などの凝血的検査所見の特徴は報告により様々である。今回我々は，AFVIの凝血学的検査所見の特徴を捉えるべく，当院で経験したAFVIの4症例を解析し検討を行った。解析にあたり，AFVIと同様にPTおよびAPTTの延長を呈し鑑別対象となるビタミンK欠乏症（vitamin K deficiency; VKD）および先天性FV欠乏症（congenital FV deficiency; CFVD）を比較対照としてその特徴を探索した。PTおよびAPTT延長の観点においては，VKDと比較した場合，AFVIおよびCFVDではPTの延長度に対しAPTTの延長がより顕著であった。これは測定試薬のFV活性に対する感受性が異なることに起因していることが示唆された。一方で，AFVIとCFVDではPTに対するAPTTの延長度を比較した場合，互いに大きな差を認めなかったが，クロスミキシング試験においてはAFVIのいずれの症例においてもインヒビターパターンを呈しており，凝固因子欠乏パターンを示すCFVDとはこの点で区別が可能であった。本検討において解析したAFVIは全てFVに対する明確な中和活性を認めるものであったが，AFVIの特徴として，測定試薬の凝固因子感受性に応じたPTおよびAPTTの延長度を比較し，かつクロスミキシング試験の結果を総合して考えることで，FV活性測定やFVインヒビター定量の結果を得る前に一定の予測が可能であり，VKDやCFVDとの鑑別が可能であることが示唆された。

Translated Abstract

Acquired factor V inhibitor (AFVI) is an autoantibody against factor V (FV). AFVI is a relatively rare autoimmune disease among acquired coagulation factor inhibitors and there have been limited case reports of AFVI, thus the laboratory characteristics of AFVI had been shown in some variation. In this study, we investigated four cases of AFVI in order to understand the characteristics of laboratory findings in AFVI. We compared the laboratory test characteristics with cases of vitamin K deficiency (VKD) and congenital FV deficiency (CFVD), both of which present with prolonged PT and APTT. As a result, the APTT in patients with AFVI or CFVD was more prolonged against the prolongation of PT compared to VKD. This would be due to the different sensitivity of the reagents to FV activity. On the other hand, AFVI and CFVD did not differ significantly from each other in the degree of prolongation of APTT relative to PT, but AFVI showed an inhibitor pattern in the PT- and APTT-mixing test, which could be distinguished from CFVD, which showed a coagulation factor deficient pattern. These results suggested that AFVI could be distinguished from CFVD using PT- and APTT-mixing tests. All patients with AFVI enrolled in the current study would carry a neutralizing antibody against FV, thus we could not investigated patients with clearance antibody against FV. This was a limitation of this study. However, the characteristics of AFVI could be evaluated by comparing the degree of PT and APTT prolongation according to the coagulation factor sensitivity of the assay reagents, and by considering the results of the mixing test. The certain predictions can be made before obtaining the results of FV activity or FV inhibitor titer, and it might be possible to distinguish AFVI from VKD and CFVD in combination routine laboratory tests with mixing test.

序　 目的

血液凝固因子に対して後天的に発生する自己抗体（インヒビター）はその多くが血液凝固第VIII因子（factor VIII; FVIII）に対する中和抗体であるが，その他の凝固関連因子インヒビターとして第V因子（factor V; FV），第X因子（factor X; FX），第XIII因子（factor XIII; FXIII），von Willebrand因子（von Willebrand factor; VWF）に対する自己抗体などが報告されている。このうち，FVに対するインヒビター（後天性FVインヒビター，acquired FV inhibitor；AFVI）は極めて稀ではあるものの，FVIIIインヒビターに次いで後天性FXIIIインヒビターや後天性VWFインヒビターと同程度の患者数が存在するとされている¹⁾。AFVIは感染症や抗菌薬投与，悪性腫瘍や自己免疫疾患などを背景にして発症することが報告されているが^2),3)，希少疾患であることもありその凝血学的検査所見について一貫した報告は少なく，十分なデータがあるとは言い難いといえる。

AFVIの検査所見は，FV活性の著明な低下に基づくプロトロンビン時間（prothrombin time; PT）及び活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin time; APTT）の著しい延長であり，多くがベセスダ法によるFVインヒビターを認める⁴⁾。診断のためにはFV活性（FV:C）の測定が必須であるが，ほとんどの医療機関では外注検査として運用されているうえ，FVインヒビター定量も研究検査としての取り扱いであるため確定診断に至るためには一定の時間的および経済的コストが必要となる。一方で，スクリーニング検査の位置づけであるPT及びAPTTのみに着目した場合，両者の延長は（程度の差があるものの）日常的に散見される所見であり，肝合成能低下をきたす肝不全等の肝疾患や消費性凝固障害，ビタミンK欠乏症（vitamin K deficiency; VKD），後天性第X因子インヒビター（acquired factor X inhibitor; AFXI）やループスアンチコアグラント・低プロトロンビン血症症候群（lupus-associated hypoprothrombinemia syndrome; LAHPS）などが鑑別疾患として挙げられる。したがって，FV:CやFVインヒビター力価の結果を待つ間に，いかにしてこれらの疾患を除外していくかが検査診断学的に重要であると考えられる。

PTおよびAPTTの延長を認める病態のうち，臨床的に遭遇頻度が高いものは肝不全・消費性凝固障害・VKDであるが，これらのなかで検査初見が類似し特に鑑別が必要となるものはVKDであると考えられる。場合によってはVKの輸注による改善やPIVKA-II高値などの所見が鑑別の補助になるものの，これらの所見が認められないことでVKDが否定されたのちにAFVIを疑うことも多い。また，場合によっては，稀ではあるが先天性FV欠乏症（congenital FV deficiency; CFVD）との鑑別も必要である。そこで本研究では，当院で経験した複数のAFVI症例について凝血学的検査所見を後方視的にレビューし，VKDおよびCFVDを比較対照としてPT，APTT，クロスミキシング試験の特徴を解析・比較し，鑑別に有用となる所見について検討した。

I　 方法

1． 対象症例

2018年から2022年の間に名古屋大学医学部附属病院にてAFVIと診断された4症例および，VKDと診断された患者のうちランダムに選出した4症例を対象とした。さらに，CFVD患者2例を比較に加えた。AFVI症例の患者背景は悪性腫瘍が2例（症例1および2），抗菌薬投与が2例（症例3および4）であった。

2． 検討項目および測定試薬

PTはデイドイノビン（シスメックス株式会社，神戸），APTTはトロンボチェックAPTT-SLA（シスメックス株式会社）を使用し，いずれもCS-5100もしくはCN-6000（シスメックス株式会社）を用いて測定した。クロスミキシング試験はPTの即時反応と，APTTの即時反応および37°Cで2時間加温後の遅延反応を実施した。正常血漿には健常人20名以上から作製した3.2%クエン酸ナトリウム加血漿をプールした健常人プール血症を使用した。なお，正常血漿と患者血漿の混合比率は0:100，25:75，50:50，75:25，100:0の5ポイントとした。なお，CFVD症例のうち1症例（CFVD-2）については検体量不足のためAPTTの即時反応のみ実施した。

3． 凝固因子感受性試験

第II，V，VII，X因子欠乏血症（シスメックス株式会社）に対し，全ての凝固因子活性を100 IU/dLとした正常プール血漿（自家調整）を1，5，10，20，50 IU/dLとなるよう混合した。100 IU/dLの対照は正常プール血漿そのものとした。これらを試料とし，PTおよびAPTTを2回連続測定した。

II　 結果

1． PTおよびAPTT

AFVIとVKD，CFVD症例における凝血学的検査データをTable 1に示した。AFVI及び VKDの全ての症例において，PT，APTT両者の延長が認められたが，その程度は症例によって異なっていた。一方で，これらPT，APTTの測定値を双値したところ（Figure 1），VKDではAPTTの延長に対してPTの延長が優位であり，一方でAFVIとCFVDではPTの延長度に対しAPTTの延長がより優位であった。なお，AFVI症例ではいずれもFV:Cが感度未満であり，FV:C以外の凝固因子の低下も認められたが，これはFVIによる干渉を受けた結果であると考えられた。

Table 1　AFVI・VKD・CFVD症例における凝血学的検査データ

Case ID	PT (s)	APTT (s)	FII:C (IU/dL)	FV:C (IU/dL)	FVII:C (IU/dL)	FVIII:C (IU/dL)	FIX:C (IU/dL)	FX:C (IU/dL)	FXI:C (IU/dL)	FXII:C (IU/dL)
AFVI-1	57.8	119.6	12	3 >	32	0.8 >	1 >	15	3 >	3 >
AFVI-2	89.7	213.2	24	3 >	74	34.9	40	72	25	27
AFVI-3	89.6	149.9	n/a	3 >	n/a	0.8 >	1 >	n/a	3 >	3 >
AFVI-4	52.8	148.0	49	3 >	61	87.3	85	64	n/a	n/a
VKD-1	126.2	92.4	4	105	3.0 >	117.5	6	4	53	37
VKD-2	54.9	48.5	26	90	4	n/a	n/a	20	n/a	n/a
VKD-3	28.0	47.9	31	134	7	n/a	n/a	22	n/a	n/a
VKD-4	156.5	112.7	3 >	137	3.0 >	146.4	5	5	84	76
CFVD-1	46.1	147.3	n/a	3 >	n/a	n/a	n/a	n/a	n/a	n/a
CFVD-2	45.5	146.6	n/a	3 >	n/a	n/a	n/a	n/a	n/a	n/a

n/a: not available

Figure 1　 PT・APTT双値プロット

AFVI，VKDおよびCFVD各症例のPT（秒）とAPTT（秒）をそれぞれプロットした。赤：AFVI，青：VKD，緑：CFVD

2． クロスミキシング試験

AFVIおよびVKD症例におけるPTおよびAPTTクロスミキシング試験の結果をそれぞれFigure 2およびFigure 3に示した。PTクロスミキシング試験では，AFVIの全ての症例でインヒビターパターンを示した（Figure 2：上段）。一方，VKDでは正常血漿25%の添加で凝固時間が補正される典型的な凝固因子欠乏パターンを呈した（Figure 2：中段）。APTTクロスミキシング試験においては，AFVIの全ての症例で即時反応・遅延反応のいずれにおいてもインヒビターパターンを呈し（Figure 3：上段），一方，VKDでは即時反応・遅延反応のいずれも凝固因子因子欠乏パターンを示した（Figure 3：中段）。CFVD症例のクロスミキシング試験では実施したPTおよびAPTT即時反応・遅延反応の全てで凝固因子欠乏パターンを示した（Figure 2，3：下段）。

Figure 2　 PTクロスミキシング試験

正常血漿との混和直後の即時反応を示す。上段：AFVI症例，中段：VKD症例，下段：CFVD症例

Figure 3　 APTTクロスミキシング試験

実線は正常血漿との混和直後の即時反応，破線は37°Cで2時間加温後の遅延反応を示す。CFVD-2のみ即時反応のみ実施した。上段：AFVI症例，中段：VKD症例，下段：CFVD症例

3． 凝固因子感受性試験

PT測定試薬であるデイドイノビンにおける第II因子（factor II; FII），FV，第VII因子（factor VII; FVII），FXに対する感受性と，APTT測定試薬であるトロンボチェックAPTT-SLAのFII，FV，FXに対する感受性をFigure 4に示した。デイドイノビンではそれぞれ凝固因子活性の低下に伴い凝固時間は延長し，特にそれぞれの凝固因子活性が1 IU/dLの場合において，FVに対してFII，FVII，FXでは著名な凝固時間の延長が認められることが示された（Figure 4A）。一方，トロンボチェックAPTT-SLA（Figure 4B）ではFIIおよびFXとFVの感受性が異なっており，それぞれ1 IU/dLでの観察ポイントではFII，FXに対してFV欠乏における凝固時間の延長が著明であった。

Figure 4　 PTおよびAPTT試薬における凝固因子感受性の比較

（A）デイドイノビンにおける第II因子（FII：濃灰），第V因子（FV：赤），第VII因子（FVII：黄），第X因子（FX：橙）の凝固因子活性と凝固時間の関係性を示した。（B）トロンボチェックAPTT-SLAにおけるFII（濃灰），FV（赤），FX（橙）の凝固因子活性と凝固時間の関係性を示した。

III　 考察

AFVIは後天性凝固因子インヒビターのカテゴリの中でもPTおよびAPTT両者の延長を認めるため，APTTの単独延長をきたすFVIIIに対するインヒビター（後天性血友病A）やVWFに対するインヒビター（後天性VWD），あるいはPT・APTTいずれの延長も認めないFXIIIインヒビターと区別することは比較的容易である。しかし，PTとAPTTの延長を認めるという点に限っては，臨床的にAFVI以外の病態でしばしば観察されるため，実際には鑑別候補として上位にないことが多いのではないかと推察される。

今回我々が検討したAFVI症例においては，いずれも比較的高度の凝固時間延長を認めている症例がほとんどであった。これは凝固時間延長が軽度にとどまるような（例えば発症初期のような）時期ではAFVIを同定することが困難である可能性を示唆しているとも考えられる。この点を考慮し，本研究ではVKD症例の中でも比較的高度な凝固時間延長を認める症例を対象として検証を実施した。

ビタミンK欠乏症では，ビタミンK依存性タンパクである第II，VII，IX，X因子が，ビタミンKの不足により正常な凝固因子活性を持たない前駆体タンパク（protein-induced vitamin K absence/antagonist; PIVKA）の状態で血中に出現する⁵⁾。そのため正常な凝固反応が起こらず，PT及びAPTTが延長する。臨床的にはAFVIに対してVKDが明らかに高頻度に認められ，VKDは経口摂取不良や抗菌薬の長期投与，胆汁分泌不全などその原因となる背景と事前確率を以って積極的に疑うことができることも事実である。一方でAFVIにおいてはさまざまな要因が引き金となりFVに対する自己抗体が産生されると考えられているが^6)～9)，希少疾患であり認知度もVKDに対して低いことから，VKDが否定されたのちに凝固因子活性測定の結果を得て初めて診断に至ることも事実ではないかと考えられる。この点において，これらVKDとAFVIを早いタイミングで鑑別するためにはPTおよびAPTTそしてクロスミキシング試験が有用であると考えられる。今回の我々の比較検討では，AFVIの大きな特徴としてVKDに対してAPTTの顕著な延長が認められる点が挙げられる。このPTに対するAPTTの著明な延長は，測定に使用したAPTT試薬（トロンボチェックAPTT-SLA）の因子感受性に起因すると考えられた。すなわちFV:Cのみが低下するAFVIが，FV以外の凝固因子活性低下を呈するVKDに対し，PTの延長に対するAPTTの延長が顕著であったと考えられる。

一方で，同様にFV活性のみが低下するCFVDとの鑑別も必要である。FV活性に応じたPTおよびAPTTの延長が認められ，同じくAPTT試薬のFV感受性に基づいてAPTTの著明な延長が観察されるため，PT・APTTのみでAFVIと鑑別することは極めて困難である。これに対し，クロスミキシング試験ではAFVIとCFVDでは明確なパターンの差を認めており，今回の検討症例ではAFVIで全てインヒビターパターンを呈していた。AFVIにおけるクロスミキシング試験の判定は，産生される自己抗体が中和抗体であるのか，あるいはクリアランス抗体であるのかによって判定が変化することが予想される。しかし実際にはクリアランス抗体によるAFVIを証明するには新鮮凍結血漿を用いて輸注試験を行うほか方法がない。2021年にフランスのAFVIに対する全国調査の結果が報告されているが，AFVIの診断基準として正常血漿との1:1のミキシング試験で補正が得られないこと，およびベセスダ法でインヒビターが検出されていることが示されており，この研究では実質的にクリアランス抗体によるAFVIは（存在したとしても）含まれていない¹⁰⁾。また，“正常血漿との1:1のミキシング試験で補正が得られないこと”はクロスミキシング試験の即時反応でインヒビターパターンを呈することと同義であると考えられることから，AFVIのほとんどは明らかな温度時間依存性を有さない中和活性をもつものであることが示唆される。また，AFVIの抗FV抗体はほぼ即時型の中和活性を持つとされており¹¹⁾，これに基づくとクロスミキシング試験においては即時反応からインヒビターパターンを呈することとなる。この傾向は本研究に組み込まれた4症例においても矛盾のない結果が観察されている。これらより，クロスミキシング試験の結果をもってAFVIとCFVDを区別することは可能であると考えられる。

今回の研究では対象に含まなかったが，VKD以外の鑑別疾患として比較的高頻度に遭遇するものとして肝疾患や消費性凝固障害が挙げられる。肝合成能の低下に起因する凝固因子の産生低下であれば，通常フィブリノゲンやアンチトロンビン活性の低下をきたすため，この点でFVIやVKDとの鑑別は容易であるといえる。また，消費性凝固障害においては，フィブリン・フィブリノゲン分解産物などの分子マーカーも参考にすべきと考える。一方で，臨床的にはAFXIやLAHPSも鑑別対象となるが報告は限られており，測定条件や解析項目が異なるため本研究成果との直接比較は困難であるが，AFXIではFXに対するクリアランス抗体が示唆された症例が複数報告されている^12),13)。実際，Rossignonら¹³⁾の報告した症例ではAPTTのクロスミキシング試験は因子欠乏型を呈していたことが報告されている。また，LAHPSでは FIIに対するインヒビターはクリアランス抗体と考えられているため¹⁴⁾，そのような中和活性を示さないインヒビターであればクロスミキシング試験ではインヒビターパターンを示さないと考えられる。これらAFXIやLAHPSの凝血学的初見を特徴付けるためには，まとまった症例数を一定の決まった測定条件において解析することが重要であり，今後の検討課題であると考えられる。

本研究に含まれたAFVI症例はいずれも中和活性を持つFVインヒビターであり，クリアランスを亢進させるようなタイプについての検討は実施できていない。しかしながら，複数症例のAFVIについて定まった条件下で凝血学的検査を実施し一定の特徴を捉えたことは，臨床的に価値のあるものと考えられる。今後さらに症例を経験することでさらなる医学的エビデンスの蓄積を目指したいと考える。

IV　 結語

AFVIの診断にはFV活性やFVインヒビター力価を測定する必要があり一定のコストを要するが，使用する測定試薬の凝固因子感受性を理解することでスクリーニング検査であるPT・APTT・クロスミキシング試験の結果から一定の鑑別が可能であることが示唆された。

本研究は名古屋大学医学部生命倫理委員会の承認を得て施行した（承認番号：2010-1038および2022-0317）。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献

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