抄録
第 47、48 回の本学会総会において、loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 法を用いた深在性真菌症の検出系の開発について報告した。LAMP 法は、迅速かつ高感度・高特異度が期待される新規遺伝子増幅法の 1 つである。今回は既に報告した各種プライマーセットのうち、A. fumigatus 特異的プライマーの配列を一部改変したうえで、さらに解析を進め、高感度、高特異度を有する検出系となったことを確認したので報告する。
Large subunit rRNA 遺伝子 D1/D2 領域内を標的遺伝子とし、プライマーの各領域の Tm のバランスを調節、配列上特異性が存在する部位をプライマーの 3’側に位置するなどの再設計を行い、高感度・高特異度の系の構築を意図した。また深在性真菌症起因菌として主に問題視されている 13 菌種由来の D1/D2 領域、約 600 bp を PCR にて増幅しプラスミドに組み込むことで、定量的な鋳型を確保した。これら材料を用いて、標的遺伝子 100 コピーを検出するとともに、108 コピーの他菌種遺伝子識別が可能であることを確認した。さらに界面活性剤や有機溶媒による調製 (Makimura et.al, J Med Microbiol. 1994) した 49 菌種 99 株由来ゲノムに対する特異性検討の結果から、本検出法がほぼ A. fumigatus 特異的であることが示された。
