Clinical Application of Fluorescence Technology Using Indocyanine Green and 5-Aminolevulinic Acid

Abstract

肉眼では捉えることができない生体情報を可視化する手段として，インドシアニングリーン（ICG）蛍光法と，5-アミノレブリン酸（5-ALA）を用いた光線力学診断（PDD）は幅広い臨床分野でその有用性が期待されている．ICG蛍光，5-ALA-PDD観察を併用した蛍光ガイド下手術は，手術の安全性，治療成績の向上に貢献しており，今後の薬剤開発とともに照射装置の発展により，さらに低侵襲で診断能の高い画像システムの開発が望まれている．

Translated Abstract

New diagnostic techniques, such as near-infrared fluorescence using indocyanine green (ICG) dye and photodynamic diagnosis (PDD) using 5-aminolevulinic acid (5-ALA), are useful in various clinical fields for visualizing biological information that cannot be detected by the naked eye. Fluorescence-guided surgery combined with ICG fluorescence and 5-ALA-PDD improves surgical safety and treatment results. The evolution of irradiation equipment along with future drug exploitation is expected to lead to accurate diagnosis with minimally invasive methods and development of a high-quality image system.

1.  緒言

我々は日常生活から産業全般にわたるまでX線，光，電波などの「電磁波」を様々な形で活用している．放射線や内視鏡を用いた医療はもちろんのこと，それぞれの電磁波の波長帯の特性を活かして，日常診療において光線技術を用いた診断，治療が行われるようになってきており，消化器外科領域においても光を用いた新規診断技術が開発応用されてきている¹⁾．ここでは，インドシアニングリーン（Indocyanine green: ICG）を用いたICG蛍光法と，5-アミノレブリン酸（5-aminolevulinic acid: 5-ALA）を用いた光線力学診断（Photodynamic diagnosis: PDD）に焦点を当てて，我々の施設での経験を踏まえて概説し，今後の展望にも触れたい．

2.  ICG蛍光法

ICGは生体透過性の高い波長である近赤外光が照射されるとICG分子のエネルギー状態が高くなり，照射した近赤外光よりも若干波長の長い近赤外蛍光を発するという蛍光特性を有している．ICG蛍光観察ではこの近赤外蛍光を捉えて，対象とする生体構造の表面から10 mm程の範囲内で深部構造を可視化することが可能であり，蛍光ガイド下手術に応用されている^1,2)．HyperEye Medical System（HEMS）は，カラー画像としてICG蛍光を可視化するシステムで，血管，血流，リンパ管，リンパ流，リンパ節などの情報をカラーイメージングとして認識することができるため臨床医療において幅広く使用されている^2-6)．

ICGは血管及び組織の血流評価をするための蛍光血管造影剤及びセンチネルリンパ節同定薬としての効能・効果が認められており，2018年には術中血管等描出撮影加算として500点（K939-2）が新設されている．肝機能検査及び循環機能検査において，ICG投与に伴う副作用は0.17%で，主な副作用はショック症状0.02%，悪心・嘔気0.08%，血管痛0.04%，発熱・熱感0.02%等が報告されており，その使用に際しては低頻度ではあるがこれらの副作用に配慮して観察を十分に行い，異常が認められた場合には必要に応じ適切な処置を行う必要がある⁷⁾．

3.  ICG蛍光観察システム

現在，Photodynamic eye（PDE，浜松ホトニクス），LIGHTVISION（島津製作所），Medical Imaging Projection System（MIPS，三鷹光器），HyperEye Medical System（HEMS，ミズホ）などのICG蛍光観察システムが使用可能である．いずれの機器も近赤外線を可視光と同時にカラー画像として描出し，リアルタイム動画として近赤外光で励起したICGが発する蛍光の可視化を可能としている．つまり，術野においてターゲットとなる組織と周辺組織との位置関係が視認できるようになることで，ICG蛍光ガイド下手術を可能としている^1,8)．近赤外蛍光部と可視光画像をカラーで同時合成描出できるので，画像からその手術で目的とする部位を特定することが容易となり，解像度も高く微細な組織構造の動態観察が可能となる．

PDEは，ハンディタイプのカメラユニットで目的とする領域を手軽に観察することが可能で，手元のスイッチを操作することにより観察しながら容易に画像調整もできる．LIGHTVISIONは可動性と自由度の高いアームにより目的とする術野にアプローチし易く，高解像度の画像が得られる．MIPSは，プロジェクションマッピングによる直感的なリアルタイムガイドと状況に応じて自在に装置を的確に患部に向ける事ができるアームシステムを使用する事で，より高い精度の手術が可能となっている．HEMSは高知大学とミズホ株式会社との産学共同で開発されたシステムで，LEDライトを装備したCCDカメラ，画像処理を行う制御盤，モニター，そしてそれらを適切な位置に固定できるアームから構成されている^9,10)．

4.  ICG蛍光法を用いた血流評価

ICG蛍光法は乳癌や胃癌，大腸癌等のセンチネルリンパ節の術中同定（センチネルリンパ節生検），臓器切除における血管の術中同定，肝細胞癌・腎癌における部分切除術，冠動脈バイパス手術での血流評価や大動脈瘤手術の臓器血流評価への応用が試みられ，その臨床的有用性が検証されて，急速に普及してきている^1,2-6,11-13)．

食道癌に対する食道切除後，再建臓器としては多くの場合胃管が用いられているが，食道・胃管吻合に際して胃管の血流状態は縫合不全発生率に大きく関わってくる．我々は，食道癌手術において縫合不全の少ない再建を行うために，HEMSを用いて胃管の血流状態を明瞭に可視化し，胃壁内血管網を損傷しない胃管を作成している（Fig.1）．胃の大彎と小彎からの血流の描出程度を評価し，再建部位として至適な領域を確認後，自動縫合器で胃管を作成するようにした症例においては縫合不全を認めていない¹⁴⁾．

Fig.1 

Near-infrared (NIR) fluorescence imaging using indocyanine green (ICG) in esophagectomy for esophageal cancer

Blood flow in the stomach is mobilized as an esophageal substitute cannot be seen under normal white light, but ICG fluorescence visualizes the gastric wall vessels perfused by the right gastroepiploic artery in NIR-ICG under color imaging (arrow).

また腹部緊急手術例においてもHEMSは併用可能であり，上腸間膜動脈瘤破裂症例の緊急手術で血腫を除去しながら動脈瘤を切除し，HEMSを用いて血流評価すると動脈瘤の存在していた部位の遠位腸管には十分な蛍光が見られ腸管温存可能であった¹⁵⁾．また絞扼性腸閉塞に対する手術時にICG蛍光法を用いて腸間膜および腸管の血流評価を行い，腸管切除が必要とされるか否かの判断にも有用である（Fig.2, 3）．このように，HEMSによるICG蛍光法は簡便に施行可能で血流のカラー画像化を可能とし，消化器関連の手術において臓器の切除，温存を判断するために有用であり，他領域の手術においても使用用途の拡大が期待される．

Fig.2 

Near-infrared (NIR) fluorescence imaging using indocyanine green (ICG) in emergency surgery for strangulated bowel obstruction

Blood flow in the small intestine and mesentery is evaluated during surgery using NIR-ICG. Strong fluorescence is visible in the healthy small bowel and mesentery after ICG injection, but it is not observed in the strangulated area, which is resected (arrow).

Fig.3 

Near-infrared (NIR) fluorescence imaging using indocyanine green (ICG) in emergency surgery for strangulated bowel obstruction

Strong fluorescence is visible in the mesentery after ICG injection. Fluorescence is also observed in the strangulated area, which is not resected (arrow).

肝臓手術においては，ICG蛍光法を用いた術中ナビゲーションに関する臨床応用が試みられている．ICG蛍光法は支配グリソン（門脈）を確保し，肝区域の血流をクランプ後にICGを静脈注射することで切除領域と温存領域の境界が描出されるため，切除領域との境界（demarcation line）が明瞭化されることで系統的切除が容易となる．我々の研究でも，系統的肝切除術において，demarcation lineの同定の際に術中ICG蛍光法を併用し，術中ICG蛍光法は肉眼的demarcation lineが不明瞭な症例全てに有用であった．特に先行して肝臓の完全授動ができない右葉系肝切除症例は肉眼的demarcation lineが不明瞭となりやすく，良い適応となる可能性がある（Fig.4）．

Fig.4 

Visualization of the segmental boundaries by near-infrared (NIR) fluorescence imaging using indocyanine green (ICG) in right lobectomy of the liver for hepatocellular carcinoma

Fluorescence imaging after intravenous injection of ICG reveals the boundaries between right anterior left medial segments. ICG fluorescence clarifies the demarcation line for the excision area of the target lesion (arrow).

5.  5-ALAを用いた光線力学診断

5-ALAはミトコンドリア内でスクシニルCoAとグリシンから5-ALA合成酵素によって合成される分子量131の内因性アミノ酸である．5-ALAは細胞質内で代謝され，ミトコンドリア内で光感受性物質であるプロトポルフィリンIX（Protoporphyrin IX: Pp lX）に生合成される^16,17)．その後，正常細胞では細胞内鉄が挿入され，速やかにヘム，ビリルビンへと代謝される．しかし，癌細胞では細胞膜やミトコンドリア膜のトランスポーター活性異常や酵素の異常によりPp IXが癌細胞内に特異的に蓄積する．細胞に375～445 nmの青色可視光線を照射するとPp IXは励起され600～740 nmの赤色蛍光を呈するため，この性質を利用して，病変を観察することができる¹⁾．この光化学反応を応用した診断技術が，PDDである^1,3)．5-ALAを用いたPDD（ALA-PDD）は，光感受性物質が癌特異性に集積することを利用した癌に共通する生物学的特性に基づく技術で，視覚的に腫瘍の局在を明瞭にすることができるため脳腫瘍や膀胱癌の検出や切除範囲の決定などに用いられている^16,18-20)．

6.  胃癌に対する5-ALA-PDD

5-ALA-PDDは脳外科領域では悪性神経膠腫の腫瘍摘出術中における腫瘍組織の可視化として薬事承認され日常臨床で実用化されており，泌尿器科領域では膀胱上皮内癌の診断率の向上と切除の際に残存腫瘍の減少による再発率の低下が期待され先進医療として行われた後に薬事承認されている^16,18-20)．一方，消化器領域においては腹膜播種やリンパ節転移診断の向上に向けて臨床研究の取り組みがなされてきている^21-25)．PDD専用腹腔鏡HOPKINSII Straight Forward Telescopeには青色光を遮断し赤色の蛍光観察が可能となるLong pass filterが装着されており，従来の白色光と蛍光での観察が即時に切り替えができるようになっており，同一病巣の観察を円滑にしている^21,22)．

胃癌の腹膜播種や遠隔転移は非治癒因子とみなされ，薬物治療が中心に行われているが，腹膜播種の診断は従来の画像診断では困難であり，審査腹腔鏡検査が行われるようになってきている．腹膜播種が疑われる進行胃癌に対して5-ALA-PDDを用いた審査腹腔鏡を施行し通常観察では発見できなかったが，PDDで確認することができた（Fig.5A）¹⁵⁾．また漿膜から所属リンパ節に向かって微小な癌浸潤部位も描出可能であった（Fig.5B）．5-ALA投与に伴う光線過敏症，肝機能障害等は認めておらず，5-ALA-PDDを併用することで審査腹腔鏡検査における腹膜播種診断の精度を高められる可能性が示唆されている．

Fig.5 

Laparoscopic examination by photodynamic diagnosis (PDD) using 5-aminolevulinic acid (5-ALA) for gastric cancer

A small PDD-positive peritoneal dissemination lesion emitting red fluorescence is visible by 5-ALA-PDD (A, arrow), but not by conventional normal white light. Red fluorescence is visible in the perigastric area adjacent to the cancer location (B, arrow).

胃癌の内視鏡的診断において，面順次方式でなく同時方式の高画素拡大電子内視鏡と半導体レーザー装置からの青紫色（波長405 nm）照射により赤色蛍光が内視鏡的に観察可能とする報告や^26,27)，レーザー光を活用して自色光観察と同時に狭帯域光観察が可能な内視鏡システムを用いた報告があり，分化度により蛍光性の差異があったことが示されている²⁸⁾．

7.  今後の課題と展望

ICG蛍光観察により蛍光ガイド下手術が可能となったが，ICG血管造影法による血流評価基準は未だ確立されておらず，定量評価を可能にすることがICG蛍光画像診断の今後の課題である．蛍光輝度の時間推移や分布の画像解析ソフトを利用してICG蛍光輝度を数値で定量的に測定する試みも行われており，今後のさらなる開発が期待される．

5-ALAは腫瘍に親和性のある光感受性物質の前駆体であり，今後の薬剤開発とともに技術革新による照射装置の発展により，さらに低侵襲で診断能の高い画像システムの開発が期待される．基礎研究においては，分子レベルでの5-ALAの細胞内への取り込み，排出に関わるトランスポーターや代謝酵素の発現，機能の解析が進むことにより，臨床研究との相補的進捗が望まれる．

利益相反の開示

利益相反なし．

引用文献

• 1)   Namikawa  T,  Iwabu  J,  Munekage  M,  Uemura  S,  Maeda  H,  Kitagawa  H,  Nakayama  T,  Inoue  K,  Sato  T,  Kobayashi  M,  Hanazaki  K. Evolution of photodynamic medicine based on fluorescence image-guided diagnosis using indocyanine green and 5-aminolevulinic acid. Surg Today. 2020; 50: 821-831.
• 2)   Kitai  T,  Inomoto  T,  Miwa  M,  Shikayama  T. Fluorescence navigation with indocyanine green for detecting sentinel lymph nodes in breast cancer. Breast Cancer. 2005; 12: 211-215.
• 3)   Ahmed  M,  Purushotham  AD,  Douek  M. Novel techniques for sentinel lymph node biopsy in breast cancer: A systematic review. Lancet Oncol. 2014; 15: e351-e362.
• 4)   Sugie  T,  Ikeda  T,  Kawaguchi  A,  Shimizu  A,  Toi  M. Sentinel lymph node biopsy using indocyanine green fluorescence in early-stage breast cancer: A meta-analysis. Int J Clin Oncol. 2017; 22: 11-17.
• 5)   Kedrzycki  MS,  Leiloglou  M,  Ashrafian  H,  Jiwa  N,  Thiruchelvam  PTR,  Elson  DS,  Leff  DR. Meta-analysis Comparing fluorescence imaging with radioisotope and blue dye-guided sentinel node identification for breast cancer surgery. Ann Surg Oncol. 2021; 28: 3738-3748.
• 6)   Benson  JR,  van Leeuwen  FWB,  Sugie  T. Editorial: State-of-the-art fluorescence image-guided surgery: Current and future developments. Front Oncol. 2021; 11: 776832.
• 7)   Chen  QY,  Xie  JW,  Zhong  Q,  Wang  JB,  Lin  JX,  Lu  J,  Cao  LL,  Lin  M,  Tu  RH,  Huang  ZN,  Lin  JL,  Zheng  HL,  Li  P,  Zheng  CH,  Huang  CM. Safety and efficacy of indocyanine green tracer-guided lymph node dissection during laparoscopic radical gastrectomy in patients with gastric cancer: A randomized clinical trial. JAMA Surg. 2020; 155: 300-311.
• 8)   Namikawa  T,  Sato  T,  Hanazaki  K. Recent advances in near-infrared fluorescence-guided imaging surgery using indocyanine green. Surg Today. 2015; 45: 1467-1474.
• 9)   Handa  T,  Katare  RG,  Nishimori  H,  Wariishi  S,  Fukutomi  T,  Yamamoto  M,  Sasaguri  S,  Sato  T. New device for intraoperative graft assessment: HyperEye charge-coupled device camera system. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 2010; 58: 68-77.
• 10)   Handa  T,  Katare  RG,  Sasaguri  S,  Sato  T. Preliminary experience for the evaluation of the intraoperative graft patency with real color charge-coupled device camera system: An advanced device for simultaneous capturing of color and near-infrared images during coronary artery bypass graft. Interact Cardiovasc Thorac Surg. 2009; 9: 150-154.
• 11)   Yamamoto  M,  Orihashi  K,  Nishimori  H,  Handa  T,  Kondo  N,  Fukutomi  T,  Sato  T. Efficacy of intraoperative HyperEye Medical System angiography for coronary artery bypass grafting. Surg Today. 2015; 45: 966-972.
• 12)   Yamamoto  M,  Sasaguri  S,  Sato  T. Assessing intraoperative blood flow in cardiovascular surgery. Surg Today. 2011; 41: 1467-1474.
• 13)   Yamamoto  M,  Orihashi  K,  Nishimori  H,  Wariishi  S,  Fukutomi  T,  Kondo  N,  Kihara  K,  Sato  T,  Sasaguri  S. Indocyanine green angiography for intra-operative assessment in vascular surgery. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2012; 43: 426-432.
• 14)   Kitagawa  H,  Namikawa  T,  Munekage  M,  Akimori  T,  Kobayashi  M,  Hanazaki  K. Visualization of the stomach’s arterial networks during esophageal surgery using the HyperEye Medical System. Anticancer Res. 2015; 35: 6201-6205.
• 15)   Namikawa  T,  Uemura  S,  Kondo  N,  Yamamoto  M,  Maeda  H,  Nishimori  H,  Sato  T,  Orihashi  K,  Kobayashi  M,  Hanazaki  K. Successful preservation of the mesenteric and bowel circulation with treatment for a ruptured superior mesenteric artery aneurysm using the HyperEye Medical System. Am Surg. 2014; 80: E359-361.
• 16)   Inoue  K,  Fukuhara  H,  Shimamoto  T,  Kamada  M,  Iiyama  T,  Miyamura  M,  Kurabayashi  A,  Furihata  M,  Tanimura  M,  Watanabe  H,  Shuin  T. Comparison between intravesical and oral administration of 5-aminolevulinic acid in the clinical benefit of photodynamic diagnosis for nonmuscle invasive bladder cancer. Cancer. 2012; 118: 1062-1074.
• 17)   Hagiya  Y,  Endo  Y,  Yonemura  Y,  Takahashi  K,  Ishizuka  M,  Abe  F,  Tanaka  T,  Okura  I,  Nakajima  M,  Ishikawa  T,  Ogura  S. Pivotal roles of peptide transporter PEPT1 and ATP-binding cassette (ABC) transporter ABCG2 in 5-aminolevulinic acid (ALA)-based photocytotoxicity of gastric cancer cells in vitro. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2012; 9: 204-214.
• 18)   Inoue  K,  Karashima  T,  Kamada  M,  Shuin  T,  Kurabayashi  A,  Furihata  M,  Fujita  H,  Utsumi  K,  Sasaki  J. Regulation of 5-aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX accumulation in human urothelial carcinomas. Pathobiology. 2009; 76: 303-314.
• 19)   Fukuhara  H,  Inoue  K,  Satake  H,  Tamura  K,  Karashima  T,  Yamasaki  I,  Tatsuo  I,  Kurabayashi  A,  Furihata  M,  Shuin  T. Photodynamic diagnosis of positive margin during radical prostatectomy: Preliminary experience with 5-aminolevulinic acid. Int J Urol. 2011; 18: 585-591.
• 20)   Inoue  K,  Fukuhara  H,  Kurabayashi  A,  Furihata  M,  Tsuda  M,  Nagakawa  K,  Fujita  H,  Utsumi  K,  Shuin  T. Photodynamic therapy involves an antiangiogenic mechanism and is enhanced by ferrochelatase inhibitor in urothelial carcinoma. Cancer Sci. 2013; 104: 765-772.
• 21)   Namikawa  T,  Yatabe  T,  Inoue  K,  Shuin  T,  Hanazaki  K. Clinical applications of 5-aminolevulinic acid-mediated fluorescence for gastric cancer. World J Gastroenterol. 2015; 21: 8769-8775.
• 22)   Namikawa  T,  Inoue  K,  Uemura  S,  Shiga  M,  Maeda  H,  Kitagawa  H,  Fukuhara  H,  Kobayashi  M,  Shuin  T,  Hanazaki  K. Photodynamic diagnosis using 5-aminolevulinic acid during gastrectomy for gastric cancer. J Surg Oncol. 2014; 109: 213-217.
• 23)   Kishi  K,  Fujiwara  Y,  Yano  M,  Inoue  M,  Miyashiro  I,  Motoori  M,  Shingai  T,  Gotoh  K,  Takahashi  H,  Noura  S,  Yamada  T,  Ohue  M,  Ohigashi  H,  Ishikawa  O. Staging laparoscopy using ALA-mediated photodynamic diagnosis improves the detection of peritoneal metastases in advanced gastric cancer. J Surg Oncol. 2012; 106: 294-298.
• 24)   Murayama  Y,  Ichikawa  D,  Koizumi  N,  Komatsu  S,  Shiozaki  A,  Kuriu  Y,  Ikoma  H,  Kubota  T,  Nakanishi  M,  Harada  Y,  Fujiwara  H,  Okamoto  K,  Ochiai  T,  Kokuba  Y,  Takamatsu  T,  Otsuji  E. Staging fluorescence laparoscopy for gastric cancer by using 5-aminolevulinic acid. Anticancer Res. 2012; 32: 5421-5427.
• 25)   Kishi  K,  Fujiwara  Y,  Yano  M,  Motoori  M,  Sugimura  K,  Ohue  M,  Noura  S,  Marubashi  S,  Takahashi  H,  Sakon  M. Diagnostic laparoscopy with 5-aminolevulinic-Acid-mediated photodynamic diagnosis enhances the detection of peritoneal micrometastases in advanced gastric cancer. Oncology. 2014; 87: 257-265.
• 26)   Sakaguchi  T,  Kinoshita  H,  Ikebuchi  Y,  Kanda  T,  Yamashita  T,  Kurumi  H,  Fujii  M,  Edano  M,  Hasegawa  T,  Onoyama  T,  Yoshida  A,  Kawaguchi  K,  Yashima  K,  Isomoto  H. Next-generation laser-based photodynamic endoscopic diagnosis using 5-aminolevulinic acid for early gastric adenocarcinoma and gastric adenoma. Ann Gastroenterol. 2020; 33: 257-264.
• 27)   Nakamura  T,  Oinuma  T,  Yamagishi  H,  Masuyama  H,  Terano  A. Evaluation of a novel high-resolution magnifying videoendoscope that is capable of photodynamic diagnosis and therapy for gastric cancer. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2015; 12: 115-122.
• 28)   Isomoto  H,  Nanashima  A,  Senoo  T,  Ogiwara  K,  Hashisako  M,  Ohnita  K,  Yamaguchi  N,  Kunizaki  M,  Hidaka  S,  Fukuda  H,  Ishii  H,  Matsushima  K,  Minami  H,  Akazawa  Y,  Takeshima  F,  Fukuoka  J,  Nagayasu  T,  Nakao  K. In vivo fluorescence navigation of gastric and upper gastrointestinal tumors by 5-aminolevulinic acid mediated photodynamic diagnosis with a laser-equipped video image endoscope. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2015; 12: 201-208.