2020 Volume 69 Issue 1 Pages 112-116
80歳代，女性。38.6℃の発熱と酸素化低下があり，当院に救急搬送後入院となる。入院時の血液培養検査2セット4本中，好気ボトル1本が陽性となりGram陰性桿菌であった。同定は，生化学的同定法およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry; MALDI-TOF MS）を用いた質量分析計で検査したが不可であった。16S rRNA遺伝子解析を行いPaenibacillus viniと同定した。2015年に環境からの分離報告があるが1)，ヒトからの報告は少なく，スペインで1999年から2015年にヒトと環境から分離されたPaenibacillus sp. 136株の分離報告で，P. viniは1株がヒトの血液から分離されていた2)。今回我々は，稀症例と思われたP. vini bacteremiaを経験したので報告する。
A female patient in her 80s was transported to our hospital with fever and hypoxia. Gram-negative bacillus cells were isolated from one aerobic blood culture vial. However, the bacterium was not identified by conventional phenotypic assays and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. A 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing technique revealed the bacterium to be Paenibacillus vini. P. vini has hardly been reported to be isolated from blood culture. In this study, we identified P. vini isolated from blood culture by the 16S rRNA gene sequencing technique. For the identification of Paenibacillus species, sequencing of the 16S rRNA gene was effective. In Spain, of the 136 Paenibacillus strains isolated between 1999 and 2015, only one strain was identified as P. vini.
Paenibacillus属は，1993年にBacillus属から移籍された菌種である3)。自然界に広く分布するが，ヒトへの感染も報告されている4)～6)。今回我々は，ヒトからの分離報告の少ないP. vini bacteremiaを経験した。Gram陰性桿菌として分離され，好塩性が見られた。また，現在は16S rRNA遺伝子解析以外は正確に同定できないことなど，若干の知見を得たため報告する。
患者：80歳代，女性。
既往歴：尿閉塞，糖尿病，高血圧，嚥下性肺炎。
現病歴：介護老人ホーム入所中，体温38.6℃の発熱と酸素化低下，satulation pulse oxygen（SpO2）83%で当院に救急車搬送となり入院した。
入院時血液検査：Table 1
| CBC | Serum chemistry | ||
| WBC | 6,200/μL | TP | 6.6 g/dL |
| Neut. | 92.3% | Alb | 2.9 g/dL |
| Lymph. | 6.2% | BUN | 15.9 mg/dL |
| RBC | 311 × 104/μL | CRE | 0.39 mg/dL |
| Hb | 11.1 g/dL | T-Bil | 1.1 mg/dL |
| Hct | 31.8% | AST | 15 U/L |
| Plt | 26.6 × 104/dL | ALT | 9 U/L |
| Coagulation | ALP | 186 U/L | |
| PT-time | 13.6 sec | LDH | 163 U/L |
| PT-activity | 86.1% | Na | 135 mmol/L |
| PT-INR | 1.09 | K | 3.9 mmol/L |
| APTT | 25.7 sec | Cl | 98 mmol/L |
| D-dimer | 1.6 μg/mL | CRP | 0.21 mg/dL |
血液培養検査は，入院時にSA好気用ボトル，SN嫌気用ボトル（どちらもビオメリュー・ジャパン）を1セットとし，BacT/ALERT 3D全自動微生物培養検出装置（ビオメリュー・ジャパン）で2セット実施した。入院第4病日にSA好気ボトル1本が陽性となった。フェイバーG「ニッスイ」（日水製薬）でGram染色した。細長いGram陰性桿菌であった（Figure 1）。
Elongated gram negative bacilli (×1,000).
トリプトソイ5%ヒツジ血液寒天培地（Trypticase Soy Agae with 5% Sheep Blood：TSA5%ヒツジ血液寒天培地）（日本ベクトン・ディッキンソン）を用いて，35℃，5%炭酸ガス・インキュベーター（Panasonic）で24時間培養した。白色S型コロニーの発育を認めた（Figure 2）。
The figure is a colony growing into blood agar medium.
ブルセラHK寒天培地RS（極東製薬工業）を用いて，35℃，嫌気条件下で2日間培養を行った。嫌気培養には，アネロパックケンキ（三菱ガス化学）を用いた。嫌気培養でも発育を認めた。通性嫌気性Gram陰性桿菌であった。BTB寒天培地（極東製薬）を用いて35℃，24時間，好気培養では菌の発育を認めなかった。好塩性の可能性が示唆された。オキシダーゼテスト（栄研化学）陰性，3%過酸化水素を用いたカタラーゼテスト陽性であった。
全自動細菌検査装置VITEK2 GN同定カード（ビオメリュー・ジャパン）はRhizobium radiobacter：99%と同定した。Rhizobium radiobacterについて調べると，マッコンキー培地に発育，オキシダーゼ陽性，尿素分解陽性と記載がある7)が，この点は不一致であった（Table 2）。よってRhizobium radiobacterは誤同定と思われた。
| Test tube medium | api 20NE | ID test･NF-18 | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Characteristic | The isolate | Characteristic | The isolate | Characteristic | The isolate |
| TSI | Nitrate reduction | + | Acid productivity from | ||
| Glucose | + | Indol | − | Glucose | + |
| Lactose or Sucrose | + | Glucose fermentation | − | Fructose | + |
| SIM | Arginine | − | Maltose | + | |
| Movement | + | Urease | − | Galactose | + |
| IPA | − | Escrin hydrolysis | + | Xylose | + |
| Indol | − | Gelatin hydrolysis | − | Mannitol | − |
| LIM | β-Galactosidase | + | Sucrose | + | |
| Lysin | − | Assimilation | Lactose | + | |
| Citric acid | − | Glucose | − | Hydrolysis of | |
| VP | − | Arabinose | + | Escrin | + |
| Urease | − | Mannose | − | Urea | − |
| | Mannitol | − | Citric acid | − | |
| | N-Acetyl-Glucosamine | − | β-Galactosidase | + | |
| | Maltose | + | Lysin | − | |
| | Potassium gluconate | + | Arginine | − | |
| | Capric acid | − | Ornithine | − | |
| | Adipic acid | − | Indol | − | |
| | Malic acid | − | Nitrate reduction | + | |
| | Sodium citrate | − | Gelatin liquefaction | − | |
| | Phenyl acetate | − | |||
| | Oxidase | − | |||
api 20NE（ビオメリュー・ジャパン），ID test・NF-18（日水製薬）による同定では菌名が出なかった。
MALDI-TOF MS法を用いた質量分析計による同定では，VITEK-MS（ビオメリュー・ジャパン），MALDI-Biotyper（ブルカー・ダルトニクス）どちらも同定不可であった。
16S rRNA遺伝子解析では，EzBioCloud（Chunlab）と照合し98.7%でP. viniと一致した。
芽胞染色はWirtz芽胞染色キット（武藤化学）で検査した。TSA5%ヒツジ血液寒天培地で好気培養，35℃，24時間での発育コロニーをWirtz染色したが芽胞は確認できなかった。さらに，室温（20～25℃）に4～5日置いてからGram染色すると芽胞様の楕円形構造物が確認できた（Figure 3）。Wirtz染色すると，マラカイト緑に染まった芽胞が確認できた（Figure 4）。
Gram staining findings suggestive of spore formation (×1,000).
In Wiltz staining, spores stained with malachite green could be confirmed (×1,000).
BTB寒天培地に発育を認めなかったため，好塩性を疑いsalt toleranceについて調べた。塩化ナトリウム加ペプトン水（0%，3%，6%，8%，10%）を作成して35℃，24時間，好気培養で発育の有無を確認した。3%のみ発育を認めた。さらに（0%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%）を作成して検査した。0%を除く0.5～3.0%で発育を認めた（Table 3）。
| NaCl | growth |
|---|---|
| 0% | − |
| 3% | + |
| 6% | − |
| 8% | − |
| 10% | − |
| 0% | − |
| 0.5% | + |
| 1% | + |
| 1.5% | + |
| 2% | + |
| 2.5% | + |
| 3% | + |
Judgment at 35°C. 24 hours. Aerobic culture.
薬剤感受性検査は，ドライプレートDP31（栄研化学），ミュラーヒントンブイヨン‘栄研’（栄研化学）を用いて35℃，24時間，好気培養で最小発育阻止濃度（minimum inhibitory concentration; MIC）を測定した（Table 4）。
| DP31 | |
|---|---|
| MIC (μg/mL) | |
| Piperacillin | ≤ 0.5 |
| Cefazolin | 4 |
| Cefotiam | ≤ 0.5 |
| Cefotaxime | ≤ 0.5 |
| Ceftazidime | 1 |
| Cefepime | ≤ 0.5 |
| Flomoxef | 1 |
| Cefpodoxime | ≤ 1 |
| Ampicillin-sulbactam | ≤ 6 |
| Aztreonam | > 16 |
| Imipenem | 1 |
| Meropenem | 1 |
| Gentamicin | ≤ 0.25 |
| Amikacin | ≤ 1 |
| Minocycline | ≤ 0.25 |
| Fosfomycin | > 128 |
| Trimethoprim-sulfamethoxazole | ≤ 10 |
| Levofloxacin | ≤ 0.25 |
Dry plate DP31 (35°C. 24 hours. Aerobic culture.).
好気ボトルに発育した細長いGram陰性桿菌（Figure 1）は，オキシターゼ陰性で，芽胞菌を疑う形態的特徴はなく，当初は腸内細菌科細菌が推定された。
1）VITEK2 GN同定カード，2）api 20NE，3）ID test・NF-18では同定不可であった。
質量分析計，4）VITEK-MS，5）MALDI-Biotyperでも同定不可であった。16S rRNA遺伝子解析によってP. viniと同定できた。上記1）～5）の同定可能菌種にP. viniは登録されていなかった。現在は16S rRNA遺伝子解析以外は同定できないと思われた。
産業分野用検査キットVITEK2 BCL同定カード（ビオメリュー・ジャパン）にはPaenibacillus sp. 14種が登録されているが，P. viniは含まれていなかった。
BTB寒天培地に未発育であったためsalt toleranceについて調べた。0%では未発育で，0.5～3%では発育可能であった（Table 3）。
P. viniの芽胞は，35℃，24時間での発育コロニーでは確認できなかったが，室温に4～5日置いてからWirtz染色すると確認できた（Figure 4）。
Paenibacillus sp.はGram陽性桿菌であるが，本症例と同様にGram陰性桿菌として分離された報告があった1),8)。Gram陽性桿菌とGram陰性桿菌の鑑別として劉の方法が有用であったと報告されていた8)。
本症例において我々は，血液培養ボトルからのGram染色（Figure 1）では，Gram陽性桿菌の可能性や有芽胞菌の可能性を疑うことはなかった。16S rRNA遺伝子解析でP. viniと同定されるまではGram陰性桿菌と考えていた。今回の微生物検査から，通性嫌気性，Gram陰性に染色される場合があり，オキシダーゼ陰性，カタラーゼ陽性，塩化ナトリウム0%では未発育，芽胞形成がP. viniの主な特徴と思われた。
P. viniが血液に侵入した経路は不明であったが，患者の嚥下スクリーニング施行時に義歯にカビ付着の疑いがあり，当院歯科口腔外科を受診した。上顎総義歯に汚れの固着があり，内面の補修剤に劣化が見られた。Paenibacillus sp.は芽胞菌であり，食品腐敗菌として問題視されている報告9)などから，義歯からの侵入に起因するbacterimiaの可能性が考えられた。
今回我々はP. viniを初めて臨床材料から分離した。国内でのP. vini bacteremiaの報告は他に検索できなかったことから，稀症例であると思われた。今後のデータ蓄積と病原性の解明に期待したい。また今回の報告がP. vini同定検査の参考になれば幸いである。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
遺伝子解析同定をして頂きました，佐賀大学医学部附属病院微生物検査室の草場耕二先生に深謝申し上げます。
