Abstract
VRE（vancomycin-resistant enterococci）は感染対策が必須の薬剤耐性菌である。2023年12月に迅速VREスクリーニング培地であるクロモアガーTM VRE blue（CH-blue）が発売された。今回，我々はその培地性能について，BD BBLTM VRE選択培地（BD-VRE）を対照とした比較検討を行った。検討菌株として，vanA又はvanB保有株（7株），プラスミド性耐性遺伝子非保有株（11株），臨床材料として糞便検体（98検体）を使用し，それぞれにおける菌の発育性を比較した。さらに，CH-blueに発育したプラスミド性耐性遺伝子非保有の7株を用いて，CH-blue製造後から時間的経過による発育抑制能を追加検討した。VCM ≥ 16 μg/mLのvanA又はvanB保有株は，CH-blueにおいて24時間の発育が良好かつ視認性に優れていた。VCM ≤ 8 μg/mLのvanB保有株は，BD-VREにおいて低濃度菌量で発育を認めたが，CH-blueにおいて高濃度菌量で発育を認めた。また，プラスミド性耐性遺伝子非保有株の発育抑制能は，CH-blueを用いた48時間以上の延長培養で乏しく，かつ有効期限が迫ったCH-blueで低下することが示唆された。以上の結果から，各培地の特性を理解し，判定期日や施設の状況に即した培地を選択することが重要であると考えられた。
Translated Abstract
Vancomycin-resistant enterococci (VRE) are drug-resistant bacteria critical for infection control in clinical settings. This study evaluated the performance of the ChromoAgarTM VRE blue plate (CH-blue), a novel rapid VRE screening tool, compared to the BD BBLTM VRE selective plate (BD-VRE). The evaluation included enterococcal strains carrying vanA and vanB genes (7 strains), plasmid resistance gene-free strains (11 strains), and clinical stool samples (98 samples). The study also investigated CH-blue’s inhibitory capacity over time post-manufacture, using seven plasmid resistance gene-free strains capable of growing on CH-blue. CH-blue showed robust growth and superior visibility for vanA and vanB strains with VCM concentrations ≥ 16 μg/mL after 24 hours compared to BD-VRE. The stealthy vanB-type VRE with VCM ≤ 8 μg/mL was detected at lower bacterial concentrations on BD-VRE, while CH-blue required higher concentrations. Prolonged incubation of CH-blue beyond 48 hours reduced its inhibitory performance against some plasmid resistance gene-free strains, which further declined as its expiration date approached. These findings indicate that CH-blue is effective for rapid VRE detection within 24 hours but less sensitivity for stealthy vanB-type VRE. The selectivity of CH-blue for plasmid resistance gene-free strains decreased with prolonged incubation and approaching expiration date. BD-VRE offers higher sensitivity and selectivity in these cases. Therefore, selecting the appropriate plate requires understanding their characteristics and considering evaluation timelines and facility conditions.
I はじめに
腸球菌は，腸管内に常在するグラム陽性球菌であるが病原性は低く，免疫機能が低下した易感染宿主に対して心内膜炎や尿路感染症，敗血症などを引き起こす日和見感染症の原因菌である1)。Vancomycin（VCM）に耐性を示すバンコマイシン耐性腸球菌（vancomycin-resistant enterococci; VRE）は世界的に拡大しており，2019年に米国疾病予防管理センター（CDC）は，米国における医療関連の腸球菌感染症の約30%はVCM耐性があり，治療の選択肢が少なくなっていると報告している2)。本邦では，VREは5類全数把握対象疾患とされており，感染症法によってVCMのMIC値が16 μg/mL以上で，通常無菌的であるべき検体から分離された場合や感染症の起因菌と判定された場合に届出対象となる3)。また，感染症発生動向調査によると，2011年から2019年まで年間報告数は100例未満で推移していたが，2020年は136例，2021年は124例，2022年は133例と近年は増加傾向である4)。VREの耐性遺伝子として，主にvanA，vanB及びvanCが報告されている5)が，プラスミド性耐性遺伝子であるvanA，vanBは他菌種へ伝達するため特に注意が必要であり，迅速な検出が院内感染対策において極めて重要である。一方で，主にEnterococcus gallinarumやEnterococcus casseliflavusが保有するvanCは，染色体性に遺伝子が存在するために自然耐性であり，院内感染対策の必要性はない1)。さらに，VRE中には耐性因子を保有しているにも関らず，VCM感受性を有するステルス型VREが確認され報告されている6)。VCMのMIC値が低いため，通常のスクリーニング検査では見逃される可能性があり，ステルス型VREによるアウトブレイクが報告されている7)。NPO法人KRICTは，これらの株のスクリーニングについて，VREスクリーニング培地の培養を72時間まで延長することを提言している8)。
従来，腸球菌は腸管内常在菌であり便から多量に排泄されるため，VREスクリーニング検査として，便から検出された全株のEnterococcus spp.の同定と薬剤感受性試験を行うことは困難であることからVREスクリーニング培地の使用が有用である。今回，関東化学が発売している新しい迅速VREスクリーニング培地であるクロモアガーTM VRE blue（CH-blue）9)と日本ベクトン・ディッキンソンのBD BBLTM VRE選択培地（BD-VRE）10)の有用性について比較検討する機会を得たのでここに報告する。
II 対象と方法
1． 菌株を用いた検討
Table 1に検討菌株を示す。vanA又はvanB保有株として，vanAを保有するEnterococcus faecalis 1株，vanBを保有するEnterococcus faecium 6株の計7株を用いた。プラスミド性耐性遺伝子非保有株として，耐性因子を保有しないE. faecalis 1株，vanCを保有するE. casseliflavusとE. gallinarumをそれぞれ3株ずつ，VCM自然耐性である4株（Lactobacillus species 1株，Pediococcus acidilactici 1株，Weissella confusa 1株，Leuconostoc lactis 1株）の計11株を使用した。これらの検討菌株はMiles & Misra法12)に準拠してその発育性を比較した。これは，検討菌株を生理食塩水にてMcFarland 0.5の菌液を調整後，この菌液から7段階の10倍希釈液を作成し，それぞれの希釈菌液を8分画した各培地に10 μLずつ滴下してその発育性を評価する方法である。培養時間について，CH-blueは24時間，BD-VREは48時間を推奨されているが，今回は35℃好気条件下で24時間，48時間及び72時間培養後にそれぞれ菌の発育性を確認した。コロニーの色調は，CH-blueが水色コロニー，BD-VREが赤茶色コロニーの発育を陽性と判定した。実際に用いたMiles & Misra法の培地コロニー性状結果をFigure 1に示す。
Table 1 菌株を用いた検討で使用された菌株
|
vanA，vanB保有株 |
プラスミド性耐性遺伝子非保有株 |
精度管理・
当院保存株 |
Enterococcus faecalis（vanA）1株
Enterococcus faecium（vanB）1株 |
Enterococcus faecalis ATCC29212
（耐性因子なし）1株 |
| 臨床分離株 |
当院分離株
Enterococcus faecium（vanB）3株
天草地域医療センター提供株
Enterococcus faecium（vanB）2株 |
Enterococcus casseliflavus（vanC）3株
Enterococcus gallinarum（vanC）3株
Lactobacillus species（VCM自然耐性）1株
Pediococcus acidilactici（VCM自然耐性）1株
Weissella confusa（VCM自然耐性）1株
Leuconostoc lactis（VCM自然耐性）1株 |
| 株数 |
7株 |
11株 |
バンコマイシン耐性遺伝子（vanA, vanB, vanC）は，Dutka-Malenら11)が報告したプライマーを用いてPCRを実施し，確認した。
Figure 1
菌株の検討で用いたMiles & Misra法の各スクリーニング培地コロニー性状（Enterococcus faecalis（vanA保有））A：CH-blue（24時間培養）B：BD-VRE（48時間培養）
2024年1月～3月の期間において，細菌検査室に提出された98検体の糞便を対象とした。CH-blueとBD-VREに1 μL白金耳程度の糞便を直接塗布し，35℃好気条件下で24時間，48時間及び72時間培養後にそれぞれ菌の発育性を確認した。培地に発育した菌は，VITEK MS（ビオメリュー・ジャパン）を使用して同定を行い，Enterococcus spp.についてはDPS192iX（栄研化学）にて薬剤感受性試験を実施した。
3． CH-blue製造後の発育抑制能
CH-blueにおいて，①製造後20日経過，②製造後52日経過及び③製造後78日経過における3回のタイミングで，発育抑制能をMiles & Misra法により評価した。評価に用いた菌株は，上記1.と2.でCH-blueに発育したプラスミド性耐性遺伝子非保有Enterococcus spp. 7株を対象とした。また，3回の評価タイミングにおいて菌の発育が確認された場合は，それ以降の検討は行わなかった。
4． CH-blue孵卵器保管後の発育抑制能
CH-blueの保管条件は冷蔵保存で2℃～8℃とされているが，菌接種前のCH-blueを孵卵器内（35℃）で24及び48時間保管し，その培地における発育抑制能をMiles & Misra法により評価した。評価に用いた菌株は，上記3.で用いた7株を対象とした。
III 結果
1． 菌株を用いた検討
vanA又はvanB保有株のうち，VREの感染症法届出基準（VCM，MIC ≥ 16 μg/mL）を満たす検討菌株の結果をTable 2に示す。vanAを保有するE. faecalisは，BD-VREを用いた24及び48時間培養後にそれぞれ107及び103 CFU/mLまで，CH-blueを用いた24及び48時間培養後にどちらも104 CFU/mLまで発育を認めた。72時間培養後では，どちらの培地でも103 CFU/mLまで発育を認めた。vanBを保有するE. faeciumは，BD-VREを用いた24及び48時間培養後にそれぞれ107及び103 CFU/mLまで，CH-blueを用いた24及び48時間培養後にそれぞれ103及び102 CFU/mLまで発育を認めた。72時間培養後では，どちらの培地も48時間培養後と同様であった。以上の結果より，CH-blueを用いた方が短時間（24時間）で低濃度の菌量を検出可能であった。
Table 2 菌株を用いた検討における
vanA，
vanB保有株（感染症法届出VRE）の発育性
vanA，vanB保有株
（感染症法届出VRE） |
VCM MIC
（μg/mL） |
培養時間
（時間） |
CH-blue |
BD-VRE |
| 菌量（CFU/mL） |
菌量（CFU/mL） |
| 108 |
107 |
106 |
105 |
104 |
103 |
102 |
101 |
108 |
107 |
106 |
105 |
104 |
103 |
102 |
101 |
Enterococcus faecalis
vanA保有 |
> 16 |
24 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
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| 48 |
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+ |
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| 72 |
+ |
+ |
+ |
+ |
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+ |
− |
− |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
Enterococcus faecium
vanB保有 |
> 16 |
24 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
+ |
+ |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
| 48 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
| 72 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
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+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
薬剤感受性試験はDPS192iX，IA40MIC-i（栄研化学）を使用し，微量液体希釈法により実施した。
vanA又はvanB保有株のうち，ステルス型VRE（VCM，MIC ≤ 8 μg/mL）の検討菌株の結果をTable 3に示す。VCMのMIC 8 μg/mLのvanBを保有するE. faeciumは，BD-VREを用いた24時間培養後では108 CFU/mLでも発育を認めなかった。一方，CH-blueを用いた24時間培養後では，108 CFU/mLで発育を認めた。48時間培養後で，どちらの培地でも104 CFU/mLまで発育を認めた。VCMのMIC 2 μg/mLのE. faecium 3株は，BD-VREを用いた場合48時間培養後に105～104 CFU/mLまで，CH-blueを用いた場合72時間培養後に108～107 CFU/mLまで発育を認めた。VCMのMICが1 μg/mLのE. faeciumは，BD-VREを用いた培養で全く発育しなかったが，CH-blueを用いた場合48時間培養後に108 CFU/mLで発育を認めた。ステルス型VREは，BD-VREを用いた方が48時間以上の培養で感度良く検出された。
Table 3 菌株を用いた検討における
vanB保有株（ステルス型VRE）の発育性
vanB保有株
（ステルス型VRE） |
VCM MIC
（μg/mL） |
培養時間
（時間） |
CH-blue |
BD-VRE |
| 菌量（CFU/mL） |
菌量（CFU/mL） |
| 108 |
107 |
106 |
105 |
104 |
103 |
102 |
101 |
108 |
107 |
106 |
105 |
104 |
103 |
102 |
101 |
Enterococcus faecium
vanB保有 |
8 |
24 |
+ |
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− |
− |
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| 48 |
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+ |
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+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
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| 72 |
+ |
+ |
+ |
+ |
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− |
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− |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
− |
Enterococcus faecium
vanB保有 |
2 |
24 |
+ |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
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| 48 |
+ |
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+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
− |
| 72 |
+ |
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− |
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− |
− |
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+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
− |
− |
Enterococcus faecium
vanB保有 |
2 |
24 |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
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| 48 |
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+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
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| 72 |
+ |
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+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
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Enterococcus faecium
vanB保有 |
2 |
24 |
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| 48 |
+ |
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+ |
+ |
+ |
+ |
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| 72 |
+ |
+ |
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− |
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− |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
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− |
Enterococcus faecium
vanB保有 |
1 |
24 |
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| 48 |
+ |
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| 72 |
+ |
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プラスミド性耐性遺伝子非保有11株の結果について，Table 4，5に示す。E. faecalis ATCC29212及びvanCを保有するE. casseliflavus 3株は，どちらの培地でも発育を認めなかった。また，vanCを保有するE. gallinarumは，CH-blueを用いた48時間から72時間培養後において，2株が104 CFU/mLまで発育を認めた。一方で，BD-VREを用いた培養では発育を認めなかった。VCM自然耐性株であるLactobacillus species，Pediococcus acidilactici，Weissella confusaは全て発育を認めなかったが，Leuconostoc lactisは，72時間培養後にどちらの培地でも106 CFU/mLまで発育を認めた。したがって，CH-blueは48時間以上の培養で発育阻止能が低下することが示唆された。
Table 4 菌株を用いた検討におけるプラスミド性耐性遺伝子非保有株（
Enterococcus spp.）の発育性
プラスミド性耐性
遺伝子非保有株 |
VCM MIC（μg/mL） |
培養時間（時間） |
CH-blue |
BD-VRE |
| 菌量（CFU/mL） |
菌量（CFU/mL） |
| 108 |
107 |
106 |
105 |
104 |
103 |
102 |
101 |
108 |
107 |
106 |
105 |
104 |
103 |
102 |
101 |
Enterococcus faecalis
ATCC29212 |
2 |
24 |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
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− |
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| 48 |
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− |
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− |
− |
− |
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| 72 |
− |
− |
− |
− |
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− |
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− |
− |
− |
− |
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− |
− |
− |
− |
Enterococcus casseliflavus
（3株）vanC保有 |
4 |
24 |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
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− |
− |
− |
− |
− |
− |
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| 48 |
− |
− |
− |
− |
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− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
| 72 |
− |
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− |
− |
− |
− |
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− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
Enterococcus gallinarum
vanC保有 |
8 |
24 |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
| 48 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
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− |
− |
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− |
− |
− |
− |
− |
| 72 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
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− |
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− |
− |
− |
− |
− |
− |
Enterococcus gallinarum
vanC保有 |
8 |
24 |
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− |
− |
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− |
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− |
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− |
− |
− |
− |
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| 48 |
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| 72 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
− |
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− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
Enterococcus gallinarum
vanC保有 |
4 |
24 |
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− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
− |
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| 48 |
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− |
− |
− |
− |
− |
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| 72 |
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− |
Table 5 菌株を用いた検討におけるプラスミド性耐性遺伝子非保有株（VCM自然耐性株）の発育性
| VCM自然耐性株 |
VCM MIC（μg/mL） |
培養時間（時間） |
CH-blue |
BD-VRE |
| 菌量（CFU/mL） |
菌量（CFU/mL） |
| 108 |
107 |
106 |
105 |
104 |
103 |
102 |
101 |
108 |
107 |
106 |
105 |
104 |
103 |
102 |
101 |
| Lactobacillus species |
> 16 |
24 |
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− |
− |
− |
− |
− |
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| 48 |
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| 72 |
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− |
− |
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− |
− |
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− |
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| Pediococcus acidilactici |
> 16 |
24 |
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− |
− |
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| 48 |
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| 72 |
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| Weissella confusa |
> 16 |
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| 48 |
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| 72 |
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− |
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− |
− |
− |
− |
| Leuconostoc lactis |
> 16 |
24 |
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| 48 |
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| 72 |
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+ |
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今回用いた98検体の糞便内に，VREスクリーニング培地の検出目的であるvanA又はvanB保有株は検出されなかった。Table 6に培養時間による菌体種別の発育阻止能の結果を示す。24時間培養後で，CH-blueを用いた場合，vanCを保有するE. gallinarum 1株の発育を認めたが，BD-VREではいずれの菌体も発育を認めなかった。72時間培養後で，CH-blueの場合，vanCを保有するE. gallinarum 3株，E. casseliflavus 3株，耐性因子を保有しないE. faecium 1株などの菌株発育を認めたが，一方でBD-VREを用いた場合，Enterococcus spp.の発育を認めず，その他のグラム陰性桿菌やVCM自然耐性株の発育を認めた。72時間培養後の発育阻止能は，CH-blueが90.8%，BD-VREが94.9%であり，BD-VREは発育阻止能が優れていると示唆された。
Table 6 臨床材料を用いた培養時間（24，48，72時間経過）による発育阻止能
|
培養時間（時間） |
発育阻止能 |
発育菌株 |
株数 |
VCM MIC
(μg/mL) |
| CH-blue |
24 |
99.0% |
Enterococcus gallinarum |
1 |
8 |
| 48 |
92.9% |
Enterococcus gallinarum |
2 |
4–8 |
| Enterococcus casseliflavus |
2 |
4 |
| Enterococcus faecium |
1 |
≤ 0.5 |
| Enterococcus spp. 以外 ＊1 |
2 |
NT |
| 72 |
90.8% |
Enterococcus gallinarum |
3 |
4–8 |
| Enterococcus casseliflavus |
3 |
4 |
| Enterococcus faecium |
1 |
≤ 0.5 |
| Enterococcus spp. 以外 ＊1 |
2 |
NT |
| BD-VRE |
24 |
100% |
― |
― |
― |
| 48 |
98.0% |
Enterococcus spp. 以外 ＊2 |
2 |
NT |
| 72 |
94.9% |
Enterococcus spp. 以外 ＊3 |
5 |
NT |
―：発育なし NT : Not tested
＊1：Candida fermentati，Lactobacillus species
＊2：Brucella intermedia，Stenotrophomonas maltophilia
＊3：Brucella intermedia，Stenotrophomonas maltophilia，Burkholderia cenocepacia，Lactobacillus species，Weissella confusa
Table 7にプラスミド性耐性遺伝子非保有Enterococcus spp. 7株に対する発育抑制能の時間的変化の結果を示す。①製造後20日経過でE. gallinarum 3株の発育を認めた。VCMのMICが8 μg/mLのE. gallinarum 1株は，24時間培養後に発育を認めた。また，③製造後78日経過すると，E. casseliflavusが24時間培養後に1株，72時間培養後に1株の発育が確認された。したがって，CH-blueは日数が経過するにつれて発育抑制能が低下する可能性が示唆された。
Table 7 プラスミド性耐性遺伝子非保有株（
Enterococcus spp.）に対するCH-blue製造後の発育抑制能
| 菌株 |
VCM MIC
（μg/mL） |
①製造後20日 |
②製造後52日 |
③製造後78日 |
| 24時間 |
48時間 |
72時間 |
24時間 |
48時間 |
72時間 |
24時間 |
48時間 |
72時間 |
| Enterococcus gallinarum |
8 |
106 |
105 |
105 |
× |
× |
| Enterococcus gallinarum |
8 |
― |
― |
107 |
× |
× |
| Enterococcus gallinarum |
4 |
― |
― |
107 |
× |
× |
| Enterococcus casseliflavus |
4 |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
108 |
108 |
108 |
| Enterococcus casseliflavus |
4 |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
108 |
| Enterococcus casseliflavus |
4 |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
| Enterococcus faecium |
≤ 0.5 |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
―：発育なし ×：未検査
発育した菌株はMiles & Misra法にて発育を認めた菌量（CFU/mL）を示した。
Table 8にプラスミド性耐性遺伝子非保有Enterococcus spp. 7株に対するCH-blue孵卵器保管後の発育抑制能の結果を示す。①孵卵器24時間保管した場合，菌接種から24時間培養後にE. gallinarum（VCM, MIC 8 μg/mL）1株の発育を認めた。さらに，48時間培養後にE. gallinarum 2株（VCM，MIC 8 μg/mL 1株，4 μg/mL 1株）の発育を認めた。②孵卵器48時間保管した場合，24時間培養後にE. gallinarum 3株の発育を認めた。したがって，CH-blueは35℃および24時間以上の保存によって発育抑制能が低下する可能性が示唆された。
Table 8 プラスミド性耐性遺伝子非保有株（
Enterococcus spp.）に対するCH-blue孵卵器保管後の発育抑制能
| 菌株 |
VCM MIC
（μg/mL） |
①孵卵器24時間保管後 |
②孵卵器48時間保管後 |
| 24時間 |
48時間 |
72時間 |
24時間 |
48時間 |
72時間 |
| Enterococcus gallinarum |
8 |
106 |
104 |
104 |
105 |
105 |
104 |
| Enterococcus gallinarum |
8 |
― |
107 |
106 |
108 |
107 |
106 |
| Enterococcus gallinarum |
4 |
― |
107 |
105 |
108 |
107 |
104 |
| Enterococcus casseliflavus |
4 |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
| Enterococcus casseliflavus |
4 |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
| Enterococcus casseliflavus |
4 |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
| Enterococcus faecium |
≤ 0.5 |
― |
― |
― |
― |
― |
― |
―：発育なし
発育した菌株はMiles & Misra法にて発育を認めた菌量（CFU/mL）を示した。
IV 考察
本研究では，新規のVREスクリーニング培地であるCH-blueが，VREの早期検出において有用であることを示した。特に，VREの感染症法届出基準（VCM，MIC ≥ 16 μg/mL）を満たすvanA又はvanB保有のE. faecium及びE. faecalisは，CH-blueで24時間培養後の発育が良好で視認性に優れ，低濃度の菌量でも発育を認めた。したがって，BD-VREと比較してCH-blueの方がより迅速なスクリーニングが可能であると考えられた。
一方で，CH-blueはステルス型VRE（VCM, MIC ≤ 8 μg/mL）の検出感度が低いという課題がある。vanB保有E. faeciumは，CH-blueにおいて72時間培養後に106 CFU/mLで20%（1/5株）の発育を認め，発育した1株はVCMのMICが8 μg/mLとステルス型VREの中では高いMICを示す株であった。したがって，CH-blueは72時間培養後でもVCMのMICが2 μg/mL以下のステルス型VREを見逃す可能性が高いことが示唆された。一方，これらの菌株はBD-VREにおいて，72時間培養後に104 CFU/mLで80%（4/5株）の発育を認め，検出感度が優れていた。これはBD-VREに含まれる特徴的な成分に由来することが考えられる。VCMの作用機序は，ペプチドグリカン前駆体のD-Ala4-D-Ala5部分に結合することで，架橋反応を阻害し細胞壁合成を停止させることである。しかし，VREではD-Ala4-D-Ala5部分の5番目のD-Ala5が，D-lactate（主にvanAやvanB）に置換されるためVCMが結合できずVCM耐性となる13)。BD-VREは，D-Ala4-D-Ala5ligaseを抑制するD-cycloserineやD-Ala4-D-lactate5ligaseの基質であるD-lactate成分を含むため，VCMの感受性が高いVREの分離を可能にしている14)。したがって，ステルス型VREはBD-VREを用いた方が48時間以上の培養で高感度の検出が可能となると考えられた。
また，本研究において，CH-blueは48時間以上の培養で，vanCを保有するE. gallinarumやE. casseliflavusの発育を認め，発育抑制能が低下することが示唆された。CH-blueはメーカー推奨の培養時間が24時間であり，48時間以上の培養を行うと選択性が低下する可能性が考えられた。さらに，CH-blue製造後の発育抑制能の検討では，製造後20日経過でE. gallinarumが3株発育し，このうち2株はVCMのMICが8 μg/mLであった。したがって，VCMのMICが8 μg/mLの株は，製造直後の培地でも発育する可能性が高いことが考えられた。また，有効期限が迫ったCH-blueは，さらに発育抑制能が低下し，VCMのMICが4 μg/mLの株でも発育すると考えられた。そのため，CH-blue孵卵器保管後の発育抑制能の検討を実施したところ，孵卵器に24時間保管されたCH-blueで3株のE. gallinarumが発育し，このうち1株は24時間培養後に発育を認めた。また，孵卵器に48時間保管されたCH-blueで，菌接種から24時間培養後に3株のE. gallinarumが発育を認めた。したがって，24時間以上の孵卵器保管で発育抑制能が低下する可能性が考えられた。CH-blueは酵素基質によりvanA及びvanBの存在でコロニーを青色に発色させ，VCMなどの選択剤で夾雑菌を抑制することでスクリーニングを可能としている9)。CLSIではVCM選択培地としてVCM 6 μg/mL以上を含有する培地を推奨しているため15)，CH-blueもVCMは6 μg/mL以上含有していると推定される。また，VCMは加湿及び加温により力価が低下するとの報告がある16)。孵卵器内は加湿及び加温状態であるため，培地を器内で48及び72時間培養するとVCMの力価が低下することが推定される。したがって，CH-blueを用いた48時間以上の培養では発育抑制能が低下し，かつ製造後日数が経過した場合でも同様に，VCMの力価の影響により発育抑制能が低下すると考えられた。
Figure 2は2019年1月から2023年12月に当院で分離されたE. gallinarum及びE. casseliflavusにおけるVCMのMIC分布を示している。E. gallinarum及びE. casseliflavusのVCMに対するMIC平均値は，それぞれ4.01 μg/mL及び3.25 μg/mLであり，E. gallinarumの方が耐性傾向を認めることが示唆された。したがって，E. gallinarumは，BD-VREと比較してCH-blueに発育する頻度が高くなる可能性が推察された。
VREスクリーニング培地はプラスミド性耐性遺伝子であるvanAやvanBを保有するEnterococcus spp.を感度良く検出し，vanCを保有するE. gallinarumやE. casseliflavusの発育を抑制することが求められる。CH-blueは，感染症法届出基準を満たすvanAまたはvanB保有のVREの検出に，迅速性や視認性という点で優れていたが，ステルス型VREの検出感度が低く，見逃される可能性が高いことが示唆された。さらに，vanCを保有するE. gallinarumやE. casseliflavusは，48時間以上の培養で発育抑制されなかった。したがって，CH-blueは，感染症法届出VREの24時間での迅速検出に使用可能と考えられる。一方で，BD-VREは48時間以上の培養でステルス型VREの検出やプラスミド性耐性遺伝子非保有株の発育抑制に優れた培地であった。以上を踏まえ，VREスクリーニング培地を使用する際は，各培地の特性を理解し，判定期日や施設の検査状況に応じて選択する必要があると考えられる。
V 結語
新規のVREスクリーニング培地であるCH-blueは感染症法届出VREの24時間での迅速な検出に有用であることが示唆された。一方で，BD-VREは，ステルス型VREの検出やプラスミド性耐性遺伝子非保有株の発育抑制能に優れていた。本研究のこのような結果を踏まえ，それぞれの培地特性を考慮し，状況に応じて適切な培地選択を行うことが重要であると考えられた。
本研究は，熊本大学倫理審査委員会の承認を受けた（倫理第3222号）。
COI開示
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
