Autophagy in megakaryocyte and platelet

Abstract

オートファジーは，細胞が機能や恒常性を維持する目的で細胞内のオルガネラや分子を分解する為の，細胞内輸送，分解処理，再利用機構である．巨核球およびその娘細胞である血小板には，オートファジー機構が備わっている．オートファジーにより造血幹細胞から巨核球への分化過程や，血小板の機能が制御されていることが明らかとなっている．

1．Autophagy（オートファジー・自食）

オートファジーが初めて認識されたのは1963年である．肝臓の肝細胞は飢餓に誘発されると，細胞内のタンパク質を分解しアミノ酸を産生する．このようなサンプルを電子顕微鏡で観察した場合，細胞内に二重膜構造により区画された細胞質がリソソームで分解される過程が見いだされた．この現象はオートファジーと命名された．その後，1997年に，オートファジーに関わる遺伝子（APG1）と蛋白（Apg1）が同定され^1），引き続いて変異酵母の研究で，複数のオートファジー関連遺伝子（autophagy-related genes: ATGs）が同定された^2）．最終的にほぼすべてのATGは，哺乳類にもカウンターパートがあることが見いだされた^3）．哺乳類ではより多くの関連蛋白を必要とするが，オートファジーの基本的しくみと階層性は，単細胞から多細胞真核生物種まで保持されていることが明らかとなった^{3, 4）}．現在では，哺乳類ではほぼすべての細胞・組織における，様々な機能や生存にとって必要な物質循環の過程であると考えられている．現在オートファジーは，細胞内の膜動態を介した細胞内物質輸送機構（標的物質の選別），大規模分解機構，分解産物の再利用／処理機構を含む細胞内システムと捉えられている．そしてこの機構を利用して，細胞は様々な活動を行い，生存に必要な恒常性が維持され，生理機能に関わっている^5）．オートファジーは全身の細胞や組織で検出されており，個体レベルでは当然，発生や様々な疾病との関連が示唆されている^5）．

2．オートファジーを駆動させるメカニズム

マクロオートファジー（表1上段）：ある標的物質（カーゴと呼ばれる）をオートファゴソームが取り囲み，リソソームと融合することにより標的物質のみを分解する過程をマクロオートファジーと呼ぶ．一般にオートファジーと称される場合はマクロオートファジーを意味することが多い．隔離膜形成から始まり，オートファゴソーム形成（基質隔離），リソソームとの融合，リソソーム内の加水分解酵素による基質分解，が一連の過程である．マクロオートファジーに必要な遺伝子群であるATGsは，オートファゴソームの形成，成熟，分解の過程，選択的基質の認識など各過程に関わる遺伝子が広く含まれる．ATG1–10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 29, 31はオートファゴソーム形成に必須な遺伝子である^6）．標的物質により選別過程は異なることがあり，タンパク質凝集体，変性ミトコンドリア，細胞内侵入細菌などは，ユビキチン依存的にオートファゴソーム形成部位に集積し，選択的にオートファゴソームに取りこまれると考えられている．

表1

オートファジーの種類と過程

種類	基質	必要遺伝子	過程
マクロ オートファジー	（不良）タンパク質 細胞内小器官 細胞内侵入細菌	ATG遺伝子群 Stx17 など
ミクロ オートファジー	タンパク質 細胞内小器官	HSPA8など
シャペロン介在性 オートファジー	タンパク質	LAMP2A HSPA8 など

ミクロオートファジーとシャペロン介在性オートファジー（表1　中下段）：隔離膜形成の介在なく，リソソームと基質が直接会合する過程．シャペロン介在性では，基質となる変性タンパクは，HSPA8などによってタグ付けされ，リソソーム膜上のLAMP2Aを介してリソソームにとりこまれ，分解を受ける^7）．

リソソーム：オートファジーに共通する分解機構を担うリソソームは，血小板内では直径200～250 nm台の細胞内小器官で，一つの血小板細胞質に3個未満で含まれる．内部は酸性に保たれ酸性領域に至適pHを持つ60種類以上の加水分解酵素群が含まれる．リソソーム活性およびその動態を制御する転写因子としてTFEBが知られている^8）．リソソーム自体も球状から管状に形態を変え^9），リソソーム自身も損傷を受けた場合にオートファジーにより分解される（リソファジー）^10）．

3．巨核球造血と血小板産生

骨髄中の造血幹細胞は，主にTPO/c-MPLシグナルにより巨核球へと分化する^11）．複数の転写因子（SCL, GATA1, RUNX1, GATA2, NF-E2, FOG1, PU.1, Fli-1）がこの過程を制御している^12）（図1A　左側）．最終的に成熟した巨核球は，血管外より血管内へ胞体突起（proplatelet）を伸ばし，血管内へ血小板前駆体（fragment of proplatelet, preplatelet）を放出する^13–16）．その後，血管内で成熟した血小板へと変化する．この時，胞体突起は血管外（骨髄髄質：コラーゲンなどの細胞外基質が豊富）から内皮細胞を超えて，血管内へ「存在の場」を変える為に，胞体突起や新生血小板が活性化を受けない仕組みが必要となると想定される（図1A中央部）．また巨核球から切り離された時点では，新生血小板は血小板機能サイズやオルガネラ数において不均一な細胞集団である^{13, 16）}．この過程において，巨核球はあえて細胞分裂を精密に遂行するには不利な場（流血中）で短時間に数千の娘細胞（新生血小板）を細胞質分裂により産生している．この後，個々の新生血小板で細胞分裂が行われサイズの調整が行われることになる（図1A右側）．同時にオルガネラの数も適切に調整されている可能性が高いがそのメカニズムにオートファジーが関与している可能性がある．最終的にはオルガネラの数や種類も整えられた成熟血小板となる．肺において巨核球が血小板を産生している可能性が示唆されている^{17, 18）}．興味深いことに，肺での血小板産生時，巨核球は既に肺静脈の血管内にいて胞体突起を形成する^17）．いずれにしろ流血中で行われる過程には乱流など物理的要素が関与する^19）．

図1

血小板産生過程とオートファジー不全マウス

A．巨核球の・血小板産生過程

B．各オートファジー不全マウスの共通するフェノタイプ（破線部）

4．巨核球・血小板とマクロオートファジー

ヒト，マウスの巨核球と血小板はマクロオートファジーを駆動させる機構を持つ^20）．造血幹細胞から巨核球への分化には複数の細胞分裂期を経る．細胞分裂期（M期）にはオートファジーが強く抑制されるので，この間オートファジー活性は常に一定では無く時期により大きく変化していると考えられる．以下にオートファジー不全マウスのフェノタイプを記す（図1B）．全身性にBeclin1発現低下（Becn1+/– heterozygous）マウスでは，血小板の機能が低下する^20）．Beclin1は，当初bcl2結合タンパク質として見いだされたが，マクロオートファジーの隔離膜形成やエンドサイトーシスに必須な分子であり，ここでオートファジーと血小板機能の関係が初めて着目されたが，血管内皮細胞などでも低下している影響が否定できなかった．

多数のATGタンパク質の中でATG7もオートファゴソーム形成に関わる．造血幹細胞のATG7を除去したマウス（Atg7 ^f/f×Vav-Cre）では，巨核球数と血小板数が低下する^21）．巨核球は形態的に細胞質の大型の空胞が増加，また不良ミトコンドリアの除去不全（マイトファジー不全）によると考えられる活性酸素種の増加が生じる．これらのオートファジー不全により巨核球分化と増殖が抑制されると考えられている．また産生された血小板は，サイズが大型の割合のものが増加している．血小板機能検査では，出血時間は延長，トロンビンによる血小板凝集低下，CD62P表出レベルとインテグリンaIIbβ3の活性化低下，など血小板活性化能の全般が低下する^21）．

巨核球特異的にATG7を除去したマウス（Atg7 ^f/f×PF4-Cre）では，巨核球造血は正常で，血小板数は低下していない^22）．興味深いことに血小板サイズは正常であるが顆粒内容物が少ない．上述のマウス同様，機能の低下した血小板が産生されている．LC3-IIはオートファジー膜結合タンパク質で，オートファジーが駆動すると隔離膜やオートファゴソーム膜の2重膜の内外膜上に局在化する．リソソームにより内膜側のLC3-IIは分解されるが，外膜側のLC3-IIは分解を免れる為に，LC3-IIの減少はオートファゴソームの定量の指標となる．血小板をアゴニスト刺激すると血小板活性化とLC3-IIの減少が同時に起こることにより，血小板活性化過程でオートファジーは同期して生じていると考えられた^22）．血小板の活性化が落ちる理由は，オートファジー不全により「分解されるべき何らかの基質が残る」可能性が疑われた^22）．一方，ATGタンパク質などオートファゴソーム形成の分子機構は他の膜輸送機構分子とは異なると考えられている．しかしオートファゴソームとリソソームの融合には，Rab蛋白質やSNAREタンパク質（膜融合機能）が関与する．ATG7を除去することにより，RabやSNAREの機能に影響を与えている可能性は残されている．

進展中の隔離膜やオートファゴソームの膜にはホスファチジルイノシトール3－リン酸（phosphatidylinositol 3-phosphate: PI3P）が含まれており，オートファゴソームの形成の場でのPI3Pの産生が必要である．Vps34はホスファチジルイノシトール3－キナーゼ（PI3Pキナーゼ：PI3K）であり，Vps15及びBeclin1らと複合体を形成し，PI3P産生とPI3P結合タンパク質を介し次の隔離膜形成ステップにつなぐ．加えてエンドゾーム輸送経路やmTOR活性化等，複数の膜輸送系やシグナル伝達に関わる．巨核球のVps34を除去したマウス（VPS ^f/f×PF4-Cre）では，巨核球内のPI3P量は30～40％まで低下する．巨核球数は正常であるが，血小板産生能力は低下しており血小板数が低下する^23）．血小板産生低下の理由の一つとして，巨核球のSDF-1の濃度勾配への方向反応性が低下し，静脈洞外（血管外）での血小板放出が生じている可能性がある．また，血小板のサイズは低下する^23）．α顆粒のサイズは大型になるが数は減る．濃染顆粒も数が減る．フィブリノーゲンとmpl（トロンボポエチンレセプター）等のエンドサイトーシスが低下している．そしてagonist刺激による顆粒放出が亢進しているが，血栓形成能が低下しているなどの変化を認める．これらの機能変化はエンドゾーム経路における膜輸送障害により生じていると考えられる．

Nix（BNIP3L）は，小胞体やミトコンドリア外膜に局在するBCL2関連膜蛋白質で，LC3と結合するLIRドメイン構造を持つ．全身でNixを欠損するマウス（Nix–/–）の赤血球は成熟後もミトコンドリアが残存し，ミトコンドリアのオートファジー（マイトファジー）による除去が低下している^24）．全身でNixを欠損するマウス（Nix–/–）の巨核球数は正常であるが，血小板数は増加している^25）．Nixはマイトファジーを介して，血小板のミトコンドリアの品質管理を行っていることが明らかとなった．つまりマイトファジーが低下すると，不良ミトコンドリアが残り活性酸素種（ROS）が増加する結果，血小板の機能が落ちることになる．血小板の寿命を規定する因子として，ミトコンドリアタンパク質BCL-XLが知られている．個々の血小板内で，BCL-XLとBakとのバランスでアポトーシスを介した細胞死が血小板の寿命を規定している^26）．しかしミトコンドリアのBCL-XLは残る為に，血小板寿命は延長し，血小板数増加につながる．一方でROSにより血小板機能は低下しており，アゴニスト刺激下での血小板凝集能が低下し，生体内での血栓形成遅延を呈する．以上よりオートファジー減少状態で作られる血小板の機能は，基本的に低下すると考えられる．

それではオートファジー亢進状態では血小板機能はどうなるのか．血小板は常に一定のオートファジーを行っている（basal autophagy fluxと呼ばれる）．血小板浮遊液より栄養を取り除き飢餓状態にすると，血小板のオートファジーはbasal fluxよりも増加し，アゴニスト刺激による血小板凝集能は低下する．またカルシウム動員，顆粒放出，粘着能も低下する．この条件にオートファジー阻害剤や栄養剤を加えると血小板凝集能は低下しない．つまり栄養飢餓に伴うオートファジーの亢進は，血小板の活性化と凝集能を低下させると考えられる^27）．

これらは，マクロオートファジーが巨核球造血と血小板産生・成熟過程での血小板活性化能の獲得に深い関与があることを示している^28）．しかしマクロオートファジーと血小板機能を駆動する複雑分子群や膜輸送システムの関係については，ごく一部しか検討されていない．またこれらの研究は主にマクロオートファジーに関与するATG遺伝子を操作してオートファジー不全を作出しており，ミクロ／シャペロン介在性オートファジーの関与に関しては不明な点が多い．

5．ITPとオートファジー

免疫性血小板減少症（immune thrombocytopenia: ITP）の病態の主体は，血小板に対する自己抗体により血小板の破壊や貪食が亢進した結果，血小板の寿命短縮と血小板数減少に至ると考えられている．ITPの自己免疫疾患としての病態が巨核球や血小板のオートファジーを変化させる可能性がある^29）．

ITP患者の（自己抗体の結合した）血小板はオートファジーが低下していて，オートファジー自体は血小板に保護的に働く．つまり自己抗体で血小板のオートファジーが低下するので，治療としてオートファジーを増加させた方が良いと考えられる^30）．また他の細胞のようにオートファジーにおいては，mammalian target of rapamycin（mTOR）が抑制シグナルを，class III PtdIns3Kが亢進シグナルを担う^30）．一方でITP患者ではオートファゴソームを持つ血小板の割合が有意に増加するとする報告もある^31）．ヒト同様にマウスITPモデルでも胞体突起，新生血小板にしばしば形態的なオートファジー過程を確認できる（図2B）．そしてこの現象を利用して他の血小板減少症と鑑別診断に利用できる^31）．しかしこのオートファゴソームの増加が，新生血小板のオートファジーフラックス亢進を反映しているのか，抗血小板抗体によるオートファジーフラックスの低下を反映しているのか明らかでない．

図2

巨核球・血小板とオートファジー

A．想定されているオートファジーの関与

B．胞体突起と幼弱血小板内の形態的オートファジー

抗血小板抗体を投与後の血小板回復期のマウス．

左）骨髄静脈洞内へ延びる胞体突起中に認めるオートリソソーム．

右）血小板回復期の血小板に認める小胞体とオートファゴソーム．

巨核球に対する自己抗体の影響についてはどうか．ITPの一部の患者では自己抗体による巨核球のアポトーシスや血小板産生低下の可能性が示唆されてきた．ITP患者の血漿を添加して培養した巨核球系の細胞株はオートファジーが亢進しアポトーシスが減少する^32）．つまり自己抗体により巨核球のオートファジーが亢進しアポトーシスによる巨核球の細胞死を防ぎ，保護的な役割に働く可能性がある．

mTORはオートファジーを抑制する分子である．mTOR阻害剤であるラパマイシンは，オートファゴソーム形成を促し，オートファジーを亢進させる．確かにITP患者にラパマイシンを投与すると血小板は増加する^33–35）．また，輸血用に採血後のヒト血小板は，経時的に，ROS，受容体の切断・遊離，アポトーシスが増加して，凝集能も低下する．同時にオートファジーフラックスを計測すると48時間までにbasal autophagy fluxを認めるが，その後basal autophagy fluxは急激に低下，消失してゆく．ラパマイシン添加によりbasal autophagy fluxは72時間まで亢進・延長し，ROS，受容体の切断・遊離，アポトーシス細胞の増加は抑制され，凝集能の低下も穏やかになる^36）．一方，リソソームのpHを上げてオートファジーを抑制するクロロキンも，ITP患者に投与すると血小板増加効果を示す^37–39）．しかしラパマイシンやクロロキンは，血小板のみならずT細胞やサイトカインを含む免疫環境にも大きく影響し，複合的に治療効果を生んでいる可能性がある^40）．

6．今後の課題

これまでの研究から，オートファジーの強さ（オートファジーフラックス）は，巨核球・血小板系の各分化成熟段階において変化し，その役割と目的が変化してゆくと考えられる（図2A）．一方，従来の巨核球と血小板のオートファジー解析は，主にマクロオートファジーについての解析である．ミクロ・シャペロン介在性オートファジーの役割は何か？新生血小板内で分解処理される蛋白質・オルガネラの種類は何か？それがどのように血小板活性化能の獲得につながるのか？など疑問と謎は残る．これらの解明には，今後のオートファジー研究のツールの充実と^41），血小板・巨核球の生物学的解析がより必要であると考えられる．

著者の利益相反（COI）の開示：

伊藤薫樹：講演料・原稿料など（サノフィ，ブリストル，ヤンセン，武田，ファイザー），臨床研究（治験）（サノフィ，ヤンセン，ファイザー，キッセイ），研究費（受託研究，共同研究，寄付金等）（明治製菓ファルマ）

その他の著者の利益相反の開示：

本論文発表内容に関連して開示すべき企業等との利益相反なし

文献

• 1)   Matsuura  A,  Tsukada  M,  Wada  Y, et al.: Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene 192: 245–250, 1997. doi: 10.1016/s0378-1119(97)00084-x.
• 2)   Klionsky  DJ,  Cregg  JM,  Dunn  WA Jr., et al.: A unified nomenclature for yeast autophagy-related genes. Dev Cell 5: 539–545, 2003. doi: 10.1016/s1534-5807(03)00296-x.
• 3)   Feng  Y,  He  D,  Yao  Z, et al.: The machinery of macroautophagy. Cell Res 24: 24–41, 2014. doi: 10.1038/cr.2013.168.
• 4)   Koyama-Honda  I,  Itakura  E,  Fujiwara  TK, et al.: Temporal analysis of recruitment of mammalian ATG proteins to the autophagosome formation site. Autophagy 9: 1491–1499, 2013. doi: 10.4161/auto.25529.
• 5)   Mizushima  N,  Levine  B: Autophagy in human diseases. N Engl J Med 383: 1564–1576, 2020. doi: 10.1056/NEJMra2022774.
• 6)   Nakatogawa  H,  Suzuki  K,  Kamada  Y, et al.: Dynamics and diversity in autophagy mechanisms: Lessons from yeast. Nat Rev Mol Cell Biol 10: 458–467, 2009. doi: 10.1038/nrm2708.
• 7)   Wang  L,  Klionsky  DJ,  Shen  HM: The emerging mechanisms and functions of microautophagy. Nat Rev Mol Cell Biol 24: 186–203, 2023. doi: 10.1038/s41580-022-00529-z.
• 8)   Brady  OA,  Martina  JA,  Puertollano  R: Emerging roles for TFEB in the immune response and inflammation. Autophagy 14: 181–189, 2018. doi: 10.1080/15548627.2017.1313943.
• 9)   Yang  C,  Wang  X: Lysosome biogenesis: Regulation and functions. J Cell Biol 220: e202102001, 2021. doi: 10.1083/jcb.202102001.
• 10)   Papadopoulos  C,  Kravic  B,  Meyer  H: Repair or lysophagy: Dealing with damaged lysosomes. J Mol Biol 432: 231–239, 2020. doi: 10.1016/j.jmb.2019.08.010.
• 11)   Hitchcock  IS,  Kaushansky  K: Thrombopoietin from beginning to end. Br J Haematol 165: 259–268, 2014. doi: 10.1111/bjh.12772.
• 12)   Eto  K,  Kunishima  S: Linkage between the mechanisms of thrombocytopenia and thrombopoiesis. Blood 127: 1234–1241, 2016. doi: 10.1182/blood-2015-07-607903.
• 13)   Thon  JN,  Montalvo  A,  Patel-Hett  S, et al.: Cytoskeletal mechanics of proplatelet maturation and platelet release. J Cell Biol 191: 861–874, 2010. doi: 10.1083/jcb.201006102.
• 14)   Thon  JN,  Italiano JE  Jr.: Does size matter in platelet production? Blood 120: 1552–1561, 2012. doi: 10.1182/blood-2012-04-408724.
• 15)   Kowata  S,  Isogai  S,  Murai  K, et al.: Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thromb Haemost 112: 743–756, 2014. doi: 10.1160/TH14-02-0123.
• 16)   Kowata  S, Ishida Y: Megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Autoimmune thrombocytopenia. Springer Science Business Media 9–19, 2017.
• 17)   Lefrançais  E,  Ortiz-Muñoz  G,  Caudrillier  A, et al.: The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature 544: 105–109, 2017. doi: 10.1038/nature21706. Epub 2017 Mar 22.
• 18)   Lefrançais  E,  Looney  MR: Platelet biogenesis in the lung circulation. Physiology (Bethesda) 34: 392–401, 2019. doi: 10.1152/physiol.00017.2019.
• 19)   Ito  Y,  Nakamura  S,  Sugimoto  N, et al.: Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell 174: 636–648.e18, 2018. doi: 10.1016/j.cell.2018.06.011.
• 20)   Feng  W,  Chang  C,  Luo  D, et al.: Dissection of autophagy in human platelets. Autophagy 10: 642–651, 2014. doi: 10.4161/auto.27832.
• 21)   Cao  Y,  Cai  J,  Zhang  S, et al.: Loss of autophagy leads to failure in megakaryopoiesis, megakaryocyte differentiation, and thrombopoiesis in mice. Exp Hematol 43: 488–494, 2015. doi: 10.1016/j.exphem.2015.01.001.
• 22)   Ouseph  MM,  Huang  Y,  Banerjee  M, et al.: Autophagy is induced upon platelet activation and is essential for hemostasis and thrombosis. Blood 126: 1224–1233, 2015. doi: 10.1182/blood-2014-09-598722.
• 23)   Valet  C,  Levade  M,  Chicanne  G, et al.: A dual role for the class III PI3K, Vps34, in platelet production and thrombus growth. Blood 130: 2032–2042, 2017. doi: 10.1182/blood-2017-04-781641.
• 24)   Sandoval  H,  Thiagarajan  P,  Dasgupta  SK, et al.: Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells. Nature 454: 232–235, 2008. doi: 10.1038/nature07006.
• 25)   Zhang  W,  Ma  Q,  Siraj  S, et al.: Nix-mediated mitophagy regulates platelet activation and life span. Blood Adv 3: 2342–2354, 2019. doi: 10.1182/bloodadvances.2019032334.
• 26)   Mason  KD,  Carpinelli  MR,  Fletcher  JI, et al.: Programmed anuclear cell death delimits platelet life span. Cell 128: 1173–1186, 2007. doi: 10.1016/j.cell.2007.01.037.
• 27)   Paul  M,  Hemshekhar  M,  Kemparaju  K, et al.: Aggregation is impaired in starved platelets due to enhanced autophagy and cellular energy depletion. Platelets 30: 487–497, 2019. doi: 10.1080/09537104.2018.1475630.
• 28)   Cao  Y,  Cai  J,  Zhang  S, et al.: Loss of autophagy leads to failure in megakaryopoiesis, megakaryocyte differentiation, and thrombopoiesis in mice. Exp Hematol 43: 488–494, 2015. doi: 10.1016/j.exphem.2015.01.001.
• 29)   Sun  RJ,  Shan  NN: Megakaryocytic dysfunction in immune thrombocytopenia is linked to autophagy. Cancer Cell Int 19: 59, 2019. doi: 10.1186/s12935-019-0779-0.
• 30)   Wang  CY,  Ma  S,  Bi  SJ, et al.: Enhancing autophagy protects platelets in immune thrombocytopenia patients. Ann Transl Med 7: 134, 2019. doi: 10.21037/atm.2019.03.04.
• 31)  Otsu, A,  Kowata  S,  Seki  Y, et al.: Autophagosome-rich platelets are increased in immune thrombocytopenia. Journal of Iwate Medical Assiociation 72: 103–113, 2020. doi: 10.24750/IWATEISHI.72.3_103.
• 32)   Liu  Z,  Mei  T: Immune thrombocytopenia induces autophagy and suppresses apoptosis in megakaryocytes. Mol Med Rep 18: 4016–4022, 2018. doi: 10.3892/mmr.2018.9373.
• 33)   Shan  NN,  Dong  LL,  Zhang  XM, et al.: Targeting autophagy as a potential therapeutic approach for immune thrombocytopenia therapy. Crit Rev Oncol Hematol 100: 11–15, 2016. doi: 10.1016/j.critrevonc.2016.01.011.
• 34)   Li  J,  Wang  Z,  Dai  L, et al.: Effects of rapamycin combined with low dose prednisone in patients with chronic immune thrombocytopenia. Clin Dev Immunol 2013: 548085, 2013. doi: 10.1155/2013/548085.
• 35)   Wang  D,  Cassady  K,  Zou  Z, et al.: Progress on the efficacy and potential mechanisms of rapamycin in the treatment of immune thrombocytopenia. Hematology 27: 1282–1289, 2022. doi: 10.1080/16078454.2022.2151230.
• 36)   Zhao  X,  Zhao  Y,  Ding  Y, et al.: Autophagy ameliorates reactive oxygen species-induced platelet storage lesions. Oxid Med Cell Longev 5: 1898844, 2022. doi: 10.1155/2022/1898844.
• 37)   Brik-Simon  D,  Efros  O,  Levinsky  Y, et al.: Excellent response to treatment with hydroxychloroquine in pediatric patients with SLE-related immune thrombocytopenia. Pediatr Blood Cancer 71: e30911, 2024. doi: 10.1002/pbc.30911.
• 38)   Roche  O,  Aladjidi  N,  Rakotonjanahary  J, et al.: Evaluation of the efficiency of hydroxychloroquine in treating children with immune thrombocytopenia (ITP). Am J Hematol 92: E79–E81, 2017. doi: 10.1002/ajh.24698.
• 39)   Khellaf  M,  Chabrol  A,  Mahevas  M, et al.: Hydroxychloroquine is a good second-line treatment for adults with immune thrombocytopenia and positive antinuclear antibodies. Am J Hematol 89: 194–198, 2014. doi: 10.1002/ajh.23609.
• 40)   Kamal  AM,  Nabih  NA,  Rakha  NM, et al.: Upregulation of necroptosis markers RIPK3/MLKL and their crosstalk with autophagy-related protein Beclin-1 in primary immune thrombocytopenia. Clin Exp Med 23: 447–456, 2023. doi: 10.1007/s10238-022-00839-8.
• 41)   Yim  WW,  Yamamoto  H,  Mizushima  N: A pulse-chasable reporter processing assay for mammalian autophagic flux with HaloTag. Elife 11: e78923, 2022. doi: 10.7554/eLife.78923.