2021 Volume 63 Issue 3 Pages 143-150
歯周病原細菌Porphyromonas gingivalisは歯肉上皮細胞へ感染することで，歯周病の病因に関与することが知られている。本研究では，ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスの，P. gingivalisの歯肉上皮細胞への感染に対する影響を調査した。
精製したP. gingivalis培養上清中のジンジパイン活性を測定したところ，ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスはジンジパイン活性を抑制した。P. gingivalisとヒト歯肉上皮細胞（Ca9-22）を共培養し，細胞表面に付着した生菌数を計測したところ，シャクヤクエキスはP. gingivalisのCa9-22表面への付着を抑制した。P. gingivalisとCa9-22を共培養し，細胞内に侵入した生菌数を計測したところ，ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスは，Ca9-22細胞内に侵入したP. gingivalis生菌数を減少させた。
ヒノキチオールはジンジパイン活性を抑制することで，シャクヤクエキスはジンジパイン活性およびP. gingivalisの細胞への付着を抑制することで，歯肉上皮細胞内に侵入したP. gingivalis生菌数の減少に寄与することが示唆された。
歯周病は歯周病原細菌によって引き起こされる慢性炎症性疾患である。歯周病が難治化する原因の一つとして，歯周病原細菌が歯肉上皮細胞へ感染することが報告されている1-4)。本来，病原性細菌は宿主細胞の免疫機構により排除されるが，歯周病原細菌Porphyromonas gingivalisは歯肉上皮細胞へ感染することで，宿主細胞の免疫応答から逃れ，組織損傷に寄与していると考えられている。歯周炎患者の病巣歯肉組織から歯周病原細菌が検出されることについては，複数の研究により明らかにされている5-7)。
P. gingivalisによる感染には，宿主細胞への付着，侵入/細胞内への移行，細胞内潜伏，脱出といった複数の段階がある。P. gingivalisはまず菌体表層の線毛を宿主細胞のインテグリンに結合させて細胞表面に付着し8)，宿主細胞のメンブレントラフィックのエンドサイトーシスにより細胞内に侵入する9,10)。細胞内に侵入したP. gingivalisは潜伏後，宿主細胞内でリソソームに移送され徐々に分解を受けるが，分解されずにエンドソームからリサイクリング経路に乗り移り，細胞外に脱出し，さらに周囲の細胞に再侵入する機構も報告されている11)。
P. gingivalisは組織破壊作用を有するプロテアーゼであるアルギニン―ジンジパイン（Arg-gingipain；Rgp）およびリジン―ジンジパイン（Lys-gingipain；Lgp）を産生するが，ジンジパインは宿主細胞内に侵入したP. gingivalis生菌数に影響を及ぼすことが報告されている12)。
ヒノキチオール（Hinokitiol）は天然ヒバから抽出した精油に含まれ，トロポロン骨格を持ち，抗菌作用や抗炎症作用が知られており，口腔ケア用素材としての研究も行われている13-15)。シャクヤクはキンポウゲ科のPaeonia albifloraであり，その根は生薬として古くから医薬品に用いられ，現在に至るまで漢方方剤や家庭薬に不可欠な生薬である。薬効は一般的に鎮痛，鎮静，収斂などの諸作用があるとされている16)。シャクヤクに含まれるペオニフロリンには抗炎症作用があることが知られている17)。
しかし，ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスについて，P. gingivalisの歯肉上皮細胞への感染を抑制する作用やジンジパイン活性抑制作用については明らかにされていない。本研究では，ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスの，P. gingivalisの歯肉上皮細胞への感染に対する影響を調査するために，ジンジパイン活性，P. gingivalisの歯肉上皮細胞への付着，および細胞内に侵入した生菌数に与える影響を評価した。
Japanese Collection of Research Bioresources（JCRB）細胞バンクより供与されたヒト口腔扁平上皮癌細胞株Ca9-22（JCRB0625）を，10%ウシ胎児血清（Fetal bovine serum；FBS，Corning，USA）を添加したMinimum Essential Medium（MEM；Gibco，USA）を用いて37℃，5% CO2条件下で培養し，実験に供した。
2． 供試菌株および培養独立行政法人 理化学研究所 微生物系統保存施設より入手したPorphyromonas gingivalis JCM 12257を，50 μg/mLヘミンおよび1 μg/mLメナジオンを添加したGAM Broth（日水製薬，Japan）を用いて，アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学，Japan）を利用した嫌気条件下，37℃で1日間培養し，実験に供した。
3． 材料ヒノキチオール（高砂香料工業社製），およびシャクヤクエキス（丸善製薬社製シャクヤク抽出物BG-JC）（シャクヤク根の50%BG抽出液）の凍結乾燥粉末を被験試料として実験に供した。
4． ジンジパイン活性抑制評価 4-1 P. gingivalis粗酵素液の調製Dou Yら18)の方法を参考に実施した。P. gingivalisを50 μg/mLヘミンおよび1 μg/mLメナジオンを添加したGAM Broth（日水製薬，Japan）を用いて，嫌気条件下，37℃で2日間培養した。上清を回収し，80%飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し，4℃で2時間撹拌した。遠心分離後，得られた沈殿物に20mM Tris-HCl（pH7.4），150mM NaCl，10mM CaCl2を加えて溶解し，これを透析膜に入れ，20mM Tris-HCl（pH7.4），150mM NaCl，10mM CaCl2，0.05％ Tween20に浸漬し，4℃で24時間透析した。溶液を回収し遠心分離後，得られた上清に終濃度25％となるようにグリセリンを添加して，これをP. gingivalis粗酵素液とした。
4-2 ジンジパイン活性の測定Dou Yら18)，Potempa Jら19)の方法を参考に実施した。0.05mMシステイン，各濃度の被験試料（ヒノキチオール0.02%，0.04%，シャクヤクエキス0.001%，0.01%），1/50量のP. gingivalis粗酵素液，および1mM Bz-L-Arg-ρNA・HCl［L-BAPA］（Benzoyl-L-arginine ρ-nitroanilide monohydrochloride；ペプチド研究所，Japan）（アルギニン―ジンジパイン特異的基質）又は1mM Ac-Lys-ρNA・HCl（渡辺化学工業，Japan）（リジン―ジンジパイン特異的基質）を0.1M Tris-HCl（pH7.4）に混合し，37℃で5時間インキュベートした（各成分の濃度は混合後の終濃度である）。各被験試料は終濃度0.4%ジメチルスルホキシドおよび0.4%ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油で溶解したものを試験に用いた。反応前後で波長430 nmにおける吸光度を測定し，反応により分解生成したパラニトロアニリン（ρNA）の，反応前後の変化量を算出した。
5． P. gingivalisの歯肉上皮細胞内に侵入した生菌数，および細胞に付着した生菌数の測定P. gingivalisの歯肉上皮細胞に侵入した生菌数の測定は，Imamuraら20)の方法に従い，antibiotic protection assayを実施した。Ca9-22を24well培養プレート（IWAKI，Japan）に1.5×105 cells/mL播種し，37℃，5% CO2条件下で24時間培養した。MEM培地に被験試料（ヒノキチオール0.04%，シャクヤクエキス0.01%）とP. gingivalis（MOI=100）を懸濁してCa9-22に添加し，37℃，5% CO2条件下で2時間共培養した。各被験試料は終濃度0.4%ジメチルスルホキシドおよび0.4%ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油で溶解した。Phosphate Buffered Saline（PBS）（－）で洗浄し，細胞に付着していないP. gingivalisを除去した。さらに，200 μg/mLメトロニダゾールおよび300 μg/mLゲンタマイシンを含むMEM培地にて1時間培養し，細胞に付着したP. gingivalisを除去した。PBS（－）で洗浄し，滅菌蒸留水で1/20に希釈したPBS（－）で30分間処理し，細胞を溶解した。溶解物を段階的に希釈し，50 μg/mLヘミン，1 μg/mLメナジオンおよび5%馬脱繊維血液（日本バイオテスト研究所，Japan）を添加したGAM Agar（日水製薬，Japan）に播種し，37℃，嫌気条件下で黒色コロニーが出現するまで培養した。寒天培地で生育した黒色コロニーのコロニー形成単位（CFU）をカウントし，1wellあたりの歯肉上皮細胞内に侵入したP. gingivalis生菌数を算出した。
細胞に付着した生菌数の測定は，細胞に付着したP. gingivalisの除去を行わなかった以外は，細胞内に侵入した生菌数測定と同様の操作を行った。本操作により，細胞に付着した生菌数と細胞内に侵入した生菌数の総和が得られるため，総和から細胞内に侵入した生菌数を引いた値を算出し，付着菌数とした。
6． 免疫染色による歯肉上皮細胞内に侵入したP. gingivalis分布の観察免疫染色による歯肉上皮細胞に侵入したP. gingivalis分布の観察は，Imamuraら20)の方法に従い実施した。35 mmガラスベースディッシュ（IWAKI，Japan）上に，5. と同様の操作で被験試料（ヒノキチオール0.04%，シャクヤクエキス0.01%）とP. gingivalisを懸濁してCa9-22に添加し，2時間共培養した。各被験試料は終濃度0.4%ジメチルスルホキシドおよび0.4%ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油で溶解した。PBS（－）で洗浄後，4%パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液で固定した。PBS（－）で洗浄後，0.5% BSA/PBS（－）を添加し，室温で30分間インキュベートした。PBS（－）で洗浄後，抗P. gingivalisマウスIgG1モノクローナル抗体（Antigen：Gingipain/P. gingivalis hemagglutinin 61BG1.3）（DSHB，USA）100 pg/mLを0.5% BSA/PBS（－）で希釈して添加し，室温で60分間インキュベートした。PBS（－）で洗浄後，二次抗体としてm-IgGκ BP-CFL 488（Santa Cruz Biotechnology，USA）（1：200希釈）を添加し，室温で40分間インキュベートし，細胞に付着したP. gingivalisを緑色に染色した。PBS（－）で洗浄後，PBS（－）で希釈した0.4% Triton X-100を添加し，室温で5分間インキュベートし，細胞膜透過処理を行った。PBS（－）で洗浄後，抗P. gingivalis抗体（Antigen：Gingipain/P. gingivalis hemagglutinin 61BG1.3）（DSHB，USA）100 pg/mLを添加し，室温で60分間インキュベートした。PBS（－）で洗浄後，二次抗体としてm-IgGκ BP-CFL 594（Santa Cruz Biotechnology，USA）（1：200希釈）を添加し，室温で40分間インキュベートし，細胞内に侵入したP. gingivalisを赤色に染色した。二次抗体と同時に，細胞骨格アクチンをAlexaFluor Plus 405 Phalloidin（Thermo Fisher Scientific，USA）（1：5000希釈）で青色に染色した。共焦点レーザー顕微鏡（TPS-SP5，Leica，Germany）を用いてP. gingivalisの細胞内分布を観察した。細胞内の細菌はZ軸方向の様々な位置に分布しており，網羅的な菌数を把握するために，Z軸方向に細胞の底面と上部を指定し，10枚のZ-Stack画像（連続断面画像）を取得後，重ね合わせ画像の構築を行った。
7． 統計解析統計学的解析にはSPSSⓇ Statistics ver25（IBM，USA）を用いた。ジンジパイン活性の解析はTukey's HSD testを実施し，P. gingivalisの歯肉上皮細胞内に侵入した生菌数，および細胞に付着した生菌数の測定の解析はDunnett's testを実施した。有意水準はp＜0.05とした。
アルギニン―ジンジパイン活性およびリジン―ジンジパイン活性は，硫安分画により精製したP. gingivalis培養上清をジンジパイン特異的基質と混合し，基質が分解された時の発色により評価した。その結果，図1a）に示すように，基質とP. gingivalis粗酵素液を混合すると，アルギニン―ジンジパイン活性が得られたが，ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスは，濃度依存的にアルギニン―ジンジパインの活性を抑制した。また，図1b）に示すように，ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスは，同様にリジン―ジンジパイン活性を抑制した。
ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスのジンジパイン活性抑制作用
ジンジパイン活性を，硫安分画により精製したP.gingivalis培養上清をジンジパイン特異的基質と混合し基質が分解された時の発色により評価した。a）ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスは，アルギニン―ジンジパイン活性抑制作用が認められた。b）ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスは，リジン―ジンジパイン活性抑制作用が認められた。（＊p＜0.05，Tukey’s HSD test，n＝5）
歯肉上皮細胞へのP. gingivalis付着抑制作用を，ジンジパイン活性の測定より得られた至適濃度を用いて，P. gingivalisとCa9-22を共培養し，細胞に付着した菌数を計測することで評価した。なお，試験濃度のヒノキチオール，シャクヤクエキスともに，P. gingivalis細菌への障害性およびCa9-22細胞への障害性は確認されなかった（結果未掲載）。その結果，図2に示すように，Controlと比較してシャクヤクエキスはCa9-22へのP. gingivalisの付着抑制作用が認められた。一方，ヒノキチオールにP. gingivalisの付着抑制作用は認められなかった。
シャクヤクエキスの歯肉上皮細胞へのP. gingivalis付着抑制作用
歯肉上皮細胞へのP.gingivalis付着抑制作用を，P.gingivalisとCa9-22を共培養し，細胞に付着した菌数を計測することで評価した。シャクヤクエキスに，歯肉上皮細胞内へのP. gingivalis付着抑制作用が認められた。（＊p＜0.05，Dunnett’s test，n＝5）
歯肉上皮細胞内に侵入したP. gingivalis生菌数を，P. gingivalisとCa9-22を共培養し，細胞に付着した菌を除去した後に細胞を溶解し，細胞内の生菌数を計測することで評価した。その結果，図3に示すように，Controlと比較してヒノキチオールおよびシャクヤクエキスは，歯肉上皮細胞内に侵入したP. gingivalis生菌数を減少させた。
ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスの歯肉上皮細胞内に侵入したP. gingivalis生菌数に対する減少作用
antibiotic protection assay を実施し，P.gingivalisとCa9-22を共培養し，細胞内に侵入した生菌数を計測した。ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスは，歯肉上皮細胞内に侵入したP. gingivalis生菌数を減少させた。（＊p＜0.05，Dunnett’s test，n＝5）
歯肉上皮細胞内に侵入したP. gingivalis分布を，P. gingivalisとCa9-22を共培養した後に免疫染色し，共焦点レーザー顕微鏡で解析することで評価した。細胞内に侵入したP. gingivalisを赤色，細胞に付着しているP. gingivalisを緑色，細胞骨格アクチンを青色に染色した。細胞に付着しているP. gingivalisは赤色と緑色両方の抗体で染色されるため，画像では黄色で示される。その結果，図4a）に示すように，P. gingivalisと歯肉上皮細胞を共培養すると，細胞内に侵入したP. gingivalisが観察された。一方，図4b）およびc）に示すように，ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスを添加すると，歯肉上皮細胞内のP. gingivalisの分布が少ない様子が観察された。
ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスの歯肉上皮細胞内に侵入したP.gingivalis分布への影響
細胞内に侵入したP.gingivalisを赤色，細胞に付着しているP.gingivalisを緑色，細胞骨格アクチンを青色に染色し，共焦点レーザー顕微鏡で観察した。a）P.gingivalisと歯肉上皮細胞を培養すると，細胞内に侵入したP.gingivalisが観察された。b）ヒノキチオールおよびc）シャクヤクエキスを添加すると，歯肉上皮細胞内のP.gingivalisの分布が少ない様子が観察された。
P. gingivalisによる感染には，宿主細胞への付着，侵入/細胞内への移行，細胞内潜伏，脱出といった複数の段階がある。P. gingivalisはまず菌体表層の線毛を宿主細胞のインテグリンに結合させて細胞表面に付着し8)，宿主細胞のメンブレントラフィックのエンドサイトーシスにより細胞内に侵入する9,10)。細胞内に侵入したP. gingivalisは潜伏後，宿主細胞内でリソソームに移送され徐々に分解を受けるが，分解されずにエンドソームからリサイクリング経路に乗り移り，細胞外に脱出し，さらに周囲の細胞に再侵入する機構も報告されている11)。また，P. gingivalisが産生するジンジパインは，宿主細胞内に侵入したP. gingivalis生菌数に影響を及ぼすことが報告されている12)。
本研究では，精製したP. gingivalis培養上清中のジンジパイン活性を測定したところ，ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスはジンジパイン活性を抑制することが明らかとなった。また，P. gingivalisとCa9-22を共培養し，細胞表面に付着した生菌数を計測したところ，シャクヤクエキスはP. gingivalisのCa9-22表面への付着を抑制した。さらには，P. gingivalisとCa9-22を共培養し，細胞内に侵入した生菌数を計測したところ，ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスは，Ca9-22細胞内に侵入したP. gingivalis生菌数を減少させることが明らかとなった。
ヒノキチオールはジンジパイン活性を抑制することで，シャクヤクエキスはジンジパイン活性およびP. gingivalisの細胞への付着を抑制することで，歯肉上皮細胞内に侵入したP. gingivalis生菌数の減少に寄与することが示唆された。
ヒノキチオールにおいては，ジンジパイン活性抑制作用および細胞内に侵入した生菌数の減少が認められたが，細胞への付着抑制作用は認められなかったことから，ヒノキチオールとシャクヤクエキスでは歯肉上皮細胞内に侵入したP. gingivalis生菌数を減少させたメカニズムが異なることが考えられる。
P. gingivalisは，ジンジパインの作用により宿主細胞内でのリソソームによる分解に対する耐性を獲得することで，細胞内での生存維持を可能にすることが示唆されている21)。ジンジパイン活性の抑制は，細胞内に侵入した生菌数に関与する様々なメカニズムに影響を与えた可能性がある。P. gingivalisの細胞内感染に関わるメカニズムは多岐にわたり，ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスが細胞内の生菌数に与える影響は，本研究で検討した以外にも様々な要因が考えられる。メンブレントラフィックのエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる過程や，ヒノキチオールあるいはシャクヤクエキスにより活性化した細胞が，細菌を貪食した後に消化する過程に作用し，細胞内の生菌数が低下した可能性も考えられる。今後の研究においてさらなるメカニズムを追求していく必要がある。また，Primaryの歯肉上皮細胞を用いた場合に同様の結果が得られるかの検証や，実際に臨床で炎症局所に適用した場合の効果の検証については今後の課題である。
ジンジパインはP. gingivalisの産生する主要なプロテアーゼであり，生体タンパク質の分解を引き起こし，宿主細胞に傷害を与え，歯周病に関連する種々の病態を生み出すと考えられている。ジンジパインは宿主に対して強い病原性を発揮する一方で，P. gingivalis自身にとってはその増殖に不可欠であり，ジンジパイン阻害薬の存在下ではP. gingivalisは増殖できないことが知られている22)。したがって，ジンジパインに対する特異的阻害薬の開発は歯周病の制御に応用できる可能性が高い。また，P. gingivalisが産生するジンジパインは認知症等の全身疾患とも関連することが知られており，ジンジパイン阻害薬に関する研究が進んでいる23)。本研究では，P. gingivalisの歯肉上皮細胞への感染に及ぼす影響という観点でジンジパイン活性抑制作用を評価したが，ジンジパイン阻害薬の新たな発見という観点からも，本研究結果は非常に有用なものだと考える。
ヒノキチオールはこれまでに抗菌作用や抗炎症作用が明らかにされており13-15)，シャクヤクはその根を生薬として古くから医薬品に用いられ，薬効は一般的に鎮痛，鎮静，収斂などの諸作用があるとされている16,17)。本研究により，P. gingivalisの歯肉上皮細胞への感染に対するヒノキチオールおよびシャクヤクエキスの有用性が初めて明らかとなった。ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスは天然由来成分であるため安全性が高く，歯磨剤等の口腔ケア製品に既に配合されている成分である。これらの成分を口腔内に適用することで，歯周病の予防や改善につながる可能性があると考える。
ヒノキチオールはジンジパイン活性を抑制することで，シャクヤクエキスはP. gingivalisの細胞への付着の抑制およびジンジパイン活性を抑制することで，歯肉上皮細胞内に侵入したP. gingivalis生菌数の減少に寄与することが示唆された。
ヒノキチオールおよびシャクヤクエキスは，口腔内に適用することでP. gingivalisの歯肉上皮細胞への感染を抑制し得る有用な素材であると考えられる。
本研究の実施にあたり，技術的なご指導を頂きました東京歯科大学歯周病学講座・齋藤淳教授，今村健太郎講師に厚く御礼申し上げます。
ならびに，研究遂行のご助言を頂きました日本大学生物資源科学部・花澤重正元教授に厚く御礼申し上げます。
本報告は，第62回秋季日本歯周病学会学術大会（2019年10月25-26日，北九州）にて発表された内容を一部改変したものである。
今回の論文に関連して，開示すべき利益相反状態は以下の通りです。
発表者は日本ゼトック株式会社に属する社員である。本研究は日本ゼトック株式会社の研究資金で行われた。
