A mathematical model based on spider embryo for testing evolutionary pathways for arthropod body plans

Abstract

動物における初期胚の体軸形成は，体の基本構造を形作る重要な発生過程である．その形成過程では，細胞間の相互作用により細胞の再配列が協調的に行われ，胚が体軸方向に伸長するなど細胞集団が再編成される．節足動物では，体軸の分節化に至る初期胚の形成過程が，種によって細胞レベルや分子レベルで多様であり，ショウジョウバエやオオヒメグモなど昆虫やクモのモデル生物を用いた発生研究により，その具体例が示されている．しかし，節足動物における初期胚の体軸形成過程の多様化の進化過程については，進化の実際の時間と回数による制約や生物種間の多様化の仕組みを予測する計算基盤の限定もあり，理解が進んでいない．そこで私たちは，胚の形態形成過程を再現し，そこでの細胞性質を次世代の胚の形態形成へ引き継ぎ進化する胚状の多細胞体の数理モデルを開発することにした．数理モデルでは，細胞が持つ力学的性質として細胞骨格やアクチンに由来する細胞収縮やカドヘリンなど接着分子に由来する細胞接着を実装し，細胞間接着の強さが各細胞の平面内極性の方向に依存して時空間変化することで，胚が体軸方向に伸長する過程を模倣できる形態形成モデルを構築した．この研究は，クモ胚をベースに初期胚の体軸形成過程の仕組みを数理モデルから予測して，クモを含む節足動物の体軸形成の多様化の進化過程を探る理論研究である．

Translated Abstract

Shaping body axes is a critical developmental process in embryos of multicellular animals. During this process, cellcell interactions and cell rearrangements occur in a coordinated manner, which results in global remodeling of the multicellular architecture. In arthropod embryos, the early developmental process leading to body axis segmentation varies at the cellular and molecular level depending on the species. Developmental studies in insect and spider model species have provided specific examples of diverse mechanisms that regulate axis formation and segmentation in arthropod embryos. However, it is difficult to address the problem of how such developmental variations arose during the course of arthropod evolution, because of technical limitations in testing evolutionary processes. In this study, we attempted to construct a mathematical model with which evolution of developmental processes realizing major features of arthropod body plans could be tested in silico. This multicellular mathematical model was constructed with some mechanical forces of cells derived from the cytoskeleton and cell contraction in addition to the forces derived from intercellular adhesion, which changes in conjunction with each cell in the direction of planar cell polarity. This study is a theoretical research based on spider embryo model to understand the evolution of developmental processes for arthropod body plans.

はじめに：生物のボディプランとなる体軸の形成

動物と植物の形には, そのグループで共有するボディプランを見つけることができる. このボディプランの基本構造となるのが前後, 背腹, 左右の体軸である. 体軸の形成過程を理解することは, 動物と植物の形作りにおいて発生学的にも進化学的にも重要な課題である. 体軸は, 多細胞集団の秩序だった動きにより形成される. 動物と植物での細胞の動きの違いとして, 動物細胞はアクチン収縮により細胞体積を小さくでき細胞間接着の変化により細胞集団内で配置換えが起きる. 一方で, 植物細胞は固い細胞壁により細胞体積が小さくならず細胞同士が強固につながり細胞集団内の配置換えが起きない. このような細胞の動きが違う動物と植物の形作りを比較することで, 生物の形作りの仕組みの理解を深めることができる.

多細胞動物は20以上の門から成り, それぞれが異なる基本的なボディプランを持つ（Brusca and Brusca 2003, Valentine 2004, Willmore 2012）. ボディプランの形成は, 細胞の増殖と分化, 細胞の移動と再配置, 細胞間の相互作用を通して達成されるが, これらはゲノム情報と細胞の力学的作用により制御されている（Forgacs and Newman 2005）. ゲノム情報は受け継がれるが, 世代を経るごとに変化しうるものであり, 体軸の形成過程は, 門の形質を崩すことなく多様化することができる（Richardson 1995, Galis et al. 2002）. 生物の進化の過程で, このような体軸形成過程の変化がどのように起こりうるかは, 動物の多様性の起源を理解する基本的な問いである.

節足動物門の体軸の形成過程

節足動物門の動物(図１A)における初期胚発生は, 体軸形成と分節化によって特徴づけられる（Scholtz and Wolff 2013）. ショウジョウバエDrosophila melanogaster（Irvine and Wieschaus 1994）, コクヌストモドキTribolium castaneum（Benton et al. 2013, Benton 2018）, エビの１種Parhyale hawaiensis（Sun and Patel 2019）, オオヒメグモParasteatoda tepidariorum（Oda and Akiyama-Oda 2020）などの研究により, 胚発生過程における遺伝子の発現パターンは保存されているにもかかわらず, 体軸形成と分節化のプロセスとメカニズムは種によって大きく異なることが明らかになった（Liu and Kaufman 2005, Peel et al. 2005）. 例えば, クモの初期の胚発生過程は, 形状の変化に種ごとに違いが見られる(図１B).

図１ A：節足動物門の系統樹とB：クモの種による胚発生の違い

ハエトリグモは, オオヒメグモに見られる中間の円盤状の胚盤形成の過程が見られない. クモ胚の画像はOda et al. 2020から引用.

節足動物の種間の初期胚発生における変異は, 卵の大きさ, 形状, 組成, その他の特性における多様性と関連している可能性があり, 環境適応に関連した繁殖戦略がある（Scholtz and Wolff 2013）. 節足動物門の種の豊富さは, その発生システムが高い柔軟性と進化可能性を持っていることを意味する（Stansbury and Moczek 2013, Thomas et al. 2020）. 多くの場合, 組織の形態形成ダイナミクスは遺伝子発現のパターン形成を伴っている（Irvine and Wieschaus 1994, Akiyama-Oda and Oda 2010）. 節足動物や脊椎動物の胚における体軸の分節化に伴う空間的に周期的な縞模様形成は, 動的な細胞場における遺伝子発現のパターン形成過程の代表的な例を示している. これらの研究では, 周期的な縞模様を生み出すために様々な様式で振る舞う遺伝子発現の波が着目されている（Sarrazin et al. 2012, Hubaud and Pourquié 2014, Akiyama-Oda and Oda 2020）. しかし, ショウジョウバエの胚盤胞胚における分節化の過程は, ほとんどが多核性胞胚環境で起こるため, このよく知られたショウジョウバエのモデル系からは, パターン形成と細胞集団のダイナミクスの関係についての限られた情報しか得られない. 対照的に, クモ胚は, 他の多くの節足動物胚と同様に, 体軸形成と分節化は細胞性胞胚において遺伝子発現のパターン形成を伴って起こる（図２, Kanayama et al. 2010, Hemmi et al. 2018）.

クモの初期の胚発生過程

クモは, 節足動物の初期に枝分かれした鋏角類のグループに属し, 進化学的に重要な位置にある(図１A). クモのグループの中で, オオヒメグモは鋏角類のモデル生物として, 胚発生の研究に用いられている. オオヒメグモP. tepidariorum胚の初期から中期にかけての多細胞構造の発達を観察した過程を次に記す（図２A）. 初めに卵の表面には約６４個の細胞が均等に分布し, 約１５時間後に２つの細胞集団が出現し, 胚は放射状の対称軸を示す(図２A, First axis).

図２ オオヒメグモの初期の胚発生過程

A：球状胚から胚盤形成を経て胚帯形成までの過程.

B：胚帯形成過程での遺伝子発現パターンの形成.

それぞれFujiwara et al. 2022, Hemmi et al. 2018から引用.

一方の細胞集団は, アクチンがより強く濃縮され, 細胞の分布が次第に密になるのに対し, もう一方の細胞集団はアクチンがほとんど見られず細胞の分布が次第にまばらになる. 前者の細胞集団のほとんどは胚盤の形成に参加し, 1,000個以上の上皮細胞からなる単細胞層で, そのほとんどが外胚葉に寄与する. 胚盤の中心部では, クムルス間葉系細胞（Cumulus mesenchymal (CM) cells）と呼ばれる小さな細胞群が内在化し, その後, 胚盤の上皮の基底側に沿って対称性を破りながら移動し, 胚盤の縁に達する（Akiyama-Oda and Oda 2010）. CM細胞が到着した胚盤の周辺領域では, CM細胞は胚盤外細胞の分化を誘導し（Akiyama-Oda and Oda 2006）, 胚盤外細胞は次第に頂端側の表面積が大きくなり, 細胞膜上のアクチンが目立たなくり, 胚盤の上皮細胞集団を分離する. 残った外胚葉は細胞配置の再編成を受け, 分節化した胚帯を形成する（図２B, Hemmi et al. 2018）. この再編成の過程で, 前後軸方向に向いた細胞の配置換えと様々な向きの細胞分裂が観察されている（Fujiwara et al. 2022）. これらの細胞動態は, 胚全体を形作る細胞集団の再編成を促進する.

オオヒメグモの胚発生を模倣する数理モデル

　細胞集団の振る舞いを予測する数理モデルの研究は増えており（Goriely 2017）, その数理モデルの１つが, 各細胞が力学に基づく運動方程式に従うCell vertexモデルである（Honda 1983, Farhadifar et al 2007, Fletcher et al. 2014）. 実際, ２次元Cell vertexモデルはショウジョウバエ上皮組織の成長と形態形成を効果的にシミュレーションしてきた（Aliee et al. 2012）. Cell vertexモデルは, 細胞膜上のアクトミオシンネットワークとカドヘリン接着結合が細胞同士接触する頂端部に局在すると仮定し（Fletcher et al. 2014）, それら細胞性質が, 細胞の大きさ, 形, 動態を制御する上で主要な力学的役割を担っている（Lecuit and Lenne 2007, Paluch and Heisenberg 2009）. アクトミオシン活性は組織内の個々の細胞に細胞膜の張力を発生させるが, 接着は張力に抵抗し, それらが組織レベルでの張力に変換される（Heer and Martin 2017）. その張力の異方性は, 上皮組織における平面内細胞極性と関連している（Bertet et al. 2004）. この張力は, 細胞集団の動きを方向付ける細胞間で介在するメカニズムの一部として機能し（Bertet et al. 2004, Blankenship et al. 2006）, 細胞間の界面における張力の差は, 局所的な細胞選別につながる可能性がある（Landsberg et al. 2009）.

私たちは, 多細胞系が細胞のダイナミクスに基づいて時空間的に変形する球面状のCell vertexモデルを提案し, 節足動物のような全胚のモデル化をオオヒメグモ（P. tepidariorum）の胚を模倣することを試みた. クモの胚発生の特徴的な形状変化は, 外側の上皮細胞の動態によって球面上で変形する（図２A, Akiyama-Oda and Oda 2010）. 体軸に沿って分節化中のクモ胚は3,000以上の細胞で構成され（Akiyama-Oda and Oda 2020）, それぞれの細胞は遺伝子の動的発現状態や周囲の細胞との動的相互作用を持つ. この胚形成過程を再現するために, 仮想多細胞プラットフォームとして球面Cell vertexモデルを構築した（図３）. 通常の２次元シートCell Vertexモデルと異なる球面Cell vertexモデルの利点は, 閉じた構造システムを採用し, 組織の細胞境界を必要としないことである（図３A）. 構築されたCell vertexモデルでは, 各ポリゴンは胚表面の個々の上皮細胞の頂端領域を表し, ポリゴンの集合体は外側の上皮組織の多細胞構造を表す（図３）.

図３ A：Cell vertexモデルの構造とB：導入した細胞性質

プログラム構造は実際の胚の細胞<組織<胚の階層構造と対応している. 胚発生で見られる８つの細胞性質を導入している. 8の赤矢印は細胞極性の方向を示す.

われわれは, 胚全体が1つ以上の組織から構成され, 各組織が一定の細胞特性を持つ均質な細胞集団から構成されると仮定し, 実際の胚で見られる階層的枠組みを, 数理モデルの構造でも保持した（図３A）. また, 卵黄のような球形の内部構造に付着した上皮細胞集団を表現するために, 各頂点に球形半径の制約を仮定し, 弾力性のある球形を維持するようにした. 各頂点における多角形の辺の接続は柔軟で, 頂点の数は増減できる幾何学的特性を持ち, 実際の胚発生で見られる細胞分裂や細胞間相互作用などの細胞の動態を表現することができる（図３B）. 胚の発生過程をシミュレーションした結果、球状胚から円盤状の胚盤を経て、帯状の胚帯までの胚の形状変化を再現することができた（図４）.

図４ 数理モデルでのクモ胚の発生過程の再現

球状胚から胚盤を経て胚帯への形成を再現できた. この時、細胞極性の時空間的な制御により胚が伸長する.

このとき, 各細胞の細胞極性が前後軸方向に沿うように制御され、その細胞極性に従って細胞間接着を時空間変化させることが重要であることがわかった. この数理モデルによる胚発生のシミュレーションは, 節足動物の初期発生過程がどう多様化したのかという問題の解明に貢献できる.

胚発生時の遺伝子発現のパターンを形成する数理モデル

クモの胚発生では, 遺伝子発現のパターニングが胚形成と同時に起こる（Hemmi et al. 2018）. 球面Cell vertexモデルを使用して追求する価値のある重要な目標の１つは, 活発な再配列をする細胞集団において, 異なる遺伝子ネットワークによって制御される様々な遺伝子の発現パターニング過程を再構築することである. そこで, 胚帯を形成する個々の細胞において遺伝子発現に対応する複数の分子を持つ単純な遺伝的ネットワークを組み込んだ（図５A）. 遺伝子のタンパク質産物は, 縞や斑点などのパターンを生成する通常の反応拡散系のように, 異なる拡散係数で拡散すると仮定した（Kondo and Miura, 2010）. 導入した遺伝子ネットワークは, 胚盤の縁に由来するクモのhedgehogホモログ（Pt-hh）の発現の波の移動と分裂を模倣することを意図したものである（Kanayama et al. 2011）. 遺伝子発現の初期値は, 先行研究で観察されたように胚の縁に設定した（Hemmi et al. 2018）. ショウジョウバエ胚では, 組織内の位置情報と収縮伸長を駆動する細胞行動との間の制御的協調が示唆されている（Paré et al. 2014）. このような大まかな位置情報と細胞の力学的パラメータとの間の制御的な関連は, 我々の頂点モデルを改良するために取り入れるべきである. そこで, 遺伝子発現のパターンによる細胞間の発現量の差を基に細胞間の接着が時間変化するように設定した（図5A）.

図５ A：分子ネットワークから遺伝子発現を経て細胞極性(青)が細胞間の接着(赤)を制御する流れとB:遺伝子発現パターン形成を伴う胚発生過程の再現

周りの細胞との遺伝子発現量の差が細胞極性の向きを制御する.

シミュレーションの結果, 細胞集団内で遺伝子発現の波に続いて分裂が起こり, この遺伝子発現パターンを基に細胞間の接着が時間変化して胚が伸長することで胚帯を形成することができた（図５B）. しかし, 横方向の遺伝子発現の波の直線的配置の完全性は安定的に維持されていなかった. 胚帯形成場の平面内での細胞の再配列が, 波の挙動に揺らぎを与えているようであった. パターン形成場におけるこのような細胞動態は, 通常の反応・拡散系を用いたパターン形成のシミュレーションでは考慮されていない. 後期P. tepidariorumの胚帯では, Hedgehog（Hh）シグナルの制御の下, 将来の前後軸を反映する中心-周辺方向に沿って, 同心円状の遺伝子発現の差が確立されている. 現在では, ライブイメージング, 複数色の蛍光in situハイブリダイゼーション, 単一細胞・核トランスクリプトームを用いて, クモ胚から細胞位置, 細胞挙動, 遺伝子発現に関する定量データを得ることができる（Hemmi et al. 2018, Akiyama-Oda et al. 2022）. このような定量データの解析は, クモ胚のパターン形成プロセスの根底にある力学的制御や遺伝的ネットワークの理解に役立つかもしれない.

おわりに：節足動物の初期胚における発生過程が多様化する仕組みの理解を目指して

私たちは, 球面上で動作するように構築した２次元Cell vertexモデルを用いた計算機シミュレーションによって, P. tepidariorum胚で観察されたものと同様に, 胚盤の形成と胚盤から胚帯への移行を促す動的な細胞挙動を再現できることを示した（図２, ４, ５）. しかしながら, 私たちの現在のモデルでは, 胚盤や胚帯での形成過程の背腹軸や前後軸の対称性を破るステップは無視され, 代わりに空間的非対称性が初期条件として与えられている. クモの初期胚では, 局所的な母性因子や細胞間相互作用を介した自己決定システムが存在する可能性がある. 対称性を破るCM細胞の移動の制御は, 生殖細胞円板から生殖細胞帯への発生において連続性を達成するための鍵である. 体軸方向のシグナルを送るCM細胞は極点部位に由来する内部細胞集団であるが, 我々の球面Cell vertexモデルは, 遺伝子発現に応答して上皮細胞層の下に移動するシグナル源を持つように修正することができる. これまでの研究から, P. tepidariorum胚では, これらの合図はHhシグナルを含む遺伝的ネットワークによって制御されていることが示唆されている（Akiyama-Oda and Oda, 2010）. さらに, シグナルに応答する能力は胚細胞に必須の特性であり, パターン形成機構の一部として空間的に制御されている可能性もある. 今後の数理モデルでは, 動的なシグナル源だけでなく, この応答も考慮する必要がある. P. tepidariorum胚発生におけるHhシグナル活性は, グローバルな極性形成を仲介するだけでなく, その後の体軸の分節化の段階にも寄与している（Akiyama-Oda and Oda 2010, Hemmi et al. 2018）. Hhシグナル伝達のその後の活動は, 少なくとも部分的には, ショウジョウバエの胚発生における分節化極性遺伝子の活動に匹敵するのかもしれない. 空間的に周期的なhh発現の縞模様の形成は, 節足動物の胚発生において高度に保存された特徴である. Hhシグナルの下流エフェクターは細胞の選別行動の制御に関与しており（Larsen et al. 2003）, この側面はCell vertexモデルに組み込むことができる.また, P. tepidariorum胚のような胚盤期は, 他のクモの胚には見られないことがあり, クモの種間でも初期胚発生過程に違いがある（図１, Oda et al. 2020）. 本研究で提案した仮想多細胞プラットフォームは初歩的なものであるが, さまざまな条件に調整可能であり, 改良が可能である. 例えば, 遺伝子発現のパターン形成と胚の形態形成を組み合わせたシステムをテストするために, 親の胚でのシミュレーションの結果による細胞性質のパラメータを次世代に引き継がせる進化シミュレーションを行うことができる（図６）.

図６ 数理モデルによる胚発生過程の進化シミュレーション

数理モデルでの胚発生の結果が親から子へ変異しつつ引き継がれ, 一連の進化が起きる. 適応度はin vivoの定量データを用いる.

今後の研究の長期的な目標は, このような数理モデルを活用し節足動物の初期の胚発生に見られる多様化の進化過程を理論生物学的に検証することである.

Acknowledgments

本稿は, 日本植物学会第８７回大会で行われたシンポジウム「植物の発生・成長を支える極性形成の制御とその進化」で発表した研究内容をまとめたものである. 研究の遂行に当たり, クモ胚を用いた実験はJT生命誌研究館細胞・発生・進化研究室の野田彰子さん, 赤岩孝憲さんにご協力を頂きました．また数理モデルの構築は広島大学の藤本仰一博士とその研究室メンバーにご助言を頂きました．最後に発表する機会を下さった当シンポジウムのオーガナイザーである北海道大学の楢本悟史博士と大阪大学の北沢美帆博士に感謝申し上げます.

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