2025 Volume 74 Issue 1 Pages 66-72
目的：体腔液細胞診における小細胞癌とリンパ腫において，低真空走査電子顕微鏡（low-vacuum scanning electron microscopy; LVSEM）による観察を行い，超微形態学的特徴を明らかにする。方法：胸水細胞診16例（小細胞癌7例，リンパ腫9例）に対し，検査後の標本を再評価・撮影し，Papanicolaou染色（Pap染色）標本のカバーガラスを剥離，リンタングステン酸で導電染色後，LVSEM観察を行い，腫瘍細胞の形態について解析した。成績：Pap染色標本に対する再評価では，16例中5例（小細胞癌3例，リンパ腫2例）で形態のみでは鑑別困難と考えられた。LVSEM観察では，小細胞癌でドーム状（85.7%），密度の高い微絨毛（85.7%），細胞間の結合性有り（85.7%），細胞表面の陥凹（42.9%）がみられた。リンパ腫では，球状（100%），短い微絨毛（88.9%），細胞間の結合性無し（88.9%）であった。LVSEMのみでは，16例中14例（小細胞癌6例，リンパ腫8例）で鑑別可能と考えられた。結論：Pap染色標本のLVSEM観察は，小細胞癌とリンパ腫の鑑別に有用であることが示唆された。
Objective: We examined the cell morphology in pleural effusion using low-vacuum scanning electron microscopy (LVSEM) to differentiate small cell carcinoma (SmCC) and lymphoma. Study Design: Our study included pleural fluid specimens from 16 cases, including seven cases of SmCC and nine cases of lymphoma. The specimens were examined and photographed under an optical microscope, and the cover glasses were removed using hot xylene. After conductive staining with phosphotungstic acid, the same specimens were observed, and photographs were obtained by LVSEM. Results: Differentiation between SmCC and lymphoma was impossible in five cases using an optical microscope alone. On LVSEM, SmCC cells showed “dome-like cell morphology” (85.7%), “high density microvilli” (85.7%), “cell binding positive” (85.7%), and “depression” (42.9%), while lymphoma cells showed a “spherical morphology” (100%), “short microvilli” (88.9%), and “cell binding negative” (88.9%). Differentiation was performed in 14 cases using LVSEM. Conclusion: Our findings suggest that using LVSEM in the cytopathological examination of pleural fluid is useful for distinguishing SmCC and lymphoma.
胸水細胞診において，小細胞癌とリンパ腫は，N/C比の高い他の小型円形腫瘍細胞より比較的高い頻度で遭遇する1),2)。小細胞癌では，N/Cの高い小型円形腫瘍細胞が出現し，時に裸核様で木目込み細工様の配列などの結合性を示すとされ，一方，リンパ腫では，小型円形腫瘍細胞が結合性を示さず，時に核形不整など核異型を示すといわれている1),2)。しかし，小細胞癌において，明らかな結合性が不明瞭である，または出現細胞数が少数である場合，また，リンパ腫が集塊として出現し，光学顕微鏡観察によって結合性を否定することが困難な場合，chromogranin Aやsynaptophysin，CD3，CD20などの免疫細胞化学的検索をすることもある。
体腔液細胞診における免疫細胞化学的検索には細胞転写法やセルブロック作製が推奨されている2)。細胞転写法は，簡易で安価な方法であり，利便性が非常に高いと考えられるが，転写による細胞剥離リスクがあり，事前に撮影・記録したとしても免疫染色によってPapanicolaou染色（以下，Pap染色）標本を消失することになる。セルブロック作製では，標本枚数の制限がかかりにくく複数のマーカーによる検索を容易にするが，提出検体全例について行うことはコストや業務効率を考慮すると難しく，どのような検体に対しセルブロック作製を行うか判断が難しい。そこで，筆者らは低真空走査電子顕微鏡（low-vacuum scanning electron microscopy; LVSEM）を用い，検査後のPap染色標本に対しLVSEM観察を行い，観察後に再度Pap染色標本に戻す技術を開発し，肺癌の細胞診において腺癌と扁平上皮癌の鑑別に有用であることを報告した3),4)。
今回我々は胸水中の小細胞癌とリンパ腫に関し，前述の方法を用いPap染色標本に対するLVSEM観察を行い，その形態学的特徴を明らかにすることを目的とし後方視的検討を行った。
対象は東京医科歯科大学病院病理部にて2008年～2010年に検査された胸水細胞診16例で，内訳は小細胞癌7例（男性7名，年齢41–80歳，中央値74歳，原発臓器―肺6例，食道1例），リンパ腫9例（男性7名，女性2名，年齢50–80歳，中央値61歳），細胞診判定ですべて陽性（Class V）であった（Table 1）。
| Number of samples or Value | ||
|---|---|---|
| Small cell carcinoma | Lymphoma | |
| Cases | 7 | 9 |
| Age | 41–80 | 50–80 |
| median | 74 | 61 |
| Sex | ||
| male | 7 | 7 |
| female | 0 | 2 |
| Primary organs | ||
| Lung | 6 | — |
| Esophagus | 1 | — |
| Lymph node | — | 9 |
| Histopathological data | ||
| Diffuse large B cell lymphoma | — | 8 |
| Follicular lymphoma | — | 1 |
Pap染色やギムザ染色標本について，光学顕微鏡にて組織型を再度確認後，組織型推定が難しいと考えられる症例について組織型の確認のため，細胞転写法による免疫細胞化学的検索（chromogranin A, synaptophysin, CD20）を行った。
3． LVSEM観察のための試料作製光学顕微鏡による観察，撮影の終了したPap染色標本に対し，キシレン浸漬後カバーガラスを除去し，10%リンタングステン酸水溶液にて室温で60分間，導電染色を行った。軽く水洗後，冷風にて標本を乾燥させた。標本をカーボン製両面テープでアルミ試料台に固定し，日立卓上顕微鏡Miniscope® TM3030（日立ハイテクノロジーズ）を用い，標準モード（真空度30 Pa），通常モード（加速電圧15 kV），反射電子を用いて，観察，撮影を行った。
4． LVSEM観察における評価方法各症例のPap染色で腫瘍細胞と考えられた同一または同様の腫瘍細胞20個につき，細胞形（cell shape），細胞径（cell size），微絨毛の長さ（length of microvilli）や密度（density of microvilli），細胞間の結合性（cell binding）の有無，細胞表面の陥凹（depression）などの項目について観察を行った。観察項目の定義として，細胞形はドーム状（dome-like）または球状（spherical）とし，50%を超える形状をその症例の細胞形とした。上部から細胞を観察した際に，ドーム状では細胞辺縁がスライドガラスに対し接着しており，球状では細胞辺縁が丸みを帯びスライドガラスに接している部位が観察できないものとした。細胞径は対象細胞の長径を測定し平均値を比較した。微絨毛の長さは，300 nm以上を“長い（long）”，300 nm未満を“短い（short）”とした。微絨毛の密度は，微絨毛間に明らかに隙間がみられるものを“低い（low）”，それ以外を“高い（high）”とした。結合性の有無は，50%以上の腫瘍細胞に結合性を示したものを“有り（positive）”，結合性のみられないものを“無し（negative）”とし，細胞表面の陥凹は，1個以上観察された場合，“有り（positive）”，みられない場合を“無し（negative）”とした。細胞形，微絨毛の長さ，密度，結合性の有無，細胞表面の陥凹についてはFisherの正確確率検定，細胞径についてはStudentのt検定を行い，有意水準を5%とした。各症例について，上記項目を総合的に考慮し小細胞癌とリンパ腫の鑑別が可能か検討を行った。
典型的な小細胞癌では，N/C比の高い小型腫瘍細胞が結合性を示し小集塊で出現し，典型的なリンパ腫では，核小体の目立つN/C比の高い小型円形腫瘍細胞が明らかな結合性を示さず出現していたため判定可能であった（Figure 1a, d）。しかし，小細胞癌では7例中3例で結合性不明瞭な異型細胞が多数みられ，2例で部分的に核の挫滅がみられた。リンパ腫では9例中2例で細胞集塊が多数出現し結合性の有無に関し不明瞭であった。よって，16例中5例を光学顕微鏡観察において形態のみでは鑑別困難と考えた（Figure 2a, 3a, Table 2）。鑑別困難な5例では，小細胞癌3例でchromogranin A，synaptophysinが陽性となり，リンパ腫2例でCD20が陽性となった。
Typical images of Small cell carcinoma (a–c) and lymphoma (d–f). Pap-stained slide shows tumor cells with almost naked nuclei (a). Higher magnification of the cells in the square region of (b) shows perfect binding of two adjacent cells (arrow) and long and dense microvilli on the surface (c). LVSEM observation in the circular area of (d) shows isolated and sphere-shaped cells, and short and sparse microvilli on the cell surface (f). (a) Pap. staining, ×1,000; (b) LVSEM image of the same area shown in (a), ×1,000; (c) LVSEM image, ×10,000; (d) Pap. staining, ×1,000; (e) Giemsa staining, ×400; (f) LVSEM image, ×8,000.
Discohesive properties of tumor cells are shown in the Pap-stained slide with cell divisions (arrow) (a). LVSEM observation of two cells with long microvilli shows binding (arrow) in the square areas of (a), (b), and (c). Depression (arrowhead) is observed on the cell surface (d). (a) Pap. staining, ×1,000; (b) LVSEM image of the same area shown in (a), ×2,000; (c) LVSEM image, ×10,000; and (d) LVSEM image, ×10,000.
Tumor cells in the Pap-stained slides are aggregated and piled up in a few layers (a). Spherical tumor cells in the circular areas of (a) and (b) without binding (arrow) (c). (a) Pap. staining, ×1,000; (b) LVSEM image of the same area shown in (a), ×2,000; (c) LVSEM image, ×10,000.
| Pathological diagnosis | Primary organ | Optical microscopy*1 | LVSEM*2 | |
|---|---|---|---|---|
| Case 1 | SmCC*3 | Lung | Effective | Effective |
| Case 2 | SmCC*3 | Lung | Effective | Effective |
| Case 3 | SmCC*3 | Lung | Non-effective | Effective |
| Case 4 | SmCC*3 | Esophagus | Non-effective | Effective |
| Case 5 | SmCC*3 | Lung | Non-effective | Effective |
| Case 6 | SmCC*3 | Lung | Effective | Non-effective |
| Case 7 | SmCC*3 | Lung | Effective | Effective |
| Diagnostic accuracy for Small cell carcinoma | 57.1% (4/7) | 85.7% (6/7) | ||
| Case 8 | DLBCL*4 | Lymph node | Effective | Effective |
| Case 9 | DLBCL*4 | Lymph node | Effective | Effective |
| Case 10 | DLBCL*4 | Lymph node | Non-effective | Effective |
| Case 11 | DLBCL*4 | Lymph node | Effective | Non-effective |
| Case 12 | DLBCL*4 | Lymph node | Effective | Effective |
| Case 13 | DLBCL*4 | Lymph node | Effective | Effective |
| Case 14 | FL*5 | Lymph node | Effective | Effective |
| Case 15 | DLBCL*4 | Lymph node | Effective | Effective |
| Case 16 | DLBCL*4 | Lymph node | Non-effective | Effective |
| Diagnostic accuracy for Lymphoma | 77.8% (7/9) | 88.9% (8/9) | ||
| Diagnostic accuracy for all cases | 68.8% (11/16) | 87.5% (14/16) | ||
*1“Optical microscopy” means diagnosis by Pap-stained and Giemsa-stained slides. *2Low-vacuum scanning electron microscopy, *3Small cell carcinoma, *4Diffuse large B cell lymphoma, *5Follicular lymphoma.
小細胞癌では，ドーム状（6/7例，85.7%），細胞径の平均値9.44 μm，長い微絨毛（4/7例，57.1%），密度の高い微絨毛（6/7例，85.7%），細胞間の結合性有り（6/7例，85.7%），細胞表面の陥凹（3/7例，42.9%）となった（Figure 1b, c, 2b–d）。リンパ腫では，球状（9/9例，100%），細胞径の平均値7.96 ± 1.93 μm，短い微絨毛（8/9例，88.9%），密度の低い微絨毛（5/9例，55.6%），細胞間の結合性無し（8/9例，88.9%），細胞表面の陥凹はみられなかった（Figure 1f, 3b, 3c）。小細胞癌，リンパ腫ともに一部で微絨毛の癒合が観察された。細胞形，細胞径，結合性において統計学的有意差がみられた（Table 3）。
| Cell shape*1 | Average of cell size*2 | |||
|---|---|---|---|---|
| Dome-like | Spherical | |||
| Small cell carcinoma | 85.7%（6/7） | 14.3%（1/7） | 9.44 ± 1.53 μm | |
| Lymphoma | 0%（0/9） | 100%（9/9） | 7.96 ± 1.93 μm | |
| p value | < 0.01※ | < 0.01※ | ||
| Length of microvilli*1 | Density of microvilli*1 | |||
| Long | Short | High | Low | |
| Small cell carcinoma | 57.1%（4/7） | 42.9%（3/7） | 85.7%（6/7） | 14.3%（1/7） |
| Lymphoma | 11.1%（1/9） | 88.9%（8/9） | 44.4%（4/9） | 55.6%（5/9） |
| p value | 0.26 | 0.15 | ||
| Cell binding*1 | Depression*1 | |||
| Positive | Negative | Positive | Negative | |
| Small cell carcinoma | 85.7%（6/7） | 14.3%（1/7） | 42.9%（3/7） | 57.1%（4/7） |
| Lymphoma | 11.1%（1/9） | 88.9%（8/9） | 0%（0/9） | 100%（9/9） |
| p value | < 0.01※ | 0.06 | ||
*1Fisher’s test, *2Student’s t-test, ※Significant difference shows p value is < 0.05.
典型的なLVSEM観察像として，小細胞癌では，①ドーム状，②密度の高い微絨毛，③結合性有り，④細胞表面の陥凹有り，リンパ腫では，①球状，②短い微絨毛，③結合性無し，④陥凹無しであった。各症例において，細胞の結合性を中心に観察所見を総合的に考慮すると，小細胞癌で7例中6例，リンパ腫で9例中8例が鑑別可能であった（Table 2）。
LVSEMにて鑑別困難とした2例のうち，小細胞癌では反応性中皮細胞と混在しながら集塊を形成しており，腫瘍細胞の特定が難しく，結合性が明らかでなかった。鑑別困難としたリンパ腫では，微絨毛が長く，微絨毛の密度が高く，結合性がみられた。これら2例のPap染色による光学顕微鏡観察では，どちらも典型的な細胞像を呈しており，Pap染色にて鑑別可能であった。
また，Pap染色にて鑑別困難であった3例の小細胞癌のうち，2例でドーム状，結合性有り，長く密度の高い微絨毛を示し，1例で球状を示すが，明らかな結合性を有し，長く密度の高い微絨毛や細胞表面の陥凹を示した。Pap染色にて鑑別困難であったリンパ腫2例では，球状で密度が低く，短い微絨毛を有し，結合性を示さなかった。以上より，Pap染色にて鑑別困難であった5例は，LVSEMによる鑑別が可能であった。
本研究では，胸水細胞診において小型円形腫瘍細胞として比較的高い頻度で出現する小細胞癌とリンパ腫について，非破壊的にPap染色標本を観察し，その超微形態学的特徴を明らかにするとともに，LVSEMによる鑑別が可能か検討を行った。
光学顕微鏡観察では，小細胞癌において明らかな結合性がみられない，またはリンパ腫において重積性を示す集塊として観察されるなど，典型的な細胞像を示さない場合，臨床情報や原発巣の組織型，核クロマチンの構造や核小体の有無，免疫細胞化学的検索などから総合的に組織型を推定する。今回，LVSEMを用いた観察では，ドーム状や球状などの細胞の立体的な形，電子顕微鏡レベルの細胞の結合性，細胞表面の陥凹など，光学顕微鏡観察では分からない特徴的な構造を捉えることができた。光学顕微鏡観察による形態学的特徴のみでは16例中5例で鑑別困難であり，LVSEM観察のみでは2例で鑑別困難となった。しかし，それぞれの鑑別困難例は重複せず，Pap染色による光学顕微鏡観察に対して補助的にLVSEM観察を行うことで，全例において鑑別可能となった（Table 2）。標本中の腫瘍細胞数が少ないなど免疫細胞化学的検索が難しい場合に，小細胞癌とリンパ腫を鑑別する新たな補助的検査法としてLVSEMによる観察が有用である可能性が示唆された。
LVSEMでは，細胞形，細胞径，結合性の有無において統計学的有意差がみられ，細胞表面の陥凹では小細胞癌のみで観察された。小細胞癌では細胞形がドーム状（6/7例）の傾向があり，リンパ腫では球状（全例）となった。Beckerら5)の文献中の画像では，神経芽細胞腫の症例で同様なドーム状を呈し，リンパ腫で球状を呈していた。腫瘍細胞を含む多くの細胞は体腔液中では球形に近い形をしていると推測され，スライドガラスに塗抹された段階で変形を来たし，変形度合いの大きい小細胞癌では球状ではなくドーム状になったものと推測された。また，細胞径では統計学的有意差がみられたものの，LVSEM観察において明らかに大きさを区別できるほどの差はみられず，大きさを鑑別点とするのは難しいと考えられた。結合性の有無において，Pap染色の光学顕微鏡による鑑別点として非常に重要であるが，小細胞癌ではFigure 2のように光学顕微鏡では明らかな結合性がみられない腫瘍細胞についてLVSEM観察をすることで結合性が確認された。リンパ腫ではFigure 3のように重積性を示す集塊であってもLVSEM観察を行うことで明らかな結合性がみられなかったことから，LVSEMでは光学顕微鏡で捉えきれない結合性を観察できる可能性があり，LVSEM観察において最も重要な鑑別点と考えられた。また，微絨毛の長さや密度について統計学的有意差はみられなかったものの，リンパ腫では微絨毛は短く，小細胞癌では微絨毛の密度が高い傾向となり，所見を総合的に捉える際の参考所見となった。
Beckerら5)はアルコール固定による細胞診標本に対し走査電子顕微鏡観察を行い，1例のリンパ腫で細胞表面にしわ状の表面構造（ruffled surfaces）があると報告している。本研究のリンパ腫においては，短い微絨毛がみられ，一部の微絨毛で癒合が観察されるものの，しわ状と表現されるような細胞表面の構造はみられなかった。筆者らは肺癌，特に腺癌において微絨毛の癒合（agglutinative filaments）を指摘しているが，癒合や細胞の陥凹（depression）とともに細胞表面のしわ状の構造も報告している4)。しわ状構造は，グルタールアルデヒド固定による電子顕微鏡観察では報告されていないが6),7)，アルコール固定による肺腺癌で同様の構造がみられることから4)，アルコール固定による細胞表面の収縮か，症例特異的な構造であるのか，さらなる検討が必要と考えられた。
今後は他の組織型においてもLVSEM観察を行い，各組織型の形態学的所見を明らかにし，他の組織型についても補助的検査法として有用か，検討を進める必要がある。
本研究は，東京医科歯科大学医学部倫理審査委員会（M2019-335），埼玉県立大学研究倫理委員会（22011）の承認を得て行った。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
