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Exploring the in vivo identity of mesenchymal stem cells in periodontal development and regeneration
2024 Volume 66 Issue 3 Pages 95-104
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2024 Volume 66 Issue 3 Pages 95-104
歯周組織は，セメント質，歯根膜，歯槽骨，歯肉など，石灰化組織と非石灰化組織から構成される複雑な組織である。現在，重度の歯周病により失われた歯周組織を再生させるために，間葉系幹細胞（MSCs）を用いた再生医療が注目され，様々な動物実験が行われている。特に歯根膜には，MSCsを含むさまざまな細胞集団が存在し，組織修復に寄与することが報告されている1-3)。しかしながらin vivoの内因的な環境において，歯根膜に存在するMSCs（PDLSCs）がどのような挙動を示し制御されるかについての詳細なメカニズムは依然として明らかにされていない。歯周組織は，間葉と上皮の連続的な相互作用を通じて，歯根形成と連動して形成される4,5)。特に，歯周組織の付着組織とされるセメント質，歯根膜および歯槽骨は，歯の発生期において歯胚を取り囲む歯小嚢から派生することが知られている6)（図1）。しかしながら，歯周組織における幹細胞集団の多様性と歯小嚢の間葉系前駆細胞との関係については，いまだ明らかにされていない。本稿では，マウス遺伝学と単一細胞トランスクリプトーム解析（シングルセルRNA-seq）に基づいて，歯周組織の幹細胞集団に関する現在の理解と，これらの幹細胞が歯周組織の発生や修復にどのように貢献するかを概説する。
歯周組織の発生と構造
歯周組織の発生過程と構造の模式図。エナメル器から縮小したエナメル上皮は，隣接する歯を囲む接合上皮を形成する。また歯小嚢は，セメント質，歯根膜，歯槽骨などの付着組織の発生に寄与する。（図は文献72より改変引用）
歯胚発生期において，外胚葉の陥入によって神経管ができると，神経堤細胞（NCC）が神経管から鰓弓に移動する7)。NCCは頭蓋の骨・軟骨の前駆細胞に分化し，頭蓋顔面骨格と末梢神経組織の形成に貢献する8,9)。細胞種特有のCre-loxPシステムを使用した研究により，歯周組織における初期の細胞運命の詳細な分析が容易となった。がん原遺伝子（プロトオンコジーン）であるWntファミリーメンバー1（Wnt1）は主に初期の歯胚に発現し，Wnt1-creはNCCを標識することができる10,11)。Chaiらによって，歯周組織を含むすべての歯間葉組織の細胞はWnt1-creで標識されるNCCに由来することが報告された12)。歯のMSCsは一般に，外胚葉性間葉系の特性を持つNCCの派生物であると考えられている13,14)。さらに神経周囲のグリア細胞も歯のMSCsとして機能し，歯の間葉組織の形成に寄与することが報告された15)。
鐘状期において歯冠が形成された後，エナメル上皮のヘルトヴィッヒ上皮鞘（HERS）の伸長を合図に，歯根および歯周組織形成が開始される。歯根形成のテンプレートとなるHERSは最終的に消失し，歯根膜中にマラッセの上皮遺残（ERM）と呼ばれる上皮残存物が認められる16)。歯根尖領域のNCC由来間葉系細胞はHERSと相互作用し，様々な間葉系前駆細胞が歯周組織形成を制御する。特に，数十年にわたる組織学的分析を通じて，歯小嚢が歯周組織を構成する細胞の主要な供給源であると考えられている4,6)。
副甲状腺ホルモン関連タンパク（PTHrP）は，オートクリンおよびパラクリンシグナル伝達を通じて，局所的に作用するリガンドであり，毛包，乳腺，歯などの様々な組織において上皮―間葉相互作用を制御する17-19)。長管骨の発生において，成長板軟骨の細胞休止層に存在するPTHrP陽性細胞は骨格幹細胞として機能する20)。これは，PTHrPを発現する間葉系細胞が骨格幹/前駆細胞の特性を持っていることを示唆する。歯の発生過程において，PTHrPは破骨細胞形成を促進することで歯の萌出を制御するために必須であり17,21)，歯小嚢に発現する22,23)。PTHrP-creERを使用したin vivo系譜追跡では，PTHrP陽性の間葉系前駆細胞が歯根膜の線維芽細胞，無細胞セメント質のセメント芽細胞，および歯槽骨の骨芽細胞に分化することが明らかとなった。この過程は，歯根形成中にPTHrPとその受容体である副甲状腺ホルモン受容体（PPR）を介したオートクリンシグナル伝達によって制御される23)。このことから，PTHrP-PPRシグナル伝達は，歯周組織を生じるPTHrP陽性歯小嚢細胞の詳細な細胞運命を制御するために重要であることが示唆された（図2）。
さらに，近年のin vivo系譜追跡では，神経膠腫関連がん遺伝子ホモログ1（Gli1）-creERまたはOsterix（Osx）-creERによって特徴づけられた異なる種類の歯小嚢細胞が歯周組織形成に寄与していることが明らかとなった22-25)。Liuらは，Gli1がHERS上皮細胞と周辺の間葉系細胞の両方で発現しており，これらのGli1陽性細胞がマウス臼歯の歯根膜と歯槽骨の形成に寄与していることを報告した24)。Sp7によってコードされる転写因子Osxは，歯根形成に重要な役割を果たす26-28)。Osxは歯乳頭や歯小嚢といった間葉系細胞に発現しており，Osx陽性細胞は象牙芽細胞，セメント芽細胞，骨芽細胞，および一部の歯根膜細胞に分化する22,23)。これらより，PTHrP陽性細胞とOsx陽性細胞がGli1細胞の亜集団であり，これらの異なるクラスの歯小嚢間葉系前駆細胞集団が少なくとも部分的に重複して歯周組織の形成を調整することが示唆された。
したがって，歯小嚢には歯周組織を生み出す重要な間葉系前駆細胞集団が含まれており，歯小嚢の間葉系細胞集団をさらに探求することで，歯周組織形成および再生のメカニズムの理解が促進されると考えられる。
PTHrP陽性歯小嚢間葉系前駆細胞の歯周組織細胞への分化
PTHrP陽性歯小嚢細胞の細胞運命の模式図。PTHrP陽性歯小嚢間葉系前駆細胞は，PTHrP-PPRシグナル伝達を介して，無細胞セメント質上のセメント芽細胞，また歯根膜線維芽細胞，歯槽骨骨芽細胞に分化する。（図は文献72より改変引用）
歯根膜は，歯根を歯槽骨内で支える靭帯様組織であり，転写因子であるScxやMkxなどの典型的な腱マーカーを発現する29-32)。歯根膜には，線維芽細胞，骨芽細胞，破骨細胞，セメント芽細胞，内皮細胞，末梢神経感覚細胞など，さまざまな細胞集団が含まれており，長らく創傷治癒と恒常性維持のための幹細胞/前駆細胞集団が存在すると考えられてきた33)。実際，PDLSCsと呼ばれるMSC集団が歯根膜から単離され，免疫不全マウスへ移植すると歯周組織様の構造を異所性に形成することが明らかとなっている3)。PDLSCsの発見後，多くの研究者がPDLSCsの特性について探求し，動物モデルおよびヒト臨床試験において，PDLSCsまたはその培養上清の移植が歯周組織再生を促進することが報告されている34-39)。
最近のin vivo系譜追跡実験によって，歯周組織の恒常性維持に歯根膜中のさまざまな間葉系前駆細胞集団が寄与していることが解明されつつある。ヘッジホッグシグナル伝達の標的遺伝子である転写因子Gli1は，マウスの長管骨，頭蓋冠縫合部，切歯など様々な組織のMSCsに発現している40-43)。Menらは，Gli1陽性細胞が歯根形成後に歯根膜および歯根尖領域の神経血管束近傍に存在し，生体内で歯周組織の損傷修復に寄与するPDLSCsとして機能することを報告した44)。また，骨細胞から分泌されるWnt阻害因子SclerostinはGli1陽性PDLSCsを負に制御し，Gli1陽性PDLSCsにおけるWntシグナル伝達の喪失は歯槽骨吸収を引き起こす。興味深いことに，咬合力を除去するとWnt活性が低下し，Gli1陽性細胞の活性を阻害したことから，機械的刺激がWntシグナル伝達を介してGli1陽性PDLSCsの活性を間接的に制御することが示唆された。さらに，Xieらは，Gli1陽性細胞がWntシグナル伝達を介してセメント質形成に寄与することを報告した45)。Gli1陽性細胞においてβ-cateninを恒常的に活性化させるとセメント質の厚さは増加し，一方，Gli1陽性細胞特異的にβ-cateninを欠失させるとセメント質の厚さは減少する。また，Gli1陽性細胞は歯槽骨の骨髄にも存在し，骨のリモデリングや歯科インプラントの骨結合にも寄与している46)。これらの研究より，歯根膜およびその周辺のGli1陽性間葉系前駆細胞が生体内におけるPDLSCsとして歯周組織の恒常性を維持することが示唆された。
Axin2はWntシグナル伝達の直接的な標的遺伝子であり47)，Axin2を発現するWnt応答性細胞は，マウスの切歯と臼歯の歯髄を含むさまざまな組織でMSCsとして同定されている48-50)。歯根膜中のAxin2陽性細胞は，抜歯後51)および歯列矯正による歯の移動中52)において歯槽骨の骨芽細胞に分化する。またセメント質形成において，Axin2陽性細胞は，Gli1陽性細胞と同様に，Wntシグナルを介してセメント芽細胞に分化する53)。さらに，Zhaoらは，Axin2陽性細胞が歯根膜の血管に隣接して位置し，セメント質形成に寄与することを明らかとした54)。
CD90/Thy1は，MSCsを単離するために広く用いられている代表的な細胞表面マーカーである55,56)。近年のin vivo系譜追跡実験で，CD90陽性細胞が切歯歯髄内のMSCsのサブポピュレーションを標識し，損傷後の修復過程に寄与することが明らかとなった48)。さらにZhaoらは，CD90陽性細胞には歯根膜の周皮細胞が含まれており，発生期においてセメント芽細胞を生じることを報告した54)。成体期において，CD90陽性細胞数は減少していくが，歯周炎などの病的環境でCD90陽性細胞は再活性化され，セメント芽細胞に分化する可能性が示唆された。これは，発生期と成体期の両方でセメント芽細胞を供給するAxin2陽性細胞とは異なる動態を示し，CD90陽性周皮細胞はAxin2陽性周囲細胞とは異なる可能性を示唆している。しかしながら，これらの異なる細胞集団が集合的にセメント形成にどのように寄与するかを特定するには，さらなる検証が必要である。
周皮細胞の主要な構造タンパク質であるアルファ平滑筋アクチン（αSMA）は，平滑筋細胞と筋線維芽細胞に発現する57,58)。歯の発生期において，αSMAは歯小嚢と歯根膜根尖側の血管周囲領域の細胞に豊富に発現する59)。RoguljicらはαSMA陽性細胞が増殖してScx陽性の歯根膜線維芽細胞とI型コラーゲン（Col1a1）陽性骨芽細胞およびセメント芽細胞に分化することを報告し，αSMA陽性細胞は歯根膜細胞，骨芽細胞，セメント芽細胞を生み出す間葉系前駆細胞を含むことが示唆された60)。これらの知見は，単離されたPDLSCsが周皮細胞の特徴を備えていることを示すin vitro研究によっても裏付けられているが，今後周皮細胞のPDLSCsとしての特性を詳細に検証することが必要である61)。
ホメオボックス転写因子であるPrrx1は，発生初期の間葉組織で広く発現しており，骨および軟骨形成，また歯の成長に広く関与している。その結果，Prrx1-creは骨や歯のMSCsを標識するために使用されてきた62-65)。Bassirらは，出生後のPrrx1陽性細胞がマウスの臼歯と切歯の歯根膜に位置し，Prrx1陽性細胞を除去すると歯根膜スペースの拡大につながることを報告した。さらには，マウス切歯の歯周組織欠損の再生は認められず，Prrx1陽性細胞は歯周組織の恒常性維持に重要であることが示唆された66)。Gongらは，Prrx1陽性細胞の系譜細胞が歯乳頭や歯小嚢などの間葉組織に広く分布し，歯根膜線維芽細胞に分化することを報告した67)。さらに，シングルセルRNA-seqと同種歯移植モデルを用いて，血管を取り囲むPrrx1陽性細胞由来の間葉細胞が歯根膜修復における血管新生に関与することが示唆された。
これらの知見により，さまざまな種類のMSC集団が歯周組織の形成および再生に寄与することが明らかとなりつつある（図3）。
歯根膜の様々な間葉系前駆細胞集団
マウス歯根膜に存在する間葉系前駆細胞集団の模式図。Gli1およびAxin2陽性間葉系前駆細胞が血管周囲領域を囲んで存在し，Wntシグナル伝達によって歯根膜線維芽細胞，セメント芽細胞，および骨芽細胞へと分化する。CD90/Thy1陽性およびαSMA陽性血管周皮細胞は，歯根膜線維芽細胞およびセメント芽細胞に分化し，歯周組織の修復において急速に増殖する。Prrx1陽性間葉系前駆細胞は，マウスの臼歯と切歯の両方の歯根膜に存在し，歯根膜線維芽細胞に分化する。（図は文献72より改変引用）
シングルセルRNA-seqは，細胞集団の多様性を特定するための有効な手段であり，近年歯に関連する細胞種の同定に広く用いられている23,68,69)。筆者らは，2つのシングルセルRNA-seqのデータ（1．生後6日齢のPTHrP-mCherryノックインマウス臼歯から採取したPTHrP陽性歯小嚢細胞（GSE120108），および2．生後25日齢のCol1a1（2.3kb）-GFP；PTHrP-creER；tdTomatoマウスから採取したCol1a1-GFP陽性間葉系歯周組織細胞（GSE168450））を統合し，マウス臼歯の歯周組織におけるPTHrP陽性歯小嚢細胞とその系譜細胞との分化における関連を報告した70)。このシングルセルRNA-seqから，PTHrPを含む，セメント芽細胞と歯槽骨の骨芽細胞を区別するセメント芽細胞特異的メタ遺伝子が同定された。CellPhoneDB細胞間コミュニケーション解析71)では，セメント芽細胞から分泌されたPTHrPが，歯周組織細胞で広く発現しているPPRと相互作用することが予測された。興味深いことに，セメント芽細胞は初期の歯周組織形成段階でPTHrP陽性歯小嚢細胞から直接分化するが，骨芽細胞はPTHrP陽性歯小嚢細胞のサブポピュレーションから分化した移行細胞集団から派生することが推測された。さらに，Scx陽性歯根膜細胞集団は，骨芽細胞やその他の歯根膜線維芽細胞の起源となっており，ScxがPDLSCsのマーカーとなることが示唆された（図4）。
これらの知見は，マウス臼歯の歯周組織に類似したヒトの歯周組織における細胞系譜と細胞間相互作用について応用できる可能性を秘めているが，今後セメント芽細胞から分泌されるPTHrPの機能，およびScx陽性歯根膜細胞の細胞運命を，in vivo系譜追跡実験を用いて調査するには，さらなる研究が必要である72)。
統合的シングルセルRNA-seqによる，歯周組織の細胞の多様性と歯小嚢細胞との発生関連の探求
A：統合的シングルセルRNA-seqの戦略の概略図。LIGERアルゴリズムを用いて，2つのシングルセルRNA-seqデータセット1）生後6日齢のmCherry陽性歯小嚢細胞と2）25日齢のPTHrP陽性細胞の系譜細胞を含むCol1a1（2.3kb）- GFP歯周細胞，を統合した。
B：シングルセルRNA-seqから得られた知見の概略図。PTHrP陽性歯小嚢細胞は，無細胞セメント質上のセメント芽細胞，歯根膜細胞，歯槽骨の骨芽細胞，に分化する。歯根形成後，PTHrPはセメント芽細胞で特異的に発現する。セメント芽細胞から分泌されたPTHrPは，PTHrP/PPRシグナル伝達を介してセメント形成に重要であることが示唆された。（図は文献70, 72より改変引用）
細胞種特異的なcre-loxP組換えシステムを使用したマウス遺伝学的手法により，歯周組織における幹細胞集団とその特性について理解が深まりつつある（図3）。本稿では，歯周組織の発生と再生に寄与するさまざまな幹細胞集団について述べたが，これらの幹細胞集団が重複した細胞を標識している可能性も高く，歯周組織における真の幹細胞マーカーは依然として明らかにされていない。さらに，これらの細胞系譜追跡手法はヒト組織に直接適用できないため，現在，ヒト歯根膜との関連性に関するエビデンスは限られている。マウスとヒトの両方でこれらの幹細胞の機能を定義するには，歯根膜の間葉系前駆細胞をさらに特徴付ける必要があると考えられる。シングルセルRNA-seqは，マウス遺伝学的アプローチとともに，マウスとヒトの両方で歯周組織を含む歯の組織の多様性を単一細胞レベルで明らかにするために近年広く用いられている68-70),73-76)。さらに，従来のシングルセルRNA-seqでは個々の細胞の位置情報を保持できないという欠点を補うために，現在，空間的トランスクリプトームの手法が開発されている77-79)。近年，この空間的トランスクリプトーム手法はヒトの歯肉組織の遺伝子発現プロファイリングにも適用されている80)。これらのシングルセルRNA-seqは，歯周組織がどのように形成および維持されるかを特定するのに非常に有用である。単一細胞シーケンス技術には，低い発現量の遺伝子のドロップアウト，高価なコスト，品質管理による再現性の低さなど，様々な課題があるが，単一細胞および空間RNAシーケンス手法の継続的な革新とバイオインフォマティクスの進歩により，今後歯周組織の細胞の多様性や発生および再生における分化制御機構が解明されるであろう。
歯周組織内の多様な幹細胞集団は，機能的な歯周組織の形成および再生に関与している。PDLSCsの発見から20年が経ち，マウス遺伝学を使用した歯周組織細胞の系統追跡分析により，さまざまな幹細胞集団が生体内でどのように歯周組織の形成および再生に寄与するか分かりつつある。PDLSCsに限らず，歯周組織内の幹細胞の基本的な生物学的特性をより深く理解するには，歯科幹細胞の機能分析を可能にする，より具体的な遺伝子ツールの開発が不可欠である。さらなる研究により，歯科幹細胞の詳細な分化制御機構が明らかとなり，将来新たな再生療法の開発へ応用されることを期待している。
今回の論文に関連して，開示すべき利益相反状態はありません。
