ORIGINAL ARTICLE
Establishment and biological characterization of cell line (FU-Meso-1) with malignant pleural mesothelioma
2025 Volume 43 Issue 1 Pages 1-11
Details
2025 Volume 43 Issue 1 Pages 1-11
中皮腫は稀な悪性の腫瘍であり、このような稀な腫瘍の細胞株は新鮮検体の代わりとして細胞遺伝学的、分子生物学的検索を含む様々な検査を行うために有用な材料となる。胸膜の中皮腫（Malignant pleural mesothelioma; MPM）の診断には反応性の中皮との鑑別が必須であり、免疫組織化学染色によるBAP1 蛋白の消失やFISH法によるCDKN2Aのホモ接合性の欠失の検出が有用とされる。今回私たちは病理組織学的に二相型MPMと診断された胸部腫瘍から細胞株FU-Meso-1 を樹立し、病理組織学的検索に加え、異種移植能、CDKN2Aの細胞遺伝学的、分子生物学的検索を行った。細胞株FU-Meso-1 は異種移植能を有しており、組織像は患者由来の中皮腫（患者由来腫瘍）のみ上皮様成分が認められたが、患者由来腫瘍、FU-Meso-1 細胞株のSCIDマウス移植腫瘍（マウス移植腫瘍）、FU-Meso-1 細胞株とも共通した免疫組織学的性質（癌腫陽性マーカー陰性、中皮陽性マーカー陽性）を呈した。中皮との鑑別に必須とされるFISH法によるCDKN2Aの消失の検索結果はすべての材料でヘテロ接合性の消失を示したが、real time RT-PCR法ではCDKN2Aの発現が検出されなかった。そこでCDKN2Aのプロモーター部位のメチル化をメチル化特異的PCR法で検出した結果メチル化が検出され、結果としてFU-Meso-1 はCDKN2Aを発現しておらずCDKN2Aはホモ接合性の欠失状態であると思われた。今回樹立した細胞株FU-Meso-1 は患者由来腫瘍とほぼ同じ特性を持つことから、MPMの研究だけでなく分子標的薬や免疫療法薬などの新しい治療法の開発やその生物学的挙動を調査するのに役立と思われる。またCDKN2Aの接合性の検出にはFISH法だけでなくreal time RT-PCR法との併用が必要であろう。
Malignant mesotheliomas are rare malignant tumors, and cell lines from these rare tumors can be used as a substitute for fresh specimens for various tests, including cytogenetic and molecular biological studies. For the diagnosis of malignant pleural mesothelioma (MPM), the disappearance of BAP1 protein by immunohistochemical staining and homozygous deletion of CDKN2A by FISH help differentiate malignant mesothelial tumors from benign mesothelial proliferations. We established the cell line FU-Meso-1 from a thoracic tumor diagnosed histopathologically as biphasic MPM, and performed histopathological examinations, xenograft ability, and cytogenetic and molecular biological investigation of CDKN2A. Histological findings showed no epithelial-like components except in patient-derived tumor. Still, the patient-derived tumor, transplanted tumor, and FU-Meso-1 cell line all exhibited common immunohistological properties (carcinoma-positive markers negative, mesothelioma-positive markers positive), and the FU-Meso-1 cell line had xenograft ability. All materials showed CDKN2A heterozygous deletion by FISH, but RT-qPCR detected no CDKN2A expression. We subsequently detected methylation of the CDKN2A promoter region by methylation-specific PCR, resulting in FU-Meso-1 not expressing CDKN2A, and CDKN2A appeared to be a homozygous deleted.
As the FU-Meso-1 has characteristics similar to those of the patient-derived tumor, the FU-Meso-1 cell line will be useful for future extensive analyses of the biological behavior of MPM and the development of novel therapeutic strategies such as molecular targeted drugs and immunotherapy. A combination of FISH and RT-qPCR should be required to detect homozygous deletions of CDKN2A.
中皮腫は全悪性腫瘍の0.2－0.3％を占める稀な腫瘍である。60歳以上に好発し、発症の男女比は4：1である。発生部位は胸膜が最も多く、次いで腹膜、まれに心膜や精巣鞘膜にも生じ1,2,3）、このうち胸膜に生じる中皮腫（Malignant pleural mesothelioma; MPM）の約70％は石綿ばく露が発症に関与し、潜伏期間は25－70年とされる4）。中皮腫の組織像は多彩であり、上皮型、肉腫型そして上皮型と肉腫型の両方の成分からなる二相型に分類され、上皮型では癌腫と、肉腫型では肉腫との鑑別が問題となる。そこでMPMの病理組織診断では、免疫組織化学的に少なくとも2種の中皮のマーカーが陽性を呈し、2種の癌腫マーカーが陰性を呈することを確認することが推奨されている5）。
中皮腫には特異的な染色体や遺伝子の変異は認められていないが、3p21、4q、6q、9p、22qの欠失や、BAP1（BRCA1-associated protein）、CDKN2A（Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A）、NF2（Neurofibromin2）などのがん抑制遺伝子に欠失や変異といった異常が報告されており、なかでもCDKN2Aは中皮腫でホモ接合性の欠失を認めることが多いとされる6,7）。とくにMPMでは反応性の中皮細胞が高度の異型性を示すことがあるのでWHO分類、胸部の腫瘍、第5版では、免疫組織化学染色（免疫染色）によるBAP1 蛋白の消失、MTAP（Methylthioadenosine phosphorylase）蛋白の消失に加え、FISH（Fluorescence in situ hybridization）法によるCDKN2Aのホモ接合性の欠失の有無の検討が中皮腫と反応性中皮細胞との鑑別に有用であると記載されている8）。
今回私たちは過去に染色体分析を行ったMPMの症例9）から細胞株（FU-Meso-1）を樹立し、病理組織学的検索に加え、細胞株の異種移植能、CDKN2Aの細胞遺伝学的、分子遺伝学的検索を行い若干の知見が得られたので報告する。
68才男性、高血圧の治療中に胸部レントゲン右胸腔内に腫瘍を認めたため胸部腫瘍と右肺の部分切除が施行された。アスベストへの曝露は不明である。手術材料は病理診断および研究のために10％ホルマリン固定と染色体分析用に分けられ福岡大学病院へ提出された。この検体は患者の書面による同意を得て提出され検査された。
患者由来の中皮腫（患者由来腫瘍）は剪刀で細切し、コラゲナーゼ処理（Wothington Biochemical Co. NJ, USA）を行った後20％FBS（FBS; HyclonTM, Cytiva, Tokyo, Japan）を含む培養液（D-MEM/Ham’s F12; FIJIFILM Wako, Osaka, Japna）に懸濁し、フラスコ（COENING R Falcon R PEIMARIA Tissue Culture Flasks, NY, USA）に入れて5％CO2、36.5°Cで培養を開始した。培養液は1週間に2回交換を行い、約2週間後、0.25％トリプシン-EDTA液（NACALAI TESQE, INC., Kyoto, Japan）を用いて細胞を1：2に継代した。その後細胞がフラスコを覆いつくすまで増える毎に継代を行い、継代数が10代を超えると培地のFBS濃度を10％に減らし、安定して培養が継続可能な40代を超えたため細胞株とし、FU-Meso-1 と名付けた。
2． 細胞倍加時間細胞の倍加時間を測定するため、74代目の細胞を24 well培養プレート（24-well Cell Culture Multiwell Plate, TC, CELLSTAR®, Greiner Bio-One, Tokyo, Japan）に 6.8×103 個/cm2 の濃度で播種し、毎日 2 wellずつカウントし増殖がプラトーになるまで培養した。倍加時間は増殖曲線の指数増殖期から求めた。
3． 異種移植能継代70代目の細胞 1×107 個をSCIDマウス（SCID; Sevefe Combined Immuno Deficiency, Icr/SCID Nihon Clear, Tokyo）の左背部皮下に注入し、1週間後、同じ部位に 1×107 個の細胞を追加注入した。初代培養と培養維持およびSCIDマウスの維持管理は、福岡大学実験動物センターにおいて病原体を含まない特定の条件下で行われた。
4． 病理組織学的検索提出された患者由来腫瘍とFU-Meso-1 細胞株のSCIDマウス移植腫瘍組織（マウス移植腫瘍）はホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE: Formalin fixed paraffin embedded）切片と継代73代目の培養細胞を用いた。培養細胞はSlide & Chamber, 2 well（WATOSON BIOLAB, Tokyo, Japan）に培養し冷アセトンで固定したスライドを用いた。免疫染色に用いた1次抗体の希釈濃度とメーカーは表1に示した。FFPE切片は脱パラフィン後、表1に示す緩衝液中で96°C 30分間のマイクロウェーブ処理により抗原の賦活化を行った。1次抗体はニチレイヒストファインシンプルステインMAX PO（MULTI; Nichei Biosciences Inc., Tokyo, Japan）を用いてDAB（diaminobenzidine）によって可視化を行った。
| 抗体名 | メーカー | 希釈 | M.W. 前処理 | 結果 | 評価* | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 患者由来 腫瘍 | マウス 移植腫瘍 | FU-Meso-1 細胞株 | 陽性 | 陰性 | ||||
| CEA | ニチレイ | 希釈済み | なし | - | - | - | 癌腫 | 上皮型中皮腫 |
| EMA | Dako | 希釈済み | なし | - | - | - | 癌腫、上皮型中皮腫 | 反応性中皮 |
| Ep-CAM（MOC31） | Dako | 1：60 | C | - | - | - | 癌腫（肺腺癌） | 中皮腫 |
| NapsinA | Dako | 1：100 | TE | - | - | - | 癌腫（肺腺癌） | 中皮腫 |
| TTF1 | Dako | 1：50 | TE | - | - | - | 癌腫（肺腺癌） | 中皮腫 |
| Carletinin | Abcam | 1：100 | C | + | + | + | 中皮、上皮型中皮腫 | 褐色細胞腫 |
| Podoplanin（D2-40） | Dako | 1：100 | なし | + | f＋ | f＋ | 中皮、中皮腫 | 腺癌 |
| WT-1 | ニチレイ | 希釈済み | TE | - | - | - | 中皮、上皮型中皮腫 | 腺癌 |
| Cytokeratin 5/6 | Dako | 1：200 | TE | + | + | + | 中皮、上皮型中皮腫、扁平上皮癌 | 腺癌 |
| Gult 1 | Abcam | 1：100 | C | + | + | + | 上皮型中皮腫 | 反応性中皮 |
| CD146 | Abcam | 1：500 | C | + | + | + | 上皮型中皮腫 | 反応性中皮 |
| Desmin | Dako | 1：100 | TE | - | - | - | 反応性中皮 | 肉腫様中皮腫 |
| GATA3 | ニチレイ | 希釈済み | TE | + | + | + | 肉腫型中皮腫 | 肉腫様癌 |
| MUC4 | Bioss | 1：200 | TE | - | - | - | 肉腫様癌 | 肉腫型中皮腫 |
| Cytokeratin（AE1/AE3） | Dako | 1：200 | TE | + | + | + | 肉腫様中皮腫 | 肉腫 |
| Cytokeratin（CAM5.2） | BD | 1：10 | EDTA | + | + | + | 肉腫様中皮腫、扁平上皮以外の上皮 | 扁平上皮細胞 |
| Vimentin | Dako | 1：100 | なし | + | + | + | 中皮、肺肉腫様癌 | 癌腫 |
| BAP1（C-4） | ニチレイ | 希釈済み | TE | - | - | ± | 中皮、肺胞上皮 | 中皮腫、肺癌 |
CAE; Carcinoembryonic Antigen, EMA; Epithelial Membrane Antigen, TTF1; Thyroid Transcription Factor-1, Gult1; Gulcose Transporter 1, BAP1; BRCA1 associated protein 1, ニチレイ; NICHIREI BIO SCIENCES INC, JP., Dako; Agilent Technologies Japan, Ltd., Abcam; Abcam plc, UK, Bioss; Bioss Inc. US, BD; Becton Dickinson and campany, US, M.W.; Microwave, C; Citrate buffer solution pH 6.0, TE; 10 mM Tris 1 mM EDTA pH 9.0, EDTA; 1 mM EDTA pH 8.0, ＋; 陽性、－; 陰性、±; 弱陽性、f＋; 部分陽性。
染色体分析とmFISH法は継代4代目のFU-Meso-1 細胞でのG-bandが不明瞭だったため44代目のFU-Meso-1 細胞株を用いた。染色体分析は、通常のトリプシンG-band法で、mFISH法は 24XCyte-MetaSystem’ 24 color kit（MetaSystems, Altlussheim, Germany）を用いて添付文書に従って行った。mFISH法は蛍光顕微鏡（Axio Imager Z1; Carl Zeiss MicroImagiing, Jena, Germany）とIsis analysis system（MetaSystems, Altlussheim, Germany）を用いて解析した。核型はISCN（International System for Human Cytogenetic Nomenclature）2013のガイドラインに従って記載した10）。
FISH法はCDKN2A Spectrum Orange/CEP9 Spectrum Green（Abbott Molecular, Hes Plains, IL）を用いてCDKN2Aのコピー数を評価した。患者由来腫瘍とマウス移植腫瘍はFFPE切片標本上で、FU-Meso-1 細胞株は低張処理、カルノア固定された継代74代目の細胞のmetaphase spread 標本上で行った。FFPE切片標本は脱パラフィン後、前処理液（10 mMクエン酸緩衝液pH 6.0、0.1％NP40 シグマアルドリッチジャパン合同会社；21-3277-2）で96°C 30分のマイクロウェーブ処理を行い、室温になるまで放置後蒸留水で洗浄し、37°C 15分の0.1％0.3M酢酸溶液でペプシン処理（シグマアルドリッチジャパン株式会社；24-0940-2）を行った。その後、蒸留水で洗浄し、37°C 30分0.3M酢酸液で処理しPBSで洗浄後、室温10分の4％ホルムアルデヒドPBS溶液で後固定を行った。後固定後、蒸留水で洗浄し、エタノールで脱水乾燥したFFPE切片標本にプローブをのせカバーガラスを乗せペーパーボンドでシールし82°C 10分のdenatureを行い、37°Cで一晩ハイブリダイズさせた。その後ペーパーボンドを取り除き室温の2xSSC/0,2-0,3％NP40-Buffer内でカバーガラスが自然にはがれ落ちるのを待ち、続いて73°Cに温めた同bufferに2分間浸して余分なプローブを除去し、DAPI染色にて核を対比染色して蛍光顕微鏡（Axio Imager Z1; Carl Zeiss MicroImagiing, Jena, Germany）で観察した。蛍光シグナルはIsis analysis system（MetaSystems, Altlussheim, Germany）を用いて解析した。
6． 分子生物学的検索 1） 核酸の抽出患者由来腫瘍とマウス移植腫瘍はFFPE材料から、FU-Meso-1 細胞株は継代70代目の細胞をフラスコからセルスクレーパでかきとって採取した。DNAはMaxwell® RSC DNA FFPE Kit AS1450とMaxwell® RSC Cell DNA Purification Kit AS1370（Promega Corporation, WI, USA）、RNAは、Maxwell® RSC RNA FFPE Kit AS1440とMaxwell® RSC simply RNA Cells Kit AS1390（Promega Corporation, WI, USA）を用いてMaxwell® RSC System（Promega Corporation, WI, USA）によって抽出した。
2） RT-qPCR（Reverse transcription-quantitative PCR）CDKN2Aの発現はRT-qPCR法によって検出した。全RNAは、ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix（TOYOBO CO. LTD. Life Science Department, Osaka, Japan）によってcDNAを合成し、このcDNAを鋳型としてKAPA PROBE FAST qPCR Kit（KAPABIOSYSTMS, Boston, US）とTaq Man® Gene Expression Assays Hs00923894_m1 CDKN2A FAMTMdye（Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, US）を添付文書に従って、real time PCR装置 CFX Connect Real-Time System（Bio Rad Laboratories Inc., CA, US）を用いてtriplicateで行った。
3） メチル化特異的PCR法CDKN2Aのプロモーター領域のメチル化状態をメチル化特異的PCR法で解析した。抽出したDNAは、WZ DNA Methylation-GoldTM Kit（Zymo Research, Irvine, CA, US）を用いてバイサルファイト処理を行った。コントロールDNAにはEpiscope® Methylated HeLa gDNAとEpiscope® Unmethylated HCT116 DKO gDNA（TAKARA BIO INC., Shiga, Japan）を用いた。PCR反応はHotStarTaq® DNA Polymerase（QIAGEN GmbH）を用いて、トータル 20 μlで反応させた。PCRはASTEC PC320 サーマルサイクラー（ASTEC CO. LTD., Fukuoka, Japan）を用いて、初期熱変性95°C 15分、熱変性94°C 30秒、アニーリング69°C（メチル化プライマー）、67°C（非メチル化プライマー）1分、伸長反応72°C 30秒を45サイクルさせ最終伸長反応を72°C 3分で行った。増幅産物はDNA/RNA分析用マイクロチップ電気泳動装置（MCE®-202 MultiNA DNA-500 kit, shimadzu, Tokyo, Japan）を用いて解析した。
患者由来腫瘍のHE（Hematoxylin Eosin）染色像は、紡錘形の異形細胞がびまん性に増殖している肉腫様細胞の領域と、方形ないし扁平の上皮様細胞が腺腔を成す領域からなる二相型中皮腫の組織像を示した。マウス移植腫瘍とフラスコ内のFU-Meso-1 細胞株の位相差顕微鏡像には上皮様構造は認められず紡錘形の腫瘍細胞の増殖が認められた（図1）。免疫染色の結果は少なくとも2種の癌腫陰性マーカー（CEA, Ep-CAM）が陰性、2種の中皮陽性マーカー（Carletinin, Podoplanin）が陽性を呈した（表1）。
患者由来腫瘍のHE染色所見；紡錘形細胞の増殖を示す肉腫様部位（a）、扁平の上皮様細胞の増殖を示す部位（b）が認められる。マウス移植腫瘍のHE染色所見（c）；紡錘型細胞の増殖を示す。FU-Meso-1 細胞株の位相差顕微鏡所見（d）；紡錘型細胞が不規則に増殖している。
71代目のFU-Meso-1 細胞株の倍加時間は40.7時間であった（図2）。
2回目のFU-Meso-1 細胞株の細胞注入の約2ヵ月後に左背部の皮下に約 1×1×1.5 cmの大きさの腫瘤が形成された（図3）。
細胞移植2か月後、左背部に腫瘍が認められたSCIDマウス（楕円部分）（a）、腫瘍の割面（スケールmm）（b）。
トリプシンG-bandの結果とmFISHの結果を参考に核型表記を行った結果は46,XY,der（6）t（6;6）（p22;?）,der（6）t（X;6）（q13;p22）,der（8）t（1;8）（p11;q11）,t（12;14）（p11;p11.2）,der（12）t（22;12）t（p11;p13）,der（15）t（5;15）（?;q22）,+20,der（22）t（12;22）（?;q13）であった。トリプシンG-bandの結果はmFISHのDAPI染色バンドと同じなので示していない（図4）。染色体の核相はFU-Meso-1 細胞の4代目では 2nであったが、44代目では 2nと 4nが混在し、74代目になると 2nの細胞は消失し 4nの細胞のみとなった（表2）。
mFISH法（a）とDAPI染色によるバンドイメージ（b）とも2本の9番染色体に変異は認められない。
| 染色体数 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 81 | 82 | 83 | 84 | 88 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 継代数 | ||||||||||
| p4 | 1 | 4 | 11 | 0 | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| p44 | 2 | 0 | 20 | 1 | 0 | 2 | 3 | 9 | 10 | 0 |
| p74 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 0 | 3 | 14 | 0 |
p; passage.
患者由来腫瘍とマウス移植腫瘍そして74代目のFU-Meso-1 細胞株の間期核を200個以上カウントした結果CDKN2Aのコピー数はそれぞれnuc ish（D9Z3X2,CDK2AX1）［149/213］、nuc ish（D9Z3X2,CDK2AX1）［177/256］、nuc ish（D9Z3X4,CDK2AX2）［189/211］で、CDKN2Aのヘテロ欠失を認めた（図5）。74代目のFU-Meso-1 細胞株は染色体の核相が倍加し 4nとなっていたが（表3）、ヘテロ欠失を認めた。
患者由来腫瘍（a）、マウス移植腫瘍（b）、継代74代目のFU-Meso-1 細胞株の細胞（間期核）（c）、継代74代目のFU-Meso-1 細胞株の細胞（分裂中期核）（d）、矢印；緑2赤1（9番染色体動原2個、CDKN2A1個）、矢印頭；緑4赤2（9番染色体動原4個、CDKN2A2個）。
| 材料 | G1R1 | G1R2 | G2R1 | G2R2 | G3R1 | G3R2 | G3R3 | G4R1 | G4R2 | G5R3 | G6R3 | 細胞数 合計 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 患者由来腫瘍 | 49 | 0 | 149 | 8 | 4 | 1 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 213 |
| マウス移植腫瘍 | 36 | 0 | 177 | 8 | 19 | 9 | 0 | 1 | 6 | 0 | 0 | 256 |
| FU-Meso-1 細胞株 p74 | 0 | 0 | 2 | 5 | 10 | 0 | 0 | 0 | 189 | 4 | 1 | 211 |
G: 緑色シグナル、R: 赤色シグナル（ヘテロ消失：G2R1、G4R2）、p; passage.
RT-qPCRの結果すべての材料でCDKN2Aの発現は認められなかった（図6）。CDKN2Aのプロモーター領域のメチル化を調べた結果、すべての材料でCDKN2Aのプロモーター領域のメチル化が認められた（図7）。
レーン1；25bpサイズマーカー、レーン2；FU-Meso-1 細胞株（継代70代目）、レーン3；マウス移植腫瘍（FFPE切片）、レーン4；患者由来腫瘍（FFPE切片）、レーン5；qPCR Human Reference Total RNA（陽性コントロール）、レーン6；正常ヒト全RNA（陽性コントロール）。全ての材料でActinが検出されたが、陽性コントロール以外はCDKN2Aの発現は認められなかった。マウス移植腫瘍のバンドは非特異的なPCR産物。
レーン1；25bpサイズマーカー、レーン2；FU-Meso-1 細胞株（継代70代目）、レーン3；マウス移植腫瘍（FFPE切片）、レーン4；患者由来腫瘍（FFPE切片）、レーン5；Episcope® Methylated HeLa gDNA（メチル化コントロール）、レーン6；Episcope® Unmethylated HCT116 DK gDNA（非メチル化コントロール）。FU-Meso-1 細胞株、マウス移植腫瘍、患者由来腫瘍のDNAにはCDKN2Aのメチル化が認められる。患者由来腫瘍では非メチル化も認められる。
中皮腫は稀な悪性腫瘍であり、このような腫瘍の新鮮検体を臨床現場で入手することは困難なため腫瘍の細胞株は、新鮮検体の代わりとして細胞遺伝学的、分子生物学的検索を含む様々な検査を行うために有用な材料となる。今回私たちは過去に病理組織学的に上皮型と肉腫型の両方の成分からなる二相型MPMと診断され染色体分析を行ったMPM9）から細胞株FU-Meso-1 を樹立した。
FU-Meso-1 は異種移植能を認めた。理由は不明であるが、SCIDマウスの皮下で腫瘤を形成しなかった細胞株で一週間後に再度同じ部位に細胞を注入すると腫瘤が形成されたことを何度か経験し、今回もこの方法を用いた。
患者由来腫瘍の病理組織学的所見は二相性であったが、マウス移植腫瘍、FU-Meso-1 細胞株では上皮型の成分は認められなかった（図1）。しかし、免疫染色の結果、すべての材料で少なくとも2種の癌腫陰性マーカーが陰性、2種の中皮陽性マーカーが陽性を呈し、MPMの診断に矛盾はなかった（表1）。MPMの場合反応性の中皮細胞との鑑別が必須で、免疫染色のBAP1 陰性やFISH法によるCDKN2Aのホモ接合性の欠失の検出が有用とされている6,7,8）。今回の検索では患者由来腫瘍とマウス移植腫瘍は、BAP1 陰性を呈したがFU-Meso-1 細胞株は細胞全体がうすく着色し判定は難しいと思われた（表1）。FISH法によるCDKN2Aの接合性はヘテロ欠失を呈したが（図5）G-band法とmFISH法を用いた染色体分析ではCDKN2Aが存在する9番染色体の短腕には2本とも欠失は認められず、G-bandで検出できる水準の大きさの欠失ではないと思われた（図4）。
全ての材料でCDKN2Aのヘテロ欠失を呈したためRT-qPCR法でCDKN2Aの発現量を調べたが発現は認められなかった（図6）。血管内皮細胞のようなヒト由来の正常細胞を含む患者由来腫瘍では培養細胞やマウス移植腫瘍と異なりRT-qPCR法で正常細胞由来のCDK2Aの発現が認められるはずであるが、今回の検索では患者由来腫瘍でもCDKN2Aの発現は認められなかった（図6レーン4）。同時に行った陽性コントロールではCDKN2Aの発現が検出されたため手技に問題は無く、患者由来腫瘍でCDKN2Aの発現が認められなかった理由は不明である。
CDKN2AのFISH法によるDNAレベルの結果とRT-qPCR法によるRNAレベルの結果が一致しなかった為CDKN2Aのプロモーター領域のメチル化を調べたところ、すべての材料でメチル化が検出され、FU-Meso-1 細胞株はCDKN2Aを発現しておらずCDKN2Aはホモ接合性の欠失状態であることが示唆された（図7）。患者由来腫瘍では非メチル化のCDKN2Aも検出されたが、これは患者由来腫瘍に含まれる正常細胞由来であると思われる。
FU-Meso-1 細胞株は増殖が安定した44代目の染色体の核相は 2nが優勢であったが、培養を継続し継代数が74代目になると近 4nに置き換わっていた（表2）。この現象は細胞株が樹立される際に認められることがあり11）、細胞がフラスコ内で安定して増殖し続けるために必要な現象であるかもしれない。
MPMではFISH法によるCDKN2Aのホモ接合性の欠失を検出することが反応性中皮細胞との鑑別に有用とされるが8）、材料にはFFPE切片を用いることが多く、FISH用プローブと切片上のDNAとをハイブリダイズさせるために切片に前処理を行うことが必須である。今回私たちはFISH法で通常用いられる塩酸水の代わりに酢酸水を用いることで前処理に用いられるペプシンの濃度を5分の1に減らすことができた。FISH法はプローブ以外にもペプシンなど高価な試薬が多く、このことは経済的にも利点があると思われた。
細胞株FU-Meso-1 は患者由来腫瘍と共通した免疫組織学的性質を持ち異種移植能を持つことから、稀な悪性腫瘍である中皮腫の研究だけでなく分子標的薬や免疫療法薬などの新規治療法の開発や生物学的挙動を調査するのに役立つ可能性がある。また、MPMにおけるCDKN2Aのホモ接合性の検出にはFISH法だけでなくRT-qPCRの併用が望ましいと考えられた。
本論文内容に関連する著者の利益相反はない。
中皮腫の組織培養、染色体分析および遺伝子検査の機会を与えて下さった岩崎 宏 福岡大学名誉教授、本症例の病理診断においてご教示いただきました福岡大学医学部病理学講座 溝口 幹朗 博士（故人）に心より感謝いたします。
