組織培養研究
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総説
「多能性幹細胞培養の留意点」の提案
Good Cell Culture Practice検討のためのワーキンググループ青井 貴之浅香 勲阿久津 英憲伊藤 弓弦片岡 健諫田 泰成小島 肇関野 祐子末盛 博文中川 誠人中村 和昭中村 幸夫藤井 万紀子古江-楠田 美保山崎 大樹
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2019 年 38 巻 3 号 p. 135-143

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要旨

近年、ヒト胚性幹(ES)細胞やヒト人工多能性幹(iPS)細胞等のヒト多能性幹細胞は、基礎研究のみならず、創薬研究、再生医療への応用など、広い分野でその利用が期待されている。それに伴い、培養資材の供給など研究環境が整備され、ヒト多能性幹細胞の培養が容易に実施可能な状況となり、利用者が増加している。一方で研究者・作業者間において、技術とその背景となる基本概念の共有と、研究結果の再現性の担保が課題である。ヒト多能性幹細胞は従来利用されてきた体性細胞とは異なる点が多く、培養経験者であっても留意すべき点が多い。そこで、ヒト多能性幹細胞が有効に活用されることを期待し、「多能性幹細胞培養の留意点」案を作成した。本留意点案は、ヒト多能性幹細胞の使用開始にあたり確認すべき内容を、7項目(法令・指針と同意・MTA、多能性幹細胞の多様性、培養資材、解凍作業、培地交換と継代作業、凍結操作、培養管理)にまとめた。この留意点の概念が多能性幹細胞の細胞培養を行う研究者・作業者により共有され、日本の細胞培養技術が上進し、多能性幹細胞を用いた研究の利用と信頼性が向上することを期待する。

序文

近年、細胞培養に関連する技術の急速な開発に伴い、基礎研究のみならず、創薬研究、再生医療への応用など、細胞培養が貢献する分野が拡大している。中でも、ヒト胚性幹(ES)細胞1やヒト人工多能性幹(iPS)細胞2等のヒト多能性幹細胞(以下、多能性幹細胞)は、広い分野において利用が期待されている。それに伴い、基材・培養液・細胞の供給体制が充実して研究環境が整備され、容易にヒト多能性幹細胞の培養が実施可能となってきた。一方、多能性幹細胞の培養は不安定であり、その未分化性維持には、熟練した技術を要する。また、分化能の変化、分化効率の不安定性などにより、再現性の担保が難しい。安定した結果を得るためには、まず、研究者・作業者間において、未分化性の維持に必要な技術と、その技術の背景となる知識と概念の共有が必要である。多能性幹細胞の培養は、従来利用されてきた体細胞とは異なる点が多く、熟練した培養経験者であっても、改めてその使用の制限、培養の管理や作業について留意すべき点が多い。そこで、多能性幹細胞が有効に活用されることを期待し、同細胞を取り扱う研究者・作業者を対象とし、培養するにあたっての留意すべき項目をまとめた。

なお、多能性幹細胞に係る研究は、その利用への期待から飛躍的に発展しており、常に最新の情報を入手し、更新に務めるべきであり、当該留意点として記載されている内容が今後最新でなくなる場合も起こり得ることを理解されたい。

「多能性幹細胞培養の留意点」

はじめに

多能性幹細胞は基礎研究だけでなく、再生医療や創薬研究などの分野においても広く利用が期待されている。しかし、多能性幹細胞は、未分化性や分化多能性が制御しにくく、研究者・作業者間での多能性幹細胞培養における基盤的な技術と、その背景となる基本概念の共有が望まれる。多能性幹細胞の利用は基礎から臨床にわたり、目的に応じた品質管理が必要であるが、共通する基盤技術や管理も多い。本稿では、多能性幹細胞を培養するすべての実験・研究に共通する基本的な留意点をまとめ、提言する。これまでに筆者らは、「細胞培養における基本原則」3および「培養細胞の観察の基本原則」4を報告している。これら基本原則は、多能性幹細胞を扱う上でも基本的な考え方として遵守されることが望まれる。なお、本留意点は多能性幹細胞を利用する研究者・作業者を対象に多能性幹細胞を適切に維持培養するための留意点について述べるものであり、多能性幹細胞の樹立あるいは分化誘導に関しては、技術的に日進月歩しており、別途最新の情報文献等を入手し参照されたい。

目的

多能性幹細胞を用いた基礎研究あるいは臨床応用を目指した研究結果の再現性および信頼性を向上させるために、多能性幹細胞の維持培養に関する基本的な留意点を以下に示す。その内容は、多能性幹細胞培養のすべての研究者・作業者に遵守されるべき重要かつ共通の留意点である。基礎研究にとどまらず、適切な臨床研究を進めるためには、適切な前臨床試験が必須であり、関連する法令・指針等を遵守することはもちろんのこと、その前提として多能性幹細胞培養を行う実験において本留意点の遵守が求められる。また、多能性幹細胞培養に関する教育・指導を行う際には、指導者が本基本原則を踏まえた教育・指導を行うことが重要である。

留意点

1.使用開始にあたって確認すべき法令・指針と同意・MTA(Material Transfer Agreement)について

ES細胞やiPS細胞等の多能性幹細胞を使用するに当たっては、その知的財産権、使用条件、関係法令・指針を確認し、これらにより定められる使用範囲を遵守しなければならない5,6,7

(1)法令・指針で定められた範囲内で使用しなくてはならない。

例として、多能性幹細胞は、生殖細胞分化等によりヒト胚を作製できる可能性を秘めているが、本邦ではこれらのヒト胚の子宮へ移植は禁止されており、生殖細胞への分化や胚の作製についても、法令・指針により厳密に規制されているi。培養を実施する際には法令・指針等に基づき研究計画を作成し、当該研究計画に沿って研究を行う必要がある。しかし、法令・指針等は改定等がありうるため、常に最新の情報を入手する体制を整えておくことが重要である。

(2)MTAや同意書で定められた範囲内で使用しなくてはならない。

多能性幹細胞には多くの場合、知的財産権等が設定されており、細胞を入手する際はMTA等が取り交わされる。入手した多能性幹細胞株を使用する際は、MTA等を確認する必要がある。細胞の使用は細胞提供者やドナー等から書面にて同意を受けた範囲内で実施しなくてはならないii

2.多能性幹細胞の多様性について

細胞株によって自己複製能(未分化性の維持)や分化能に差があり、その性質は多様である8,9,10。従って、使用する細胞株毎の特性を把握して取り扱う必要がある。多能性幹細胞は同一ドナーに由来するクローン間でもその性質が異なる場合があり、クローンの混同についても注意を払う必要ある11,12,13,14

(1)入手の際に得られる細胞情報から増殖特性や分化能を把握する。

公的な細胞バンクからES細胞やiPS細胞を入手する場合には、添付される細胞情報シートにより使用する培地等の培養条件を確認するiiiとともに、増殖特性や分化能を把握する。研究者間で細胞を分配・譲渡する場合にはiv、提供側より細胞の情報を十分に得ておく。

(2)取扱い機関内にて増殖性や分化能を確認しておく。

培養手技や使用する試薬のロットの違いにより増殖性や分化能等の細胞の性質に違いが認められることがあるv。入手時の細胞情報シートを参照にしつつ、取扱い機関における増殖性や分化能を確認しておく。

(3)取り扱う細胞株毎の評価基準を定めておく。

細胞株ごとに、増殖速度や分化指向性など細胞の性質が異なることが報告されている15,16,17。それぞれの細胞株ごとに、品質管理における評価基準を定め、常に一定の品質を保つようにするvi,5,7,18,19,20

3.培養資材について

培養容器や培地等の資材で多能性幹細胞に直接接触するものは、その性質に与える影響が大きいので、プロトコルで指定された資材を使用することはもちろんのこと、メーカー差、ロット差等も考慮して選択、使用する必要がある。培地、培養条件の違いによって同じ細胞株であっても細胞特性(細胞増殖速度や分化効率など)が大きく変わることについて留意する必要がある21,22,23

(1)継続的に使用する培養容器は、予めチェックする。

培養容器は、メーカーにより、形状やサイズだけでなく、樹脂組成、培養表面処理、通気性等の条件に差があり、多能性幹細胞の接着や増殖に差が生じることがある。

(2)培地・試薬・コーティング材(細胞外マトリックス等)の取扱に注意する。

培地は多能性幹細胞を培養する上で最も重要な培養資材であるvii。培地、添加物のロット差や有効期限、調製後または開封後のpH等の経時変化は、培地の性能に影響を及ぼすため、十分注意して管理、使用するviii。保存方法や保存期間によっても力価が変化するため、指定された保存方法を遵守する。また、培養面のコーティングを行う場合は、用いるコーティング材の種類だけでなく、その濃度、処理温度、処理時間、コート後の使用期限に注意をはらう必要がある。これら条件の変動により、細胞接着性が変化し、多能性幹細胞の性質に影響を及ぼす可能性があるix

(3)フィーダー細胞を不用意に変更しない。

フィーダー細胞を用いる場合、フィーダー細胞の起源や調製法および不活化法によって、多能性幹細胞の増殖や未分化性の維持に影響を与える因子の組成が変わるため、不用意に変更しない。また培養容器への播種密度や、播種後の時間経過も影響を与えるため注意する。

4.解凍作業について

凍結保存液の組成によって適切な解凍法が異なるため、指定された解凍作業の作業方法を遵守するとともに、作業時間にも注意をはらう。解凍後、凍結保存試薬に接触している温度や時間が生存率に影響を与えるため、十分な注意が必要である。多能性幹細胞の解凍後の生存率は一般の培養細胞株よりも低いことが多く、また細胞接着効率やコロニー形成率は生存率よりもさらに低くなることが多いため、指定された播種細胞密度より少なくならないようにする。

5.培地交換と継代作業について

多能性幹細胞が未分化状態を適切に維持するためには、培養環境の適切な管理が必要である。些細な条件変化でも何らかの分化細胞に変化し易いことを理解する。

(1)培地交換するタイミングに注意する。

多能性幹細胞は培地中の増殖因子の劣化、栄養成分の消費とそれに伴う老廃物の蓄積などの影響を受けやすいx。またこれらの変化は細胞数に応じて進行速度が変わるため、培地交換の頻度や培地量は細胞数の増加に応じて対応が必要である。また、細胞増殖や未分化状態の維持にはオートクライン因子やパラクライン因子が影響を与えている可能性があり、細胞数によってもその影響は異なるため、培養初期と後期のそれぞれにおいてその影響を考慮することが必要である。

(2)継代するタイミングに注意する。

継代スケジュールは、培地交換のタイミングや、細胞の増殖状況によって計画する。多能性幹細胞はコロニーを形成して増殖するが、コロニーサイズが大きくなるにつれてコロニー同士やコロニーの中心部と周縁部で差が生じてくる24。できるだけコロニーの大きさが同等の期間内で継代し、均質性を維持することが望ましい。

(3)細胞分散処理、ピペッティングの作業に注意する。

細胞株によって細胞分散試薬や機械的ストレスに対する耐性に差があることがあり、継代操作によって細胞集団の性質が変化する可能性がある。そのため、長時間の分散処理や過剰なピペッティングはできるだけ避けることが望ましい25

6.凍結操作について

多能性幹細胞の樹立時の性質をそのまま維持できるよう注意して細胞凍結する必要がある。

(1)できるだけ早い段階で凍結ストックを作製する。

多能性幹細胞は凍結耐性が低い場合が多い。凍結解凍を繰り返すことで凍結耐性が比較的高い細胞群が選抜されてしまう可能性があるため、入手直後の凍結ストックはできるだけ多めに作製することが望ましい。

(2)適確な凍結作業に務める。

凍結保存液の組成によって適切な凍結法が異なるため、指定された凍結作業の作業方法を遵守するとともに、作業時間にも注意をはらう。凍結保存試薬に接触している温度や時間が、解凍時の生存率に影響を与えるため、一定の生存率が確保できる作業量を予めチェックしておくことが必要である。また、多能性幹細胞の凍結保存耐性は細胞株によっても異なるため、新規に樹立した細胞株を凍結保存する場合には、予備検討を行い使用する25

7.培養管理について

多能性幹細胞は、形質が変化しやすいことを理解して、取り扱う必要がある。

(1)細胞分裂回数を把握できるよう管理する。

多能性幹細胞は無限に近い細胞分裂能を有しているが、細胞分裂を繰り返すと、細胞選抜や順応による形質の変化を生じ、さらには変異体の発生のリスクが高くなるため、長期間の継代維持は避けることが望ましい。そのため、可能であれば、細胞集団倍加数(PDL: population doubling level)を把握できるような管理をすることが望ましい。PDLの把握が難しい場合は、細胞が分裂した回数や細胞倍加時間が推測できるよう継代数と継代時のスプリットの割合、ならびに培養日数を記録する。

(2)定期的に幹細胞特性検査を実施する。

バンクより入手後、10継代以上にわたって長期に継続的に使用する場合には、細胞形態、増殖能、未分化・分化マーカー発現プロフィール、核型異常等を定期的に確認し、入手した際の基本的な特性を維持していることを確認する。多能性を確認する絶対的マーカーは現在まで発見されていないため、複数のマーカーの発現を確認する必要がある。

なお、細胞バンクから入手後6ヶ月以上経過した場合には、細胞同定試験、マイコプラズマ検査による確定が必要となるので注意するxi

原則として、培養プロトコルを変更しないことが前提であるが、実験の都合上、培地や継代方法を変更した場合には、上記の検査を行い、幹細胞の特性が変化していないことを確認する必要がある。

(3)従来とは異なる細胞増殖や細胞形態が観察される場合は、それ以上使用しない。

多能性幹細胞を継続的に培養維持している際、継代後の初期に多くの分化した細胞のコロニーが観察される場合、コロニー中に多くの分化細胞が観察される場合、増殖速度が急激に早くなった場合には、培養/継代条件が適切でない、また、異常が発生したと考えられる。このような場合には、形質が変化している状態であることが考えられ、それ以上使用せず、入手後に作製した凍結ストックを解凍して使用することが望ましい。しかし、どうしても必要な場合には、未分化なコロニーのみ回収することにより、培養を継続する。

おわりに

著者らは、以上7項目を「多能性幹細胞培養の留意点」として提案する。多能性幹細胞を培養するにあたっては、培養経緯などによって細胞の形質が容易に変化してしまうことを考慮し、細胞の状態を常に正確に判断することが重要である。分化能の低下や分化細胞の出現は、多能性幹細胞を用いた研究の結果を大きく左右してしまう。未分化性維持および分化多能性を適切に維持するためには、上記の留意点をもとに、細心の注意を払って培養操作を行うことが求められる。

これまでに、日本組織培養学会と日本動物実験代替法学会が連携するとともに、学会外の専門家を迎えてワーキンググループを設置し、「細胞培養における基本原則」3および「培養細胞の観察の基本原則」4を作成し、会員に提案した。これらは、関係学会・団体等に情報提供し、各学会のホームページに掲載していただいたとともに、国立研究開発法人日本医療研究開発機構(AMED)のホームページにも掲載した。今回は、「多能性幹細胞培養の留意点」としてまとめ、AMED、厚生労働省、経済産業省、文部科学省の関連部署に情報提供・意見交換を行い、会員に提案するに至った。今後、細胞培養を研究手法として実験を行っている多くの研究者・作業者が在籍している他の学会への情報提供とともに、共通認識の構築も検討していきたい。細胞培養を行うすべての研究者・作業者により、上記原則と合わせて本留意点の意図が理解されるとともに、かかる技術が上進し、細胞培養を用いた研究がさらに発展をすることを期待する。

謝辞

本研究は、日本医療研究開発機構(AMED)の課題番号17bk0104011h0005の支援を受けました。また、本留意点の案作成を行った「Good Cell Culture Practice検討のためのワーキンググループ」には、AMED、厚生労働省、経済産業省、文部科学省の各担当課からオブザーバーとしてのご参画・ご助言を頂きました。深謝いたします。

i 文部科学省 ライフサイエンスの広場に、ヒトES細胞やヒトiPS細胞を用いた研究の実施に必要な関係法令・指針が掲載されているので、研究開始前にその内容をよく理解し、必要な手続を経て実施する必要がある。http://www.lifescience.mext.go.jp/bioethics/hito_es.html

ii 細胞によって、ゲノム解析等その使用に制限がある場合もあるので、必ず確認が必要である。

iii 入手した細胞を解凍・培養する際には、まず、情報シートに記載されている通りの条件で解凍、培養をすること。同じ品名の製品であっても、メーカーによって特性が異なることも珍しくないため、メーカーやカタログ番号なども詳細に確認する。実験の都合上、培養条件の変更が必要であっても、まず、指定の通りの条件で拡大培養し、細胞の保存を行ってから、変更する。情報シートに増殖特性や分化能の記載がない場合もある。その場合は、実験者自身が使用開始時に増殖特性や分化能を確認する必要がある。

iv ヒトES細胞は、「ヒトES細胞の使用に関する指針」に基づき使用すること。指針は適宜改正が行なわれているので、使用中であっても常に情報収集に努める。

v 多能性幹細胞は、様々な影響を受けて、増殖性や分化能が変化する。不可逆的な変化が生じてしまう場合もあるため、常に注意が必要である。そのため、入手時の情報、研究室内での増殖状況を把握しておく。

vi 研究室内で研究等に使用を開始する前に、細胞株の特性を確認しておく。

vii 従来は基本培地にアミノ酸とともに血清代替物等や増殖因子等を作業者が調達して調整する場合が多かった。近年は種々な無血清培地が開発され、メーカーであらかじめすべての添加物を含めて提供されている。

viii 論文に記載されている使用濃度は参考値であり、使用する細胞、試薬の製造メーカー、ロットにより適正濃度が異なることが多いため、使用する条件での適正濃度を確認する必要がある。同名の試薬でも天然抽出物と組換え体では、力価が異なるため注意を要する。特に天然物抽出酵素は、メーカーや製品によって、起源や精製法が異なるため力価に差が出るほか、ロット差により性能も変化するため予備検討されたものを使用する。

ix 同名の細胞接着因子であっても起源が異なったり、組換え体の場合には発現系が異なったりするほか、同一品種であってもロット差が影響を与えることがあるので注意が必要である。

x 培養液は、ボトルごと温めると、培地の劣化につながる。必要量を計算して、チューブなどに分取して温める。

xi 近年、論文投稿時に、使用した培養細胞の細胞認証、マイコプラズマ否定試験結果が必要なジャーナルが増えている。バンクから入手後6ヶ月以内であれば不要とされるが、6ヶ月以上経過した場合には、細胞同定試験、マイコプラズマ検査が必要となる。

参考文献
 
© 2019 日本組織培養学会
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