Polymorphic analysis of barley Mlo genes and evaluation of usefulness of DNA markers for selection of powdery mildew resistance among Japanese barley

摘　要

日本のオオムギ育種への利用が急がれる重要なうどんこ病抵抗性遺伝子mloを海外品種から効率的に交配導入するため，うどんこ病抵抗性mlo品種Alexis，Chariot，Pallas (mlo5)と国内の主要オオムギ品種について，Mlo遺伝子近傍領域の塩基配列多型を調査するとともに，既往のMlo遺伝子型判別DNAマーカーのうち，日本品種への利用に適したDNAマーカーとその効率的な利用のための留意点を明らかにした．Mlo遺伝子近傍の3領域計1779 bpの塩基配列を比較した結果，供試35品種・系統間には合計33個の1塩基置換変異（SNPs）あるいは欠失・挿入変異（In/Del）が見出され，変異の組合せによって8種のハプロタイプ（A～H）に分類できた．日本品種・系統と海外のmloを持つ3品種との間に共通する特異的な変異は見出されなかったが，Alexis，Chariot（タイプA，B）に限定すれば日本品種・系統との間に特異的に異なる2つのSNPsが見出された．供試したmloを持つ3品種のなかでChariotのみは既往のMlo遺伝子型判別CAPSマーカーom6が供試したすべての日本品種・系統とは異なり，DNAマーカー選抜に有利な抵抗性遺伝子供与親であることがわかった．さらに，制限酵素処理を必要としない省力・効率的なPCRマーカーom2については，二条オオムギを中心としたハプロタイプHの日本品種・系統であれば，供試した抵抗性mlo品種のいずれともマーカー型が異なり，選抜利用できることが明らかとなった．実際にAlexis × ハルヒメボシのF₂ 80個体について，うどんこ病幼苗検定とom2マーカー型の調査を行った結果，抵抗性の有無とマーカー型判定結果が完全に一致し，Alexisの持つ抵抗性mlo遺伝子が日本品種との交配後代においても有用であること，om2マーカーによる抵抗性mlo遺伝子の選抜が可能であることが実証できた．これらのことから，日本でのオオムギ育種においても，om2あるいはom6マーカーを利用することにより，mlo遺伝子を導入したうどんこ病抵抗性新品種の開発を効率的に進めることができると考えられた．

緒言

うどんこ病はオオムギの収量や品質に悪影響を与える重要病害である（Carver and Griffiths 1981, Jerkin 1984, 五‍月女ら 1999）．薬剤での防除が比較的容易な病害ではあるが，防除コストや薬剤耐性を持つ新たなレース発生などの問題がある（Paynter et al. 2011）．

オオムギではうどんこ病抵抗性に関わる多くの遺伝子座・遺伝子が知られており，抵抗性育種に利用されている（Jorgensen 1993）．特に，1H染色体に座乗するMla座やMlk座あるいは4H染色体上のMlg座の優性抵抗性遺伝子や同じく4H染色体上のmlo座の劣性遺伝子などを利用した抵抗性品種が海外では多数育成されている（Dreiseitl and Jorgensen 2000, Dreiseitl 2007, Dreiseitl and Yang 2007, Jensen et al. 1992）．しかし，これまで特に欧州のうどんこ病抵抗性育種では「新たな抵抗性遺伝子を導入した新品種の開発」と「抵抗性を打破する新たなうどんこ病菌レースの発生・増大」が繰り返され，これらの問題を解決するために新たな抵抗性遺伝子の利用や抵抗性遺伝子の集積が重要な課題となっている（Andersen 1991, Jorgensen 1984）．同様に，日本でもうどんこ病菌レースの変化による抵抗性品種の罹病化の例が知られており，うどんこ病菌レースの変化に備えた抵抗性育種の必要性が示唆されている（増田1993）．

Mlo座のうどんこ病抵抗性遺伝子mloは，うどんこ病菌レースの変化が激しい欧州でも30年以上にわたり安定した抵抗性を示している貴重な遺伝子である（Peterhansel and Lahaye 2005, Jorgensen 1992）．Mlo座には多くの複対立抵抗性遺伝子の存在が知られている．エチオピア在来種に由来するmlo-5やmlo-11，突然変異により誘発されたmlo-9など25以上の複対立遺伝子が報告されている（Jorgensen 1992）．1970年代後半にmlo-11遺伝子を利用した初の抵抗性育成品種Atemが開発されて以降，急速にmlo品種の開発が進み，現在では欧州の春播オオムギ品種のうち半数以上はmlo-11を保有している（Peterhansel and Lahaye 2005）．

一方，日本でのうどんこ病抵抗性品種の開発は二条品種が中心となって進められてきた．普及している六条品種や六条新品種のほとんどが罹病性であるのに対して，二条品種はほぼすべてが抵抗性を有している．国内の抵抗性二条品種・系統の多くは1970年にスウェーデンで開発された二条品種Monaに由来するMla座の抵抗性遺伝子Mla9 を持つものである（河田ら 1995）．Mla9遺伝子を判別できるDNAマーカーも開発されており，育種利用が始まっている（長嶺ら 2010）．

しかしMlo座の抵抗性遺伝子については国内でもその有効性に関しては報告されているが（部田・武田 1995），実用品種・系統の開発には至っていない．うどんこ病抵‍抗‍性育種の遅れている六条オオムギ育種だけでなく，抵抗性をMla9遺伝子に集中依存している二条品種にとっても，Mlo座の抵抗性遺伝子の利用は重要な育種課題である．Mlo座については遺伝子本体の塩基配列がBuschges et al.（1997），Panstruga et al.（1998）（Genebank Y14573.1）によって報告されている．また，野生型（罹病型）Mlo遺伝子にコードされるタンパク質MLOは，原形質膜への小胞輸送に役割を持つと考えられており細胞膜を7回貫通する構造を有し，うどんこ病菌がオオムギと親和性の関係を築くうえで必要な要素であることが解明されている（Devoto et al. 1999, Panstruga and Schulze-Lefert 2003）．

一方，Tacconi et al.（2006）は，欧米品種やさまざまなmlo複対立遺伝子を持つ品種について，その塩基配列変異を明らかにするとともに，その変異に基づいた7種のDNAマーカー（om1～om7）とマーカー型の品種間多型を明らかにしている．さらに供試された欧州の71品種は，omマーカー型によって5種類のハプロタイプに分類され，抵抗性品種も3種類のハプロタイプに分かれることが報告されている．

今後日本品種へのmlo遺伝子の効率的な育種導入にあたっては，これらの情報をふまえて日本品種の変異解明と適用可能なDNAマーカーを明らかにする必要がある．そこで本研究では，mlo-9を持つAlexis，mlo-11を持つChariot及びmlo-5を持つPallas同質遺伝子系統Pallas (mlo5)から日本品種への抵抗性mlo遺伝子の交配導入を目的として，国内の六条皮麦品種・系統のほか，一部の二条性やはだか性の品種・系統を含めてMlo遺伝子近傍領域の塩基配列変異の解析を行い，DNAマーカー選抜に適したomマーカーを明らかにした．

材料及び方法

Mlo遺伝子近傍領域の塩基配列の解析

Mlo遺伝子近傍領域の塩基配列の解析には，うどんこ病抵抗性mlo-9遺伝子を持つAlexis，mlo-11を持つChariot，mlo-5を持つPallas (mlo5)と北陸センターでのオオムギ育種において交配母本として利用されている日本品種など計35品種・系統を用いた．

塩基配列の解析は，Mlo遺伝子5'上流のS2領域（812 bp），下流のS5領域（644 bp），S7領域（343 bp）についてダイレクトシーケンス法により行った（図1）．シーケンス鋳型DNAの増幅のためのPCRプライマー配列はTacconi et al.（2006）に準じた．S2，S5及びS7領域の増幅プライマーにはそれぞれom2F/2R（om2F:5'-tagcaatcacggtcacgtcaac-3'; om2R:5'-ccgcaaggctgctatgaaaaggg-3'），om5F/5R（om5F:5'-cacacatttagcttgtcaggcctcag-3'; om5R:5'-caggacctgcccgtcattctgcttt-3'）及びom7F/7R（om7F:5'-aacttggcagcgatcagagcatttgg-3'; om7R:5'-ggaaaacgggggaacatcttcatacg-3'）を用いた．PCR反応液（全量30 μl）の組成は，BlendTaq Plus（TOYOBO）0.5 μl（1.25 U），10 × PCR緩衝液（BlendTaq添付品）3 μl，10 mM dNTPs 3 μl，100 μMプライマー各0.16 μl，鋳型ゲノムDNA 0.4 μl（約5 ng），イオン交換水22.8 μlとした．PCRにはTAKARA PCR Thermal Cycler Dice（タカラバイオ）を用い，温度プログラムは94℃ 4分－（94℃ 30秒－60℃ 30秒－72℃ 45秒） × 35サイクル－72℃ 7分の条件で行った．

図1．

Mlo遺伝子近傍の塩基配列解析領域

□　omマーカーの認識部位．数字はGenebank AY14573.1における塩基番号

なお，鋳型ゲノムDNAは各品種・系統の種子胚を工作用ルーターPT-αII（東洋アソシエイツ）で削りだした粉サンプルからIkeda et al.（2002）の方法によって調製した．

ダイレクトシーケンス分析のプライマーにはそれぞれom2F，om5F及びom7Fを用い，解析はドラゴンジェノミクスセンター（タカラバイオ）に依頼した．また，塩基配列の品種・系統比較には日本DNAデータバンク（DDBJ）のオンラインプログラムClustalW（ver2.1）を用いた（Larkin et al. 2007）．変異部位の塩基番号は，Mlo遺伝子塩基配列の公開情報（品種Ingrid，Genebank AY14573.1）に対応した表記とした．

om2及びom6マーカー型の品種間差異

om2及びom6マーカー型分析には国内寒冷地で育成された六条皮麦のほか，主要なビール麦，はだか麦品種・系統のほか，前述の塩基配列解析に用いたうどんこ病抵抗性mlo品種などを含む多様な100品種・系統を用いた．

om2及びom6マーカー型の分析はTacconi et al.（2006）の方法に準じた．すなわち，om2マーカー型についてはMlo遺伝子近傍領域の塩基配列解析の項で述べたPCR条件で増幅し，アガロースゲル電気泳動に供した．一方，CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）マーカーであるom6については，前述のom5プライマーを用いたPCR後に各チューブに制限酵素XmiI 1 U（0.1 μl）（Fermentas International）と酵素に添付された10倍緩衝液1.7 μlを加え，37℃で15時間の処理を行った．

アガロースゲル電気泳動にはTBE緩衝液（89 mM Tris，89 mMホウ酸，2 mM EDTA）及び1.2%アガロースゲル（Sigma-Aldrich，type Ⅱ）を用いた．PCR産物（om2）あるいは制限酵素処理産物（om6）の各サンプルに30%グリセロールを含むTBE緩衝液3 μlを混和したのち，100 Vで20分間泳動した．電気泳動のゲルはエチジウムブロマイド水溶液（50 ug/100 ml）で染色後，UVサンプル撮影装置FAS-Ⅲ（TOYOBO）によって，泳動パターンを撮影した．

F₂幼苗検定によるうどんこ病抵抗性の評価とom2マーカー型分析

実験にはAlexis × ハルヒメボシのF₂ 80個体を用いた．両親の特性は表1に示した．セルトレイ（縦3 × 横3 cm × 深さ3 cm/セル）に一粒ずつ播種し，気温15～20℃，12時間日長に設定した温室で生育させた．発病程度の確認のために，両親品種各5個体をセルトレイの両脇に栽植した．抵抗性の評価にはうどんこ病罹病性品種ファイバースノウに発生・増殖したうどんこ病菌を用いた．セルトレイへのF₂個体の播種後10日目に，うどんこ病が多発したファイバースノウを栽植したポットをセルトレイの外周に配置し，うどんこ病菌の感染を促した．その後，5日おきにすべてのF₂個体での病斑の有無を調査した．4回の調査（20日後）で病斑形成のなかった個体を抵抗性と判定した．

表1． F₂分析に用いた交配親の特徴

品種名	うどんこ病 反応	Mlo座 遺伝子 型	本研究でのマーカー型 分類結果
			om2 マーカー型	om2 PCR 増幅長
Alexis	抵抗性	mlo9	In型	1092 bp
ハルヒメボシ	罹病性	Mlo	Del型	750 bp

各個体の葉から鋳型DNAを抽出し，前述の方法でom2マーカー型を判定し，うどんこ病抵抗性との関係を調査した．

結果

Mlo遺伝子近傍領域塩基配列の品種・系統間変異

供試した35品種・系統において，1塩基置換（SNP）あるいは挿入・欠失変異（In/Del）がS2領域には17個，S5領域に4個，S7領域に12個の計33個の変異が見られた（表2）．これらの変異の組み合わせによって，供試品種・系統は，A～Hの8種のハプロタイプに分類された（表2）．

表2． Mlo遺伝子近傍領域に見られた塩基配列の品種間変異

Mlo遺伝子型	品種・系統名	ハプロ タイプ	S2領域																		S5領域					S7領域
			塩基番号（Y14573.1における）/omマーカーの識別部位（制限酵素名）
			8335	8372	8428– 8821	8515	8589	8750– 8759	8811– 8822	8854	8859	8879	8882	8885	8895	8903	8908– 8915	8949	8988		15499	15707	15786	17928		17958	17964	17984	17990	18002	18011	18017	18019	18021	18080	18226	18269
					om2 （In/del 変異）																	om5 (BsmI)	om6 (XmiI)					om7 (HpaII)
mlo9	Alexis	A	C	A	In	G	T	In	In	A	C	C	G	G	C	T	In	A	A		G	G	G	G		G	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
mlo11	Chariot	B	C	A	In	G	T	In	In	A	C	C	G	G	C	T	In	A	A		G	C	A	G		G	G	G	T	G	T	T	T	C	A	A	A
mlo5	Pallas (mlo5)	C	C	A	In	G	T	In	In	A	C	C	G	G	C	T	In	A	A		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	Pallas	D	C	A	In	G	T	In	In	A	C	C	G	G	C	T	In	A	A		G	C	A	A		G	G	G	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	Pallas (Mlg)	E	C	A	In	G	T	In	In	A	C	C	G	G	C	T	In	A	A		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	関東二条43号	E	C	A	In	G	T	In	In	A	C	C	G	G	C	T	In	A	A		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	シルキースノウ	F	T	A	In	G	C	Del	In	G	C	C	G	G	C	C	In	A	A		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	北陸皮35号	F	T	A	In	G	C	Del	In	G	C	C	G	G	C	C	In	A	A		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	北陸皮38号	F	T	A	In	G	C	Del	In	G	C	C	G	G	C	C	In	A	A		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	新系B483	F	T	A	In	G	C	Del	In	G	C	C	G	G	C	C	In	A	A		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	東北皮42号	F	T	A	In	G	C	Del	In	G	C	C	G	G	C	C	In	A	A		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	東北皮44号	F	T	A	In	G	C	Del	In	G	C	C	G	G	C	C	In	A	A		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	関東皮96号	F	T	A	In	G	C	Del	In	G	C	C	G	G	C	C	In	A	A		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	関系b573	F	T	A	In	G	C	Del	In	G	C	C	G	G	C	C	In	A	A		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	ファイバースノウ	G	C	G	In	C	T	Del	In	G	T	T	G	G	C	C	Del	A	A		T	G	G	A		A	A	C	G	A	C	G	C	T	G	T	G
Mlo	ミノリムギ	G	C	G	In	C	T	Del	In	G	T	T	G	G	C	C	Del	A	A		T	G	G	A		A	A	C	G	A	C	G	C	T	G	T	G
Mlo	ミユキオオムギ	G	C	G	In	C	T	Del	In	G	T	T	G	G	C	C	Del	A	A		T	G	G	A		A	A	C	G	A	C	G	C	T	G	T	G
Mlo	シュンライ	G	C	G	In	C	T	Del	In	G	T	T	G	G	C	C	Del	A	A		T	G	G	A		A	A	C	G	A	C	G	C	T	G	T	G
Mlo	はるしらね	G	C	G	In	C	T	Del	In	G	T	T	G	G	C	C	Del	A	A		T	G	G	A		A	A	C	G	A	C	G	C	T	G	T	G
Mlo	ビューファイバー	G	C	G	In	C	T	Del	In	G	T	T	G	G	C	C	Del	A	A		T	G	G	A		A	A	C	G	A	C	G	C	T	G	T	G
Mlo	北陸皮50号	G	C	G	In	C	T	Del	In	G	T	T	G	G	C	C	Del	A	A		T	G	G	A		A	A	C	G	A	C	G	C	T	G	T	G
Mlo	関東皮92号	G	C	G	In	C	T	Del	In	G	T	T	G	G	C	C	Del	A	A		T	G	G	A		A	A	C	G	A	C	G	C	T	G	T	G
Mlo	東北皮41号	G	C	G	In	C	T	Del	In	G	T	T	G	G	C	C	Del	A	A		T	G	G	A		A	A	C	G	A	C	G	C	T	G	T	G
Mlo	東山皮100号	G	C	G	In	C	T	Del	In	G	T	T	G	G	C	C	Del	A	A		T	G	G	A		A	A	C	G	A	C	G	C	T	G	T	G
Mlo	東山皮糯109号	G	C	G	In	C	T	Del	In	G	T	T	G	G	C	C	Del	A	A		T	G	G	A		A	A	C	G	A	C	G	C	T	G	T	G
Mlo	東山裸112号	G	C	G	In	C	T	Del	In	G	T	T	G	G	C	C	Del	A	A		T	G	G	A		A	A	C	G	A	C	G	C	T	G	T	G
Mlo	東山皮113号	G	C	G	In	C	T	Del	In	G	T	T	G	G	C	C	Del	A	A		T	G	G	A		A	A	C	G	A	C	G	C	T	G	T	G
Mlo	イチバンボシ	G	C	G	In	C	T	Del	In	G	T	T	G	G	C	C	Del	A	A		T	G	G	A		A	A	C	G	A	C	G	C	T	G	T	G
Mlo	スカイゴールデン	H	C	G	Del	―1)	―1)	―1)	Del	G	C	C	Del	C	T	C	Del	T	G		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	サチホゴールデン	H	C	G	Del	―	―	―	Del	G	C	C	Del	C	T	C	Del	T	G		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	ミハルゴールド	H	C	G	Del	―	―	―	Del	G	C	C	Del	C	T	C	Del	T	G		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	小春二条	H	C	G	Del	―	―	―	Del	G	C	C	Del	C	T	C	Del	T	G		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	ハルヒメボシ	H	C	G	Del	―	―	―	Del	G	C	C	Del	C	T	C	Del	T	G		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	北陸皮48号	H	C	G	Del	―	―	―	Del	G	C	C	Del	C	T	C	Del	T	G		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A
Mlo	北陸皮49号	H	C	G	Del	―	―	―	Del	G	C	C	Del	C	T	C	Del	T	G		G	G	G	A		A	G	C	T	G	T	T	T	C	A	A	A

¹⁾ ―は当該領域がom2領域のDel変異に含まれていて，変異検出ができない部位

mlo抵抗性を持つ海外3品種はいずれも異なるタイプ（A，B，C）に分かれた．タイプEにPallas (Mlg)とともに分類された秋播型二条ビール醸造用系統関東二条43号を除いて，日本品種・系統は3タイプ（F，G，H）に分類された．タイプFはシルキースノウなどの六条皮麦8品種・系統，タイプGには寒冷地向け六条皮麦普及品種（ファイバースノウ，ミノリムギ，ミユキオオムギ）の他，高β-グルカン二条品種ビューファイバー，はだか麦品種イチバンボシなどもっとも多い計14品種・系統が分類された．タイプHはビール醸造用二条品種4品種（スカイゴールデン，ミハルゴールドなど）と北陸研究センターで最近育成された雲型病抵抗性を持つ六条皮麦系統（北陸皮48号，49号）のほか，四国研究センター育成のはだか麦ハルヒメボシの計7品種・系統が分類された．

33個の変異のうち，供試したうどんこ病抵抗性mloを持つ3品種のみに特異的な変異は存在しなかった．ただし，タイプA，Bの抵抗性mlo品種（Alexis，Chariot）については塩基番号17928のSNPが他タイプの品種・系統には見られない特異的な変異であった．また，Tacconi et al.（2006）がmlo選抜用DNAマーカーとして開発したom5（塩基番号15707），om6（同15786）及びom7（同17984）の認識部位については，Chariotのみがいずれの部位でも日本品種・系統とは異なるSNPsを持ち，逆にAlexisとPallas (mlo5)はすべて日本品種・系統と同一であった．

om2及びom6マーカー型の品種・系統間変異

Tacconi et al.（2006）のCAPSマーカーom6と，塩基番号8428から8821に至る393 bp領域の欠失の有無（In/Del変異）を判別するPCRマーカーom2について，多様な日本品種・系統を中心とする100品種・系統のマーカー型を調査した結果を表3に示した．

表3． オオムギ日本品種・系統とmlo抵抗性品種のom2及びom6マーカー型

om2/om6型 グループ	om2 マーカー型	om6 マーカー型	品種・系統名1)										ハプロ タイプ2)
Ⅰ	In型	486+ 291 bp型	Alexis	Pallas (mlo5)	Pallas (Mlg)	あかぎ二条	イチバンボシ	きぬゆたか	キラリモチ	クモガタシラズ	コウゲンムギ	サンシュウ	A, C, E, F, G
			シュンライ	しゅんれい	シルキースノウ	ダイシモチ	つゆしらず	とね二条	なす二条	ニシノホシ	はるしらね	はるな二条
			ビューファイバー	ファイバースノウ	べんけいむぎ	ほしまさり	ﾐサトゴールデン	ミノリムギ	ミホゴールデン	ミユキオオムギ	ヤシオゴールデン	会津裸
			四国裸112	会津1	会津裸3	会津6	会津7	会津22	関系b573	関東二条43	関東皮82	関東皮92
			関東皮96	四国裸117	新系B483	中間母本農1	東山皮100	東山皮101	東山皮糯109	東北皮18	東北皮19	東北皮20
			北陸皮10	東北皮21	東北皮22	東北皮25	東北皮27	東北皮28	東北皮33	東北皮41	東北皮42	東北皮43
			東北皮44	北陸皮11	北陸皮12	北陸皮13	北陸皮14	北陸皮15	北陸皮16	北陸皮19	北陸皮20	北陸皮21
			北陸皮22	北陸皮23	北陸皮24	北陸皮25	北陸皮26	北陸皮27	北陸皮35	北陸皮38	北陸皮50
Ⅱ		777 bp型	Chariot	Pallas									B, D
Ⅲ	Del型	486+ 291 bp型	あまぎ二条	カシマムギ	サチホゴールデン	さつきばれ	スカイゴールデン	ダイセンゴールド	ニシノゴールド	ニューゴールデン	マンネンボシ	ミカモゴールデン	H
			りょうふう	関東皮78	四国裸84	小春二条	東北皮26	徳島モチ裸	栃木ゴールデンメロン	北陸皮48	北陸皮49
Ⅳ		777 bp型	（なし）										―

¹⁾ 斜字品種は抵抗性mlo遺伝子を持つ品種．

²⁾ Mlo遺伝子近傍塩基配列の変異によって分類した表1でのハプロタイプ．斜字ハプロタイプは日本品種・系統を含むもの．

om2及びom6のマーカー型組合せによって分類される4グループ（Ⅰ～Ⅳ）のうち，日本品種・系統はすべてグループⅠ（76品種・系統）あるいはグループⅢ（19品種・系統）に分類され，ChariotとPallasのみがグループⅡとなった．すなわち，om6マーカー型については，供試したすべての日本品種・系統が制限酵素XmiIによって切断される「486 + 291 bp型」であった．また，om2マーカーでは，供試したmloを持つ3品種はいずれも393 bp領域を持つIn型を示し，供試した日本品種・系統でも83.2%（79品種・系統）がIn型であった．一方，393 bp領域を欠失するDel型を示した19品種・系統のなかには，カシマムギやマンネンボシ，北陸皮48号など六条種7品種・系統も存在したが，12品種・系統は二条種であった．二条種だけで見ると42.8%がDel型で，六条種におけるDel型比率10.4%（7/67品種・系統）に比べて著しく高い値を示した．

F₂幼苗検定によるうどんこ病抵抗性の評価とom2マーカー型分析

Alexis × ハルヒメボシのF₂ 80個体のうどんこ病反応及びom2マーカー型は表4のように分離した．うどんこ病の抵抗性：罹病性は1遺伝子劣性（1:3）の仮説に適合した（P>0.995）．また，抵抗性F₂個体のom2マーカー型はすべてAlexis型ホモ（In型）で，罹病性個体はハルヒメボシ型ホモ（Del型）あるいはヘテロ型であった．これらのことから，F₂でのうどんこ病抵抗性はAlexis由来のmlo-9遺伝子に起因し，om2マーカーによってmlo-9選抜が可能であることが示された．

表4． Alexis × ハルヒメボシF₂ 80個体におけるうどんこ病検定及びom2マーカー型の個体数

		om2マーカー型
		Alexis型（In型）	ヘテロ型	ハルヒメボシ型（Del型）
うどんこ病検定	抵抗性	20​	0​	0​
	罹病性	0​	34​	26​

うどんこ病抵抗性とom2マーカー型が共分離する想定におけるχ²検定結果：χ² = 2.7（P>0.4）

考察

Mlo座のうどんこ病抵抗性遺伝子は，あらゆるうどんこ病菌レースに対しての抵抗性を示し，レース変化の激しい欧州においても30年以上にわたって抵抗性崩壊が生じていない．このことから，抵抗性mlo遺伝子は，日本でのオオムギ育種においても極めて重要かつ早期の育種利用が必要な遺伝子であると考えられる．ビール醸造用二条オオムギ品種では，過去のうどんこ病罹病性品種が病害による顕著な収量・品質の低下が問題となったことから（五月女ら 1999），Mla9遺伝子を活用した抵抗性品種を多く開発・普及させ，問題を解決したが，単一の抵抗性遺伝子に依存した状況はうどんこ病菌レース変化による抵抗性崩壊のリスクを抱えている．また，六条オオムギでは従来品種のなかには「中」～「やや強」程度の抵抗性を持つものがあったことや，登熟期が少雨乾燥条件の年には発病があまり見られないこと，赤かび病防除などに利用される薬剤が副次的にうどんこ病の抑制にも効果を示したことなどから，うどんこ病抵抗性は必ずしも重点的な育種目標としてはされてこなかった．しかし，多雨多湿条件での登熟年や，十分な穂数確保や粒重増大を目途とした多肥多収栽培条件ではうどんこ病の多発が収量・品質の抑制要因となっており，抵抗性六条品種の開発が多収化を達成するためには特に重要な課題と考えられる．

本研究では，海外品種が持つうどんこ病抵抗性mlo遺伝子をDNAマーカーを用いた交配育種によって日本品種に導入するのに必要な情報を明らかにすることを目的として，1）Mlo遺伝子コード領域（CDS）近傍のSNPsを識別するTacconi et al.（2006）のomマーカー群領域の塩基配列変異の解析と，2）その中で有用性が見出されたom2及びom6マーカーについて，日本品種・系統や海外のmloを持つ3品種の分析を行ったものである．すなわち，本研究ではomマーカー群はmlo遺伝子の選抜に有用なマーカーであるが，海外品種で開発されたDNAマーカーを遺伝的バックグラウンドが大きく異なると考えられる日本品種を母本とする育種で利用するために必要なマーカーの多型の有無，適用可能な品種群を明らかにした．

Mlo遺伝子近傍領域の解析では計33個の変異（SNPsあるいはIn/Del）の組合せによって，日本品種・系統や海外品種をA～Hの8種のハプロタイプに分類した（表2）．この結果から，日本品種を母本とした組合せでのmlo遺伝子選抜に有用と考えられたom2とom6マーカーについて，より広範な国内品種・系統のマーカー型を確認した（表3）．

海外mlo品種にもマーカー多型があるため，交配組合せによって適用可能なマーカーは異なると考えられた．そこで，マーカー型やmlo抵抗性供与親に応じて適用可能な選抜マーカーを表5にまとめた．供試した日本品種・系統はすべてom2/om6マーカー型グループIあるいはⅢに分類されたことから，交配母本として育種利用されている日本品種・系統の大半は，Chariotをmlo抵抗性供与親に用いているかぎり，om2あるいはom6マーカーでの選抜が可能であると考えられた．逆に，交配母本にAlexisとPallas (mlo5)を用いた場合，日本品種・系統に多いグループⅠではいずれのマーカーも多型が見られないため選抜利用はできないと考えられた．Chariotをmlo抵抗性供与親とする場合，om6マーカーはom2マーカーが適用できないグループⅠに対しても適用できるため，日本の大麦育種においては特に汎用性が高い．om6マーカーは塩基番号15786のSNPを認識するDNAマーカーであり，Chariotは第15786塩基にアデニン（A）を有する．Tacconi et al.（2006）は，塩基番号15786がアデニンの抵抗性mlo品種としてDitta，Fermentを報告しており，これらの品種を交配母本とした場合もom6マーカーが同様に利用可能であると推察される．なお，両品種ともChariotと同じmlo-11を有する．

表5． 交配組合せ（Mlo罹病性品種 × mlo抵抗性供与親）に応じたmlo抵抗性選抜用omマーカーの選択

Mlo（罹病性）親					×	mlo抵抗性 供与親	選抜利用可能な マーカー
om2/om6型 グループ	ハプロ タイプ1)	om2 マーカー型	om6 マーカー型	日本品種の例
Ⅰ	A, C, E, F, G	In型	486+291 bp型	シルキースノウ ファイバースノウ イチバンボシなど	×	Alexis Pallas (mlo5)	×
					×	Chariot	om6
Ⅱ	B, D		777 bp型	―	×	Alexis Pallas (mlo5)	om6
					×	Chariot	×2)
Ⅲ	H	Del型	486+291 bp型	スカイゴールデン ハルヒメボシなど	×	Alexis Pallas (mlo5)	om2
					×	Chariot	om2, om6

¹⁾ Mlo遺伝子近傍塩基配列の変異によって分類した表1でのタイプ．斜字は日本品種・系統を含むタイプ．

²⁾ ×はom2, om6で選抜できない組合せ

なお，グループⅢは日本品種・系統では比較的少数ではあるが，交配親とする場合にはmlo供与親に関わらず，いずれのマーカーも適用可能であるが制限酵素処理を必要としないom2マーカーのほうが効率的である．

なお，mlo遺伝子によるうどんこ病抵抗性の発現にはRor1及びRor2遺伝子が必要とされる（Frialdenhoven et al. 1996）．すなわち，mlo遺伝子を導入した場合でもRor1やRor2などの補足遺伝子が欠失すれば，抵抗性は発現しない．今回の実験に用いたmlo抵抗性品種Alexis×Mlo罹病性品種ハルヒメボシのF₂集団ではom2マーカーによって判定したmloホモ個体はすべて抵抗性を示した（表4）．したがって，日本品種ハルヒメボシはmlo遺伝子による抵抗性発現に必要な補足遺伝子を保持していたと考えられる．今後，さらに交配組合せ数を拡大して検討する必要はあるが，日本品種・系統を母本とした場合でもmlo遺伝子による抵抗性発現が可能であることが確認された．

今後の課題としては，組合せに依存したマーカー選択を回避するためにAlexis，Chariotが特異的に持つ塩基番号17928のSNP（表2）を活用したより汎用性が高いマーカーの開発や，他の交配組合せでのmlo抵抗性の確認などが必要であろう．また，今回のF₂個体では全く認められなかったが，mlo品種では葉身のネクロシスが発生し，収量が5%程度低下するとの報告（Brown 2002）もあり，今後のmlo品種の育成においてもネクロシスの発生や収量性について注意が必要であろう．

謝辞

本研究の多くは農林水産省委託プロジェクト「水田の潜在能力発揮等による農地周年有効活用技術の開発（水田底力プロ）」によって実施するとともに，研究材料の一部は農業生物資源研究所・農業生物資源ジーンバンクからの配布を受けた．関係各位に御礼申し上げる．

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