総説
生物界最速のミオシンの構造－機能相関
2023 年 63 巻 2 号 p. 91-96
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2023 年 63 巻 2 号 p. 91-96
生物界最速ミオシンが淡水産藻類シャジクモに存在することが予見されていたが，その実体は不明であった．最近，私達はそのクローニングに成功し，さらに，最速のミオシンクラスであるミオシン11の高解像度結晶構造解析に世界で初めて成功し，最速ミオシンの秘密はアクチンとの結合領域にあることを明らかにした．
It has been predicted that the fastest myosin in the biological world exists in alga Chara, but its identity has remained unknown. Recently, we succeeded in cloning the fastest myosin and characterized its amino acid sequence. We also we succeeded in solving the first atomic structure (2.8 Å resolution) of myosin 11, the fastest myosin class, using X-ray crystallography. Based on this crystal structure and mutation experiments, it appears that that the actin-binding region contributes to the fast movement of Chara myosin 11.
50年以上前から淡水に生育する藻類のシャジクモ（図1A）には70 μm/sで運動する地球上で最も速いミオシンが存在することが予見されていた．しかし，その実体は不明であった．最近，私達はこの予見されていた最速ミオシンのクローニングに成功し，そのアミノ酸配列を明らかにした．さらに，最速のミオシンクラスであるミオシン11の高解像度結晶構造解析に世界で初めて成功し，それを用いたホモロジーモデルおよび変異実験により最速ミオシンの秘密はアクチンとの結合領域にあることを明らかにした1)．本稿ではこの最新結果に加え，多くの日本人研究者が牽引してきたシャジクモを含む植物ミオシン研究の歴史を概説する．
A．シャジクモChara braunii．B．ミオシン11が尾部で小胞体に結合してアクチン繊維上を運動することで植物細胞内で原形質流動が起きている．C．ミオシン11のドメイン構造模式図．N末端からモータドメイン，レバーアームとして機能する6つのIQ motif，二量体を形成するcoiled-coilと続き，C末端には小胞体と結合する球状尾部ドメイン（GTD）がある．このドメイン構造は動物のミオシン5と似ている．文献1より一部改変転載．
ミオシンはATP加水分解により生じた化学エネルギーを利用して，アクチン繊維上を運動する真核生物に普遍的に存在する代表的な分子モーターである．その発見は1942年のセント＝ジョルジによる筋収縮研究に遡る．発見から1990年代まで約50年の間，ミオシン研究のほとんどは筋肉ミオシンを用いて行われ，様々なミオシン運動機構のモデル仮説が提唱された．しかし，筋肉ミオシンのみを研究材料として使用している間は，どのモデル仮説に対しても決定的な実験的証拠は得られなかった．ゲノム解析および遺伝子発現系の開発が進んだ2000年前後からミオシン研究の主流は筋肉ミオシンからクラス5ミオシン（ミオシン5），クラス6ミオシン（ミオシン6）などの様々なクラスのミオシンへと移行した．様々なクラスの多様な運動特性持つミオシンを用いた1分子イメージング，X線結晶構造解析，クライオ電子顕微鏡解析，AFM解析などによりミオシン研究は飛躍的に進んだ．現在ではATP加水分解に対応してレバーアーム領域が構造変化する「レバーアームモデル」でミオシン運動機構が説明されるようになった2),3)．なお，ミオシン運動にはレバーアームモデルだけで説明できない多くの実験観察結果があり，方向バイアスを持ったブラウン運動も寄与していると考えられている4)-6)．
ミオシンは79のクラスにおよぶスーパーファミリーを構成しており，さらにそれぞれのクラスには様々なサブクラスが存在する7)．生物種，組織，細胞が異なると発現しているミオシンのクラス，サブクラスは異なる．そして，クラス，サブクラスが異なると運動速度，運動方向，duty ratio（ATP加水分解サイクル時間におけるアクチンと結合している時間の割合），力の大きさなどミオシン特性が異なる8)．ミオシンのクラス，サブクラス特異的な機能特性を生み出しているアミノ酸配列や構造的特徴についての知見は乏しい．
ミオシンスーパーファミリーで最速の運動速度を持つミオシンクラスはクラス11（ミオシン11）である．ミオシン11は植物（藻類含む）だけに存在する植物特異的ミオシンであり，尾部ドメインで小胞体などオルガネラに結合し，モータードメインでアクチン繊維上を運動する（図1B）．流体力学的考察からミオシンのみの運動だけでは流動は生じないが，巨大な小胞体を引き連れてアクチン繊維上を運動することにより原形質流動とよばれる細胞内流動が起きると考えられている（図1B）．原形質流動は植物細胞だけにみられる現象であり，その生理的意味は細胞の大きさと関係があると考えられている．動物細胞は直径10 μm程度であるが，植物細胞は分裂を伴わない細胞成長が起きるので，成熟した細胞では直径100 μmを超え，1 mm以上の細胞もある．ブラウン運動による拡散時間は距離の二乗に比例する．直径10 μmの動物細胞においては細胞外から取り入れた糖などの低分子がブラウン運動で細胞内に拡散するのに要する時間はわずか0.05秒程度であるが，直径1 mmの植物細胞では約10分かかる．細胞サイズが大きい植物細胞ではブラウン運動による拡散だけは不十分なので，原形質流動により拡散を促進するように進化したと考えられている9)．
イネ，シロイヌナズナ，タマネギなど被子植物の原形質流動速度は7 μm/s程度であるが，淡水産藻類のシャジクモの原形質流動速度は70 μm/sと桁違いに速い．シャジクモの細胞は直径が1 mm，長さが5-10 cmと桁違いに大きいので，このような桁違いの速さの原形質流動を持つように進化したと考えられる．
1950年代に大阪大学の神谷・黒田は，シャジクモ細胞の原形質流動速度は細胞膜近傍が最も速く，細胞膜から離れるほど遅くなることを見いだし，流体力学的考察から原形質流動の駆動装置が細胞膜直下に存在することを提唱した10)．1974年に電子顕微鏡観察により，シャジクモの細胞膜直下にはアクチン繊維が配向していることが明らかになり11)，原形質流動はミオシンにより駆動されていると考えられるようになった．このことは，シャジクモには動物の骨格筋ミオシンよりも10倍以上速い70 μm/sの速度をもつ生物界最速のミオシンが存在することを意味した．1974年当時は植物にミオシンが存在することさえ知られていなかったこともあり，それ以降，世界中の多くの研究者によりシャジクモから生物界最速ミオシンの精製が試みられた．しかし，細胞体積の95%以上をタンパク質分解酵素に富む液胞が占めている植物細胞からのミオシン精製は困難を極め，その成功報告まで20年を要した．
1994年に山本らはシャジクモChara corallinaの節間細胞の両端をハサミで切断し，そこにbuffer溶液を灌流して，細胞の大半を占めている液胞を洗い出した．そして，細胞膜近傍にわずかに残っている原形質のみを精製に用いることにより，ついにシャジクモからのミオシンの精製に成功した．しかし，精製ミオシンの運動速度は25 μm/sであり，シャジクモの原形質流動速度から予測された70 μm/sの1/3であった12)．この報告と同時期に横田らは液胞が少ないユリの花粉管からユリのミオシンの精製に成功した13)．1994年の山本と横田の2つの論文が植物ミオシンの最初の報告である．なお，植物からのミオシン精製はその困難さに加え，収量も少ないので，詳細な生化学的解析は難しい．そのため，植物から直接のミオシン精製は山本，横田以降はほとんど行われていない．なお，ミオシン11遺伝子の発見も動物ミオシンに比べて遅く，1993年のシロイヌナズナのミオシン11のクローニングが最初である．クローニングにより明らかになったミオシン11の構造は動物のミオシン5と良く似ていた（図1C）．
2000年に樫山・山本らは精製したシャジクモミオシンに対して作製した抗体を用いてシャジクモChara corallinaのcDNAライブラリーに対してイムノスクリーニングを行い，ミオシン11（Cc 11）遺伝子のクローニングに成功した14)．同年，森松らも同じ手法でクローニングしたが，その遺伝子は樫山が報告したCc 11と同じであった15)．
Cc 11の高速運動の基盤となる詳細な酵素kineticsを明らかにするためには純度の良いミオシンが多く必要である．そこで，私達はCc 11遺伝子を昆虫細胞発現系で発現させ，精製した．その速度は22 μm/sであり，シャジクモの原形質速度の70 μm/sの1/3であった．一方，22 μm/sは骨格筋ミオシンの3倍の速度であり，従来ミオシンの中では最速である．私達はこの「従来最速ミオシン」のCc 11を用いて，Cc 11はATP加水分解活性も極めて高いこと16)，Cc 11の高速運動の理由はアクチンに結合したときのADP解離速度が非常に大きいこと17)，Cc 11の高速運動はアクチン結合配列が規定していること18)，Cc 11を陸上植物に遺伝子導入すると原形質流動速度の上昇とともに植物が大型化すること9)などを明らかにした．
近年，次世代シークエンサーの発展・普及により，多様な生物のゲノムプロジェクトが可能となった．そして，2018年に西山，坂山らによりシャジクモChara brauniiのゲノム情報が明らかにされた19)．なお，Chara brauniiはChara corallinaと同属近種であり，どちらも植物最速の70 μm/sの原形質流動を持っている．ゲノム解析からChara brauniiには4つのミオシン11遺伝子が存在することが示唆された．私達は西山，坂山と共同で4つのミオシン11遺伝子のcDNAをクローニングし，Cb 11-1，2，3，4と名付けた．これらの4つのモーター領域のアミノ酸配列から系統樹を作製したところ，4つのミオシンは2つのサブクラスに分かれ，先に報告された22 μm/sのCc 11はサブクラス2のCb 11-4のオルソログだった（図2）．これら4つのミオシン11を昆虫培養細胞で発現させ，精製し，in vitro運動アッセイで運動速度を測定したところ，今回新たにクローニングしたサブクラス1のCb 11-1とCb 11-2が長年にわたりその存在が予見されていた速度70 μm/sの超高速ミオシンであり，Cb 11-1が73 μm/sの生物界最速のミオシンであることがわかった（図2，図3）1)．
シャジクモミオシンのモータードメインのアミノ酸配列にもとづく系統関係とそれぞれのミオシンの運動速度．文献1より改変転載．
様々な生物の様々なクラスのミオシンの運動速度．濃緑：シャジクモ，緑：シロイヌナズナ，マゼンタ：動物．文献1より一部転載．
最速運動を可能にしている構造的特徴を明らかにするためにCb11-1のモータードメイン（Cb11-1 MD）の結晶化を試みた．しかし，Cb 11-1は変性しやすい性質のため結晶化に至らなかった．そこでCb 11-1MDとアミノ酸配列の相同性が高い（similarity 87%, identity 63%）シロイヌナズナのミオシン11-2のMD（At 11-2 MD）を結晶化し，At 11-2の構造を使ったホモロジーモデルによりCb 11-1の3次元立体構造モデルを作製することにした．
昆虫培養細胞で発現，精製したAt 11-2 MDにADPとAlF4–を加えてインキュベートし，シッティンクドロップ蒸気拡散法で結晶化を行い，得られた結晶に対して波長0.98 ÅでX線回折実験を行いADP・Pi状態（プレパワーストローク状態）の高分解能（2.8 Å）構造を取得することに成功した．これが最速ミオシンクラスであるミオシン11の最初の高解像度結晶構造である1)．At 11-2の構造を同じADP・Pi状態の動物の3つのクラスのミオシンと比較した．構造比較した動物の3つのミオシンと比べて，At 11-2の運動速度は桁違いに速いが，At 11-2のヌクレオチド結合領域の構造は比較した動物の3つのミオシンとほぼ同じであった．この結果は，ミオシン運動速度の律速であるADP解離反応はヌクレオチド結合領域以外の構造で決まっていることを示唆する．実際，いろいろなクラスのミオシンのアミノ酸を比較し，アミノ酸の保存性を調べたところ，ヌクレオチド結合領域など分子中心部分は保存性が高く，逆に分子周辺部は可変性が高かった．特にアクチン結合部位であるloop2，loop3，loop4，CM-loop，helix-turn-helixの5箇所は，アミノ酸可変性が極めて高いことがわかった（図4）1)．
A．シロイヌナズナのミオシン11-2のアクチンドッキングモデル．アクチン上の矢印はアクチン繊維のプラス端方向を示す．B．様々なミオシンのモータードメインのアミノ酸の可変性および保存性を示すヒートマップ．分子中心部は保存性高く，周辺部が可変性高い．文献1より改変転載．
そこで，Cb 11-1と他のミオシンでアクチンとの結合様式に違いがあるかどうかを検証するため，Cb 11-1の構造をAt 11-2の構造を使ったホモロジーモデルで作成し，アクチンとドッキングさせた．ドッキングには最近報告されたクライオ電子顕微鏡によるCc 11のアクチン結合構造20)を使用した．Cb 11-1を含む様々なミオシンのアクチン結合様式を比較すると，アクチン結合様式はミオシンのクラス，サブクラスが異なると大きく異なっていることがわかった（図5）1)．
様々なミオシンのloop4とCM-loopとアクチンとの結合．loop4およびCM-loopが結合しているアクチン領域（濃いオレンジ色で示した領域）はミオシンのクラス，サブクラスにより異なっている．文献1より一部改変転載．
ミオシン運動速度は（ステップサイズ）×（アクチンとの強い結合時間）–1で近似される．ステップサイズはミオシン間であまり差がなく，ミオシンの速度を規定するのはアクチンとの強い結合時間である．そして，アクチンとの強い結合時間は，アクチン結合したミオシンからのADP解離速度で規定される2),3)．そのため，様々なミオシンの運動速度（図6A）はアクチン結合したミオシンからのADP解離速度（図6B）と強い相関がある．一方，アクチンに結合していないミオシンからのADP解離速度は非常に遅く，速いミオシンも遅いミオシンでもほとんど変わらない（図6C）．つまり，ADP解離反応はアクチンとの結合により加速され，その加速は速いミオシンほど顕著となる（図6D）17)．
4つのクラスのミオシンの運動速度（A），アクチンに結合した状態のミオシンからのADP解離速度（B），アクチンに結合していない状態のミオシンからのADP解離速度（C）アクチン結合によるミオシンからのADP解離速度の加速倍率（D）（Cc 11: Chara corallina myosin 11, Rb Fsk 2: Rabbit Fast skeletal muscle myosin 2, Chick 5: Chicken myosin 5, Pig myosin 6）．
このアクチン結合依存的なkineticsと，前述した「ミオシンのアクチン結合様式はミオシン間で大きく異なる」との構造解析結果を考え合わせると，「ミオシンはクラス，サブクラスによりアクチン結合様式が異なり，そして結合様式に依存してADPの解離反応を様々な速度で加速させ，それによりミオシンのクラス，サブクラスの間での運動速度の違いが生まれる」と考えられる．
この仮説を検証するために，私達はミオシンのアクチン結合領域に変異を与えたとき運動速度が変化するかどうかを調べた．高速のシャジクモのミオシン11はアクチン結合領域のloop 2に特徴がある．多くのクラスのミオシンのloop 2はリジンを中心とした正電荷アミノ酸が多く，loop 2全体として+3から+6の正電荷を帯びている．一方，シャジクモのミオシン11のloop 2は正電荷アミノ酸が少なく，loop 2全体の電荷は0である．遺伝子変異によりシャジクモミオシンCc 11のloop 2にリジンを加え，正電荷を増やすと，ADP解離速度，運動速度が減少した．Cc 11のloop 2にリジンを4つ導入し，loop 2の電荷を野生型Cc 11の0から骨格筋ミオシンと同様の+4まで増やした変異Cc 11の運動速度は野生型Cc 11の1/4であった．この運動速度は骨格筋ミオシンとほぼ等しい．つまり，骨格筋ミオシンとシャジクモミオシンCc 11の運動速度の差はloop 2の配列（電荷）の違いで説明できる．一方，Cc 11のloop 2の電荷を野生型の0から–2に下げた変異Cc 11は野生型Cc 11より，なんと，1.5倍速くなった．このようにCc 11のloop 2配列を変えるだけで，ミオシン速度が下に0.25倍，上に1.5倍，トータル6倍（=1.5/0.25）変化したのである18)．
多くのクラスのミオシンのloop 2の正電荷アミノ酸はアクチンのN末端の負電荷アミノ酸と結合する．一方，loop 2の電荷が0のシャジクモのミオシン11においては，loop2はアクチンの結合にほとんど寄与していないことが化学架橋実験からも明らかになった．他方，シャジクモのミオシン11のloop 3は正電荷が他のクラスのミオシンと比べて多く，loop 3全体がより正に荷電しており，アクチンとの結合に強く関与していた．シャジクモミオシンは正電荷の少ないloop 2によるアクチン結合が弱い分，正電荷の多いloop3でアクチン結合力を補っているのである．このように，シャジクモのミオシン11の高速運動の主な原因はloop 2とloop 3の特異的な配列を介したアクチンとの結合様式にあることが明らかになった18)．
私達が最近クローニングに成功した生物界最速のミオシンであるCb11-1はCc 11の3倍の速度を持っている．同じクラスのCb11-1とCc 11の速度の違いも主にアクチン結合の違いにより生じることが変異実験から明らかになった．Cb11-1のloop 2はCc 11と同じく全体電荷が0であるが，Cc 11との違いとしてCb11-1のloop 2にはグリシンが5残基挿入されている．このポリグリシン挿入によりCb11-1のloop 2の柔軟性が増加していると考えられる．さらに，CM-loopの配列もCb11-1とCc 11とで大きく異なっている．Cc 11のloop 2とCM-loopの配列をCb11-1のそれぞれの配列に置換した変異Cc 11の運動速度は野生型Cc 11より1.5倍増加した1)．以上から，ミオシンのアクチン結合サイトがミオシン速度の主な規定要因として機能していることが明らかになった．
ミオシンはアクチンとの結合によりアクチン結合サイトのcleft（図4B）が閉じる．cleftが閉じる構造変化はヌクレオチド結合領域の構造にも変化を与え，ADP解離とリン酸解離を促進する「アクチンによる活性化反応」が起きる2),3)．ミオシンのクラス，サブクラスが異なると，アクチンに結合したときのcleftの閉じ方が異なり，これによりADP解離速度に違いが生じ，クラス，サブクラスの違いによるミオシン速度の違いを引き起こしていると考えられる．近年，クライオ電子顕微鏡により様々な種類のミオシンのアクチンとの結合様式が明らかになりつつある．アクチンに結合したときのcleftの閉じ方と運動速度との相関関係が近い未来に明らかにされることが期待される．
生物界最速ミオシンの構造的知見および変異実験により，アクチン結合部位がCb 11-1の超高速運動の特異性を生み出していることがわかった．私達は以前，植物内のミオシンを高速化すると，原形質流動が高速化し，植物の大型化につながることを示した9)．植物への生物界最速ミオシンCb 11-1の遺伝子導入や，植物内在ミオシンのアクチン結合部位の改変による原形質流動高速化により穀物・バイオマス・資源植物などの増産が期待できる．最速のミオシンCb 11-1は超高速運動するナノマシンの開発への応用も期待できる．
伊藤光二（いとう こうじ）
千葉大学大学院理学研究院生物学研究部門教授
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原口武士（はらぐち たけし）
千葉大学大学院理学研究院生物学研究部門助教
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玉那覇正典（たまなは まさのり）
千葉大学大学院融合理工学府博士後期課程在学中
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鈴木花野（すずき かの）
千葉大学大学院理学研究院化学研究部門特任助教
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村田武士（むらた たけし）
千葉大学大学院理学研究院化学研究部門（膜タンパク質研究センター）教授（センター長）
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