Materials
Reexamination of morphological diameter of peripheral blood cells and effect of drying method on diameter
2023 Volume 72 Issue 4 Pages 570-575
Details
2023 Volume 72 Issue 4 Pages 570-575
各種書籍記載の末梢血液細胞の赤血球，血小板，白血球5分画の直径と健常人の末梢血液細胞の直径を比較検討した。方法は薄層塗抹標本を対象者8名（21～23歳）についてウエッジ法で作製後，MG染色を行い，その染色標本を用いて各細胞の直径をデジタル画像から計測した。さらに，乾燥方法についても強制乾燥と自然乾燥の2法について各細胞の直径を対象者で比較検討した。結果，末梢血液細胞のデジタル画像解析による直径計測値は，これまでの各種書籍の記載値とは細胞によっては明らかに近似した好酸球と近似しなかったリンパ球があったが，実測した結果と比較検討を試みることは20歳代における各細胞直径の範囲の手がかりとなりえるものと思われた。乾燥方法の比較では検討した温度，湿度の条件下では，乾燥条件による細胞直径は統計学的に有意な差はなく，影響はみられなかった。
To evaluate cell diameter values in the literature, smears of peripheral blood from eight (21 to 23 years old) subjects were prepared by the wedge method. May-Grünwald-Giemsa staining was then performed and cell diameters were measured from digital images. Measurement results were then compared with literature values for red blood cells, platelets, and the five white blood cell fractions of the subjects. In addition, the effects of two drying methods, forced drying and natural drying, on cell diameters were compared. The diameters measured from digital images of various peripheral blood cells in this study differed depending on red blood cells, platelets, and the five white blood cells described in the literature. No significant differences in cell diameters were observed between forced drying and natural drying.
健常人における末梢血液細胞（赤血球，血小板，好中球，リンパ球，単球，好酸球，好塩基球）の形態学的直径は各種書籍により記載値に差がみられる部分がある。臨床検査技師教育のための教科書，臨床検査現場で使用される検査技術書，医学専門書に記載されている各種末梢血液細胞の直径の範囲に差を認める細胞があり，過去10年以内に発刊された主要な書籍等でみられている1)～11)。そこで，各種書籍の記載範囲の値と比較を行うために通常利用されている薄層塗抹標本をウエッジ法で作製後，May-Grünwald-Giemsa染色（MG染色）を行い，その標本を用いて各種細胞の直径をデジタル画像から計測し，実際の実測値と比較することは，20歳代の年齢層における各種細胞の直径範囲の手がかりとなりえるものと考えた。そこで記載範囲の値と対象者の各種細胞の計測値との比較検討を試みた。さらに，乾燥方法については強制乾燥と自然乾燥の2つの方法について各種細胞の直径を対象者で比較検討を試みた。
室温（22.3～24.4℃），湿度（47～50%）において本学科学生で，本研究に同意を得た8名（男性2名，女性6名，年齢21～23歳で既往歴はない）の末梢血液を2 mL採取し，EDTA-2K加血液を試料とした。対象者の血球計数値は自動血球計数装置Celltac α MEK-1301（日本光電）で求め試料とした。なお，これらの結果値は男性，女性ともに基準範囲にあることを確認した12),13)（Table 1）。
| WBC（×109/L） | RBC（×1012/L） | Hb（g/dL） | Ht（%） | MCV（fL） | MCH（pg） | MCHC（%） | PLT（×109/L） | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 男性（n = 2） | 5.8～7.6 | 5.03～5.39 | 15.0～16.2 | 45.7～49.1 | 90.9～91.1 | 29.8～30.1 | 32.8～33.0 | 297～323 |
| 女性（n = 6） | 4.9～7.5 | 4.19～4.64 | 12.2～13.8 | 37.0～41.4 | 88.3～95.9 | 28.7～32.7 | 32.9～34.9 | 182～282 |
本研究は，京都橘大学研究倫理委員会承認，承認番号20-53（2021年3月18日）で行った。
2． 方法 1） 標本作製と染色塗抹標本作製のための血液量は約5 μL，角度は約30度，塗抹速度は約0.5秒を基本としてウエッジ法にて採血後1時間以内に作製し，強制乾燥法は乾燥条件を保つためにスライドドライヤファン―SDG-F（アズワン）を用いての冷風乾燥と塗抹標本作製後に室内放置の自然乾燥法の2法で共に5分間以上乾燥させた。標本は強制乾燥，自然乾燥の両方について赤血球，血小板用1枚，白血球5分画用1枚を対象者ごとに作製した。染色は標本作製後1時間以内にMG染色の上載せ法で行った。ギムザ使用液はpH 6.4のリン酸緩衝液（1/150 mol/L：アズワン）1 mLにギムザ原液（武藤化学）1.5滴の割合で作製した。標本にメイ・グリュンワルド原液（武藤化学）を15滴載せて5分間静置した後，リン酸緩衝液を等量（15滴）載せて3分間静置した後，水洗をした。そして，ギムザ使用液を標本上に満載し，20分間静置した後，水洗，乾燥させた。
2） 細胞判定と直径計測染色標本の鏡検部位は，引き終わりに近い塗抹部位で，赤血球の分布が均一であり，赤血球2個の重なりが視野の約50%以内を目安とし，ECLIPSE Ni-u顕微鏡及びデジタルカメラDS-Fi3（590万画素）（ニコン）を通じてDS-L4画像解析ユニット（ニコン）を用い油浸鏡検下（1,000倍）にて赤血球，血小板，各種白血球の直径を画像から三浦ら14)の方法を用いて計測した。赤血球と血小板については同一の1標本につき2名が計測した。そのため，赤血球は500細胞 × 2名の1,000細胞，血小板は200細胞 × 2名の400細胞を計測した。なお，白血球は長径 + 短径の平均を計測値として各種細胞の出現頻度より好中球は100細胞，リンパ球は50細胞，単球は20細胞，好酸球は15細胞，好塩基球は10細胞を計測した。計測に際し計測者は血小板の直径と赤血球の直径の計測トレーニング後に同一細胞10回計測による同時再現性を行った（Table 2）。
| 計測者No | 赤血球 | 血小板 | ||
|---|---|---|---|---|
| 平均直径値 （μm） |
CV （%） |
平均直径値 （μm） |
CV （%） |
|
| 1 | 8.2 | 1.5 | 3.0 | 4.7 |
| 2 | 7.7 | 1.7 | 2.5 | 2.3 |
| 3 | 7.7 | 3.0 | 3.2 | 3.4 |
| 4 | 8.5 | 1.3 | 2.8 | 3.4 |
| 5 | 8.0 | 2.2 | 2.6 | 3.6 |
| 6 | 7.5 | 1.1 | 2.7 | 4.1 |
| 7 | 7.8 | 2.3 | 3.2 | 2.0 |
| 8 | 7.9 | 2.1 | 3.0 | 3.3 |
| 9 | 7.7 | 2.1 | 3.0 | 4.0 |
| 10 | 7.9 | 1.7 | 3.1 | 2.9 |
| 11 | 7.8 | 1.2 | 3.1 | 3.5 |
| 12 | 7.9 | 1.7 | 3.1 | 2.3 |
結果，12名の計測した変動係数（CV）は血小板領域の2.5～3.1 μmでは2.3～4.7%，赤血球領域の7.5～8.5 μmでは1.1～3.0%であった。計測者が1名，記録者が2名でパソコン（PC）と実験ノートに直径を記録し，計測した細胞の全てのJPEG画像を解析データとして全てUSB側に保存した。全ての計測標本の細胞固定が十分されいることは赤血球の辺縁のギザギザの有無で確認し，かつ血小板の凝集はみられないことを確認後計測した。なお，デジタル画像解析での数値表示は，計測可能領域の0.1 μmまでを解析数値として表した。
3） 近似値および近似性の表示と統計学的解析赤血球，血小板，白血球5分画（好中球，リンパ球，単球，好酸球，好塩基球）の各測定値は平均値（Mean），CV，標準偏差（SD）で表し，各種書籍記載値の比較のために正規分布化のべき乗変換で下限値と上限値を求めた。塗抹標本作製後の乾燥方法の比較のための有意差検定はWilcoxon符号付順位和検定により行った。各細胞の分散の比較はF検定により行った。なお，p < 0.05を統計学的有意とした。また，赤血球，血小板の本研究値との比較のための近似値は下限値，上限値，平均値ともに数値 ± 0.1 μm以下と設定した。近似性は下限値，上限値，平均値ともに数値 > ± 0.1 μmから数値 ± 0.2 μm以下と設定した。白血球5分画の近似値は下限値，上限値ともに数値 ± 1.0 μm以下と設定した。近似性は下限値，上限値ともに数値 > ± 1.0 μmから数値 ± 2.0 μm以下と設定した。近似値は範囲を狭くし，近似性はやや範囲を広く設定した。
4） 各書籍記載値の赤血球，血小板，白血球分画書籍間差赤血球と血小板は主要な7書籍内（10年以内に発刊）の細胞直径の下限値，上限値について差を求めた。白血球分画は主要な6書籍内（10年以内に発刊）の好中球，リンパ球，単球，好酸球，好塩基球の下限値，上限値について差を求めた。
Table 3には各細胞の統計学的解析を示した。通常行われる強制乾燥染色標本でのMean，SDおよびCVは赤血球では7.6 ± 0.2 μm，CV 3.3%，血小板では2.3 ± 0.3 μm，CV 13.2%であった。白血球5分画については表示の値となった。
;%0A%09%09%09newWindow.document.open();%0A%09%09%09newWindow.document.write('<img src=%22./Graphics/72_23-7_t3.jpg%22>');%0A%09%09%09newWindow.document.close();%0A%09%09)
赤血球と血小板の近似値および近似性を本研究値範囲と7書籍（書籍A1)，書籍B2)，書籍C7)～9)，書籍D3)，書籍E4)～6)，書籍F10)，書籍G11)）についてTable 4に示した。示すように本研究値範囲と近似値または近似性を示したのは，赤血球では4書籍であった。血小板では2書籍であった。
| 項目直径 | 本研究 | 書籍A 2022年 |
書籍B 2017年 |
書籍C 2021年 |
書籍D 2020年 |
書籍E 2022年 |
書籍F 2015年 |
書籍G 2016年 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 赤血球（μm） | 7.1～8.1 | ★7.0～8.0 | 6.5～8.5 | 7.20～8.44 | 6.0～9.5 | ★7.0～8.0 | ★7.5 | ★7.5 |
| 血小板（μm） | 1.7～3.0 | 2.0～4.0 | 2.0～4.0 | 2.0～4.0 | 2.0～3.0 | ●1.5～3.0 | ●1.5～3.0 | 1.0～2.0 |
近似値（★）：下限値，上限値，平均値ともに数値 ± 0.1 μm以下と設定し★印で表示した。
近似性（●）：下限値，上限値，平均値ともに数値 > ± 0.1 μmから数値 ± 0.2 μm以下と設定し●印で表示した。
書籍間差は赤血球では下限値で1.2 μm，上限値で1.5 μmであった。血小板では下限値で1.0 μm，上限値で2.0 μmであった。
3． 白血球分画の各書籍記載値との比較および書籍間差白血球5分画の近似値および近似性を本研究値範囲と6書籍（書籍A1)，書籍B2)，書籍C7)～9)，書籍D3)，書籍E4)～6)，書籍F10)）についてTable 5に示した。白血球5分画の好中球では4書籍であった。リンパ球では近似性はみられなかった（0書籍）。単球では2書籍であった。好酸球では6書籍であった。好塩基球では3書籍であった。
| 項目直径 | 本研究 | 書籍A 2022年 |
書籍B 2017年 |
書籍C 2021年 |
書籍D 2020年 |
書籍E 2022年 |
書籍F 2015年 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 好中球（μm） | 12.6～16.6 | ●12～15 | ●12～15 | ●12～15 | 12～14 | ●12～15 | 10～14 |
| リンパ球（μm） | 9.4～12.9 | 6～15 | 7～15 | 9～16 | 8～20 | 7～16 | 10～16 |
| 単球（μm） | 14.6～18.6 | 13～22 | ●15～20 | ●15～20 | 13～21 | 13～21 | 15～22 |
| 好酸球（μm） | 12.0～17.4 | ★13～17 | ★13～18 | ★13～18 | ★12～18 | ★13～18 | ★12～17 |
| 好塩基球（μm） | 10.7～15.2 | ★10～15 | ★10～15 | 12～16 | 10～12 | 12～16 | ★10～16 |
近似値（★）：下限値，上限値ともに数値 ± 1.0 μm以下と設定し★印で表示した。
近似性（●）：下限値，上限値ともに数値 > ± 1.0 μmから数値 ± 2.0 μm以下と設定し●印で表示した。
書籍間差は好中球では下限値で2 μm，上限値で1 μmであった。リンパ球では下限値で4 μm，上限値で5 μmであった。単球では下限値で2 μm，上限値で2 μmであった。好酸球では下限値で1 μm，上限値で1 μmであった。好塩基球では下限値で2 μm，上限値で4 μmであった。
4． 赤血球と血小板の強制乾燥と自然乾燥における直径の比較乾燥方法の違いによる細胞の直径では赤血球，血小板ともに統計学的に有意な差であるp < 0.05は認められなかった（Table 6）。
;%0A%09%09%09newWindow.document.open();%0A%09%09%09newWindow.document.write('<img src=%22./Graphics/72_23-7_t6.jpg%22>');%0A%09%09%09newWindow.document.close();%0A%09%09)
5分画の結果から，対象者における強制乾燥と自然乾燥とは統計学的に有意な差であるp < 0.05は認められなかった（Table 7）。
;%0A%09%09%09newWindow.document.open();%0A%09%09%09newWindow.document.write('<img src=%22./Graphics/72_23-7_t7.jpg%22>');%0A%09%09%09newWindow.document.close();%0A%09%09)
計測にあたり，直径計測者の同時再現性は計測上許容できる範囲であった。
対象者の赤血球，血小板，白血球分画の直径の計測結果からの各細胞のCVの比較検討では，血小板の直径は赤血球と比較して小型であるためCVが大きいが分散の比較検定では有意差は認めなかった。
白血球5分画では最も細胞の直径が大きいのは単球の16.7 ± 0.9 μm，最も小さいのはリンパ球の11.0 ± 0.8 μmであった。細胞のCVが大きかったのはCV 9.0%の好酸球，小さかったのはCV 5.6%の単球であったが，どちらも分散の比較検定では有意差は認められなかった。
対象者8名の計測値と主要引用文献である各書籍内の記載値範囲について近似値または近似性の比較を試みたところ，赤血球では4書籍であり，評価可能と思われたが，血小板では2書籍と低評価であった。これは今回検討対象の年齢層が影響している可能性があるものと思われた。次に白血球5分画の中で最も近似値が認められたのは，好酸球の6書籍，次に近似性のある好中球の4書籍が評価可能と思われた。但し，好中球については書籍値と比較して直径の上限値が15 μmに対して本研究値では16.6 μmと大型となっていた。これは好中球の計測時での長径 + 短径の平均において長径の大きさが影響したと考えられた。一方，近似値，近似性が0書籍のリンパ球は書籍内細胞の直径上限値が20 μmに対して本研究値では12.9 μmと最も小型となった。これはおそらく，リンパ球には小リンパ球と大リンパ球が存在する1)ため細胞直径を計測する際にその出現頻度により影響している可能性があり，今回の測定対象者が20歳代であることが関係している可能性があるものと思われる。
本研究条件である室温（22.3～24.4℃），湿度（47～50%）での乾燥方法の違いによる赤血球においては，三浦ら14)，大仲ら15)も末梢血液の強制乾燥と自然乾燥の直径には有意な差は認められなかったと報告しており，同様な結果を示すものであった。さらに，白血球5分画の直径においても有意な差は認められなかった。好中球とリンパ球の強制乾燥と自然乾燥の比較では有意に自然乾燥で縮小したと報告されている15)が標本作製時の温度，湿度の条件，計測方法，計測細胞数についての記載がないため同一的に評価することは困難と思われた。本研究の条件下では赤血球，血小板，白血球5分画には強制乾燥，自然乾燥による細胞の直径には影響しないと考えられた。これは現在，塗抹標本作製は検査室，研究室，実習室等で行われているが，部屋の空調により温度，湿度はある程度一定に保たれており，自然乾燥による影響を受けにくいと考えられる。
本研究では検討した年齢層による偏り，少数対象者数，一施設での研究ではあるが，得られた各細胞の実測した計測値と各種の書籍記載範囲値と比較検討することで20歳代の細胞の直径として表示することは20歳代における各細胞直径の範囲の手がかりとなりえるものと考えられた。将来的には多施設，多数対象者による細胞計測研究が進展することを期待したい。さらに，書籍に示された各種細胞の直径の記載範囲に部分的な書籍間差が認められることから，記載値の統一性が望まれると思われた。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
本論文執筆にあたり，本研究のためのデータ集積をしていだきました1期生6名，2期生6名の本研究室に配属された卒業研究学生諸氏に深謝いたします。
