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我々が考案した血液培養陽性ボトルからの直接同定を目的とした簡便な前処理方法の評価
2018 年 67 巻 5 号 p. 623-630
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2018 年 67 巻 5 号 p. 623-630
近年，質量分析装置を用いた血液培養陽性ボトルから直接同定を行うための前処理方法が種々検討されているが，同定率など十分満足できるものではない。原因として質量分析装置で直接同定を行う際，ヘモグロビンなどの生体由来蛋白質の存在が結果に影響し，同定率が低下しているのではないかと考えた。本研究では，生体由来蛋白質の除去を目的としてセミアルカリプロテアーゼを用いた前処理方法を考案し評価を行った。臨床から提出された血液培養ボトルのうち，陽性を示した676件を用いた。前処理をした材料を質量分析装置VITEK MS（ビオメリュージャパン株式会社）を用いて直接同定を行った。グラム陽性菌の同定率は，属レベルで99.5%，種レベルで98.4%，グラム陰性菌の同定率は，属・種レベル共に99.0%，真菌は，属・種レベル共に80%，全属レベルでは，99.1%，全種レベルでは，98.5%であり，既報と比較して同等以上の結果が得られた。今回我々が考案した前処理方法は，特別な機器や試薬を必要とせず，安価であり，かつ洗浄操作だけで前処理ができる簡便な方法である。さらに第1ステップで完了する場合は，アルコールやギ酸処理を行わないため，従来の自動同定機器や簡易同定キットなどにも応用できる汎用性の高い方法であると考えられた。
日本集中治療医学会の敗血症の診療指針（日本版敗血症診療ガイドライン）では，「重症敗血症／敗血症性ショック診断後，1時間以内に抗菌薬投与を行うことは死亡リスク改善に寄与する可能性がある。」として，抗菌薬の早期投与を推奨している1)。敗血症は有効な抗菌薬治療がすぐに開始されなかった場合，急速に進行し重症化すれば敗血症性ショックを起こし致死率は高くなる。敗血症の死亡率は20%～30%，敗血症性ショックでは40%～60%と非常に高い2),3)と報告されていることからも，血液培養陽性結果を迅速に報告することは，臨床上非常に重要となる。血液培養陽性ボトルから直接同定が可能となれば，早期診断，治療に貢献することができるため，直接同定または迅速同定を目的とした前処理方法や市販の前処理キットを含め種々検討4)～9)されている。しかし，いずれの方法も同定率は60%～90%程度で，特にグラム陽性菌の同定率は低く，前処理にかかる時間やコストなど十分満足できる方法はない。今回我々は，質量分析装置で直接同定を行う際，ヘモグロビンなどの生体由来蛋白質の存在が同定結果に影響しているのでないかと考え，これらを除去する目的でセミアルカリプロテアーゼ酵素剤のスプタザイム（極東製薬工業株式会社）を用いて洗浄を行う前処理方法を考案し，評価を行ったので報告する。
2015年6月から2017年8月までに当院各診療科から提出された血液培養陽性ボトルのうち，グラム染色で複数菌を認めたもの，質量分析装置VITEK MS（ビオメリュージャパン株式会社；BMJ）にデータベースがなかった菌種を除く676株を対象とした。血液培養ボトルは，バクテアラート3D（BMJ）専用ボトルFA Plus，FN Plus，PF Plusを使用した。同定率は，サブカルチャーで得られた単独コロニーをVITEK MSで測定し，得られた結果と比較した。
2． 方法〈第1ステップ〉
1）血液培養陽性ボトルをよく混和し，ボトル内の血液培養液5 mLを分離剤入り採血管に採取し，1,500 × g 5分間遠心後，上清をデカンテーションにて除去した。
2）上清を除去した採血管に，ディスポーザブルピペットで滅菌精製水を約1 mL入れ，ボルテックスミキサーでよく撹拌し，ペレットを再浮遊させた。
3）全量を1.5 mLチューブに回収し，高速遠心機で15,000 × g 1分間遠心した。
4）上清をディスポーザブルピペットで除去した。
5）ディスポーザブルピペットで，セミアルカリプロテアーゼ酵素剤（スプタザイム）を500 μL～1,000 μL入れ，ボルテックスミキサーでよく撹拌し，高速遠心機で15,000 × g 1分間遠心した。
6）上清をディスポーザブルピペットで除去した。
7）ディスポーザブルピペットで滅菌精製水を約1 mL入れ，ボルテックスミキサーでよく撹拌し，高速遠心機で15,000 × g 1分間遠心した。
8）上清をディスポーザブルピペットで除去した。
*）このときペレットが，目視にて赤色を呈していれば，手順5）のスプタザイム処理からやり直した。またムコイドタイプの菌種は，滅菌精製水で洗浄後はペレットが膨張するため，上清を除去後は再度，スプタザイムを加えてボルテックスミキサーでよく撹拌し，高速遠心機で15,000 × g 3分間遠心した。ディスポーザブルピペットで上清を除去後，ペレットを回収した（Figure 1）。
滅菌精製水とスプタザイム処理後のベレットの比較
左：ムコイドタイプの細菌は滅菌精製水で洗浄後のペレットが膨張する。右：上清を捨て再度スプタザイム処理を行い15,000 × g 3分間遠心後のペレット。
9）目視にて白色を呈したペレットを，マイクロピペットで少量（0.2 μL～0.5 μL）採取し，ターゲットスライドに薄く塗り広げ，乾燥後マトリクス試薬を加えたセルスメア法と，少量採取したペレットにMS-FA試薬（BMJ）を0.5 μL加えて混和し，乾燥後にマトリクス試薬を加えて測定したギ酸オンプレート法の2法を実施した。この第1ステップで結果が得られない場合，および溶血検体等でペレットが白色を呈さない場合は，次の第2ステップを実施した。
〈第2ステップ〉
1）第1ステップで残ったペレットに，70%ギ酸をペレットと等量（10 μL～50 μL）加え，マイクロピペットチップの先端でペレットをサンプルチューブの管壁に押しつけ，目視にて塊がなくなるまですり潰したあと，ボルテックスミキサーでよく攪拌した。
2）加えたギ酸と等量のアセトニトリルを加え，ボルテックスミキサーでよく攪拌し，15,000 × g 1分間遠心した。
*）このとき抽出液が茶褐色の場合，上清をディスポーザブルピペットで除去し，上清が目視にて透明になるまで，手順1），2）の抽出処理をやり直した。
3）マイクロピペットにて上清1 μLを採取し，乾燥後マトリクス試薬を加えて測定した抽出法と，抽出法実施後のペレットを少量ターゲットスライドに採取し，MS-FA試薬を加えよく混和し，乾燥後にマトリクス試薬を加えて測定した2法を実施した。
スプタザイムを用いて洗浄後に得られたペレットは，対象として滅菌精製水で3回洗浄後のペレットと比較すると，目視でも明らかに白くなったことが確認できた。さらにグラム染色を行い，顕微鏡下で比較した場合でも，明らかにスプタザイムで前処理した方が黄枠で囲まれたピンク色に染まる不純物の減少が確認された（Figure 2, 3）。
グラム陰性菌のグラム染色像 ×100（対物レンズ10×）
左：対象として滅菌精製水で3回洗浄したペレットと染色像。右：スプタザイムで洗浄処理したペレットと染色像。黄枠で囲まれたピンク色に染まる不純物の明らかな減少を認めた。
グラム陽性菌のグラム染色像 ×100（対物レンズ10×）
左：対象として滅菌精製水で3回洗浄したもの。右：スプタザイムによる洗浄を行ったもの。黄枠で囲まれたピンク色に染まる不純物の明らかな減少を認めた。
18属26種300株を測定した結果，属・種レベル共に99.0%（297/300）であった（Table 1）。
| 確定菌名 | 第1ステップ | 第2ステップ | ||
|---|---|---|---|---|
| 株数 | セルスメア法 | ギ酸オンプレート法 | （抽出処理） | |
| Fusobacterium nucleatum | 1 | 0 | 0 | |
| Leptotrichia buccalis | 1 | 0 | 0 | 0 |
| Bacteroides fragilis | 7 | 7 | 7 | |
| Bacteroides uniformis | 2 | 2 | 2 | |
| Parabacteroides distasonis | 1 | 0 | 1 | |
| Neisseria mucosa | 1 | 0 | 0 | 0 |
| Haemophilus influenzae | 3 | 3 | 2 | |
| Pseudomonas aeruginosa | 15 | 13 | 15 | |
| Aeromonas hydrophila/punctata（caviae） | 3 | 3 | 3 | |
| Aeromonas sobria/veronii | 1 | 0 | 0 | 1 |
| Achromobacter denitrificans/xylosoxidans | 1 | 1 | 1 | |
| Acinetobacter baumannii complex | 4 | 4 | 4 | |
| Acinetobacter radioresistens | 1 | 1 | 1 | |
| Proteus mirabilis | 3 | 3 | 3 | |
| Escherichia coli（ESBLs産生20株含む※） | 180 | 173 | 179 | |
| Klebsiella pneumoniae（ESBLs産生1株含む※） | 37 | 35 | 36 | |
| Klebsiella oxytoca | 8 | 8 | 8 | |
| Raoultella ornithinolytica | 1 | 0 | 1 | |
| Citrobacter freundii | 1 | 0 | 1 | |
| Citrobacter youngae | 1 | 1 | 0 | |
| Citrobacter braakii | 2 | 2 | 2 | |
| Citrobacter koseri | 3 | 2 | 2 | |
| Enterobacter aerogenes | 10 | 10 | 10 | |
| Enterobacter cloacae/asburiae | 6 | 4 | 4 | 2 |
| Serratia marcescens | 5 | 3 | 5 | |
| Salmonella group | 2 | 0 | 0 | 2 |
| 合計 | 300 | 275 | 287 | 5 |
グラム陰性菌同定率 属・種レベル99.0%
※ESBLs：基質特異性拡張型βラクタマーゼ（extended-spectrum β-lactamase）
19属51種371株を測定した結果，属レベルで99.5%（369/371），種レベルでは，98.4%（365/371）であった（Table 2）。
| 確定菌名 | 第1ステップ | 第2ステップ | ||
|---|---|---|---|---|
| 株数 | セルスメア法 | ギ酸オンプレート法 | （抽出処理） | |
| Streptococcus pyogenes | 2 | 1 | 1 | 1 |
| Streptococcus dysgalactiae | 14 | （△2） | （△3） | 12 |
| Streptococcus agalactiae | 7 | 1 | 6 | 1 |
| Streptococcus pneumoniae | 5 | 4 | 4 | 1 |
| Streptococcus anginosus | 5 | 0 | 1 | 4 |
| Streptococcus sanguinis | 2 | 1 | 0 | 1 |
| Streptococcus gordonii | 2 | 1 | 2 | |
| Streptococcus mitis/oralis | 3 | 2 | 3 | |
| Streptococcus constellatus | 1 | 1 | 1 | |
| Streptococcus vestibularis | 1 | 0 | 1 | |
| Streptococcus gallolyticus ssp. pasteurianus | 3 | 1 | 2 | 1 |
| Streptococcus infantarius ssp. coli（S. lutetiensis） | 1 | 0 | 1 | |
| Streptococcus intermedius | 1 | 0 | 0 | 1 |
| Globicatella sanguinis | 1 | 1 | 0 | |
| Aerococcus urinae | 2 | 0 | 1 | 1 |
| Enterococcus faecalis | 25 | 19 | 25 | |
| Enterococcus casseliflavus | 2 | 2 | 2 | |
| Enterococcus gallinarum | 4 | 4 | 4 | |
| Enterococcus faecium | 8 | 1 | 7 | 1 |
| Enterococcus avium | 1 | 1 | 1 | |
| Staphylococcus aureus（MRSA19株含む※） | 51 | 37 | 50 | |
| Staphylococcus epidermidis | 68 | 38 | 62 | 6 |
| Staphylococcus capitis | 29 | 22 | 27 | 1 |
| Staphylococcus caprae | 25 | 10 | 19 | 6 |
| Staphylococcus hominis | 44 | 32 | 40 | 4 |
| Staphylococcus haemolyticus | 7 | 4（□1） | 6 | |
| Staphylococcus warneri | 3 | 1 | 2 | |
| Staphylococcus lugdunensis | 2 | 1 | 2 | |
| Staphylococcus simulans | 3 | 2 | 3 | |
| Staphylococcus pettenkoferi | 3 | 0 | 0 | 3 |
| Micrococcus luteus | 1 | 0 | 0 | 1 |
| Listeria monocytogenes | 1 | 1 | 1 | |
| Corynebacterium jeikeium | 1 | 0 | 0 | |
| Corynebacterium glucuronolyticum | 1 | 0 | 0 | 1 |
| Corynebacterium striatum | 4 | 2 | 3 | 1 |
| Corynebacterium coyleae | 2 | 1 | 0 | 1 |
| Bacillus cereus group | 10 | 5 | 7 | 3 |
| Bacillus subtilis/amyloliquefaciens/vallismortis | 2 | 2 | 1 | |
| Bacillus megaterium | 1 | 1 | 1 | |
| Paenibacillus spp. | 2 | 1 | 2 | |
| Paenibacillus pabuli | 1 | 1 | 1 | |
| Brevibacterium luteolum | 2 | 1 | 2 | |
| Lactobacillus paracasei | 1 | 0 | 0 | 1 |
| Leptotrichia buccalis | 1 | 1 | 0 | |
| Arthrobacter cumminsii | 1 | 1 | 1 | |
| Peptoniphilus asaccharolyticus | 1 | 1 | 1 | |
| Parvimonas micra | 1 | 1 | 1 | |
| Clostridium perfringens | 3 | 3 | 1 | |
| Clostridium sordellii | 2 | 0 | 1 | 1 |
| Propionibacterium acnes | 7 | 3 | 5 | 2 |
| Eggerthella lenta | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 合 計 | 371 | 217 | 301 | 56 |
グラム陽性菌同定率 属レベル99.5%・種レベル98.4%
△：Streptococcus pyogenesと誤同定
□：Staphylococcus capraeと誤同定
※MRSA: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
2属4菌種5株を測定した結果，属・種レベル共に80%（4/5）であった（Table 3）。
| 確定菌名 | 第1ステップ | 第2ステップ | ||
|---|---|---|---|---|
| 株数 | セルスメア法 | ギ酸オンプレート法 | （抽出処理） | |
| Candida parapsilosis | 1 | * | 0 | 1 |
| Candida glabrata | 2 | * | 2 | |
| Candida albicans | 1 | * | 0 | 1 |
| Fusarium solani | 1 | * | 0 | 0 |
| 合 計 | 5 | 2 | 2 | |
真菌同定率 属・種レベル80%
*：実施せず
グラム陰性菌で同定できなかったFusobacterium nucleatum，Leptotrichia buccalis，Neisseria mucosaの3株は，いずれもグラム染色で確認したところ十数視野に1個と極めて菌数が少なかった。また，グラム陽性菌で誤同定となったのは，Streptococcus dysgalactiaがStreptococcus pyogenesに同定されたケースが3株，Staphylococcus haemolyticusをStaphylococcus capreaeと同定されたケースが1株の合計4株あったが，いずれもボトル内の溶血が非常に強い検体で，第1ステップのみで行っていた時のデータであった。その後，完全溶血のボトルに対して第2ステップを実施するように手順を変更してからは，溶血の影響を受けずに種レベルまで同定可能となった。同定できなかったCorynebacterium jeikeiumとFusarium solaniは陰性菌の時と同様に菌数が極めて少なかった。Christnerら10)が血液培養から正確に同定するためには106 CFU/mL以上の菌数が必要であると報告しているように，当院の前処理方法で同定できなかったケースは，いずれも菌数が極めて少なかったことが原因であると考えられた。後日，ボトル陽性直後，グラム染色で数視野に1 cluster程度しか認められずに同定できなかったStaphylococcus hominisで検証したところ，第1ステップの操作1を数回繰り返し集菌した場合，同定可能なペレットが得られた。また，同ボトルを翌日までフラン器で延長培養し，通常の手順で処理を行った場合も，同定可能な菌量のペレットが得られた（Figure 4）。
陽性直後の培養液と一夜フラン器で延長培養した培養液のグラム染色像
左：培養陽性直後のグラム染色像は数視野に1 clusterを認める程度であった。×1,000（油浸レンズ100×）
右：一夜フラン器で延長培養した後のグラム染色像は毎視野に複数のclusterを認めた。
第2ステップまで実施し同定できたケースは，グラム陰性菌が1.7%（5/300）に対し，グラム陽性菌は，15.1%（56/371）とグラム陰性菌に比べ，陽性菌では第2ステップが必要となるケースが多かった。特に抽出液よりも抽出後のペレットからの同定率が高い傾向であった。この結果から考えられることは，質量分析装置は微生物のリボゾーム蛋白質を主に測定していることから，グラム陰性菌に比べグラム陽性菌や真菌などはペプチドグリカン層が厚いため，セルスメア法やギ酸オンプレート法では十分なリボゾーム蛋白質を抽出できなかった可能性がある。一方，ギ酸・アセトニトリル抽出操作を加えることで細胞壁が壊れやくすなったことが原因で，第2ステップのペレットからの同定率がよくなったのではないかと考えられた。
また，第1ステップ処理で結果が得られたペレットを用いVITEK2ブルー（BMJ）でグラム陰性菌と陽性菌の代表的な数菌種を追試同定した結果と，VITEK MS（BMJ）にて同定した結果とを比較したところEscherichia coli 100%（100/100），Klebsiella pneumoniae 96%（24/25），Klebsiella oxytoca 100%（4/4），Pseudomonas aeruginosa 100%（7/7），で3.5時間から5時間で結果が得られ，グラム陽性菌ではStaphylococcus aureus 100%（25/25），Staphylococcus epidermidis 100%（29/29），Staphylococcus hominis 100%（18/18）で3.75時間から8時間で同定結果が得られたことから，従来の自動同定機器や簡易同定キットにデータベースがあれば高い同定率が得られることが示唆された。
近年，フィルター方式のVITEK MS血液培養キット（BMJ）が上市されているが，その同定率はグラム陰性菌95.9%（47/49），グラム陽性菌97.9% （46/47），酵母様真菌75%（3/4），合計96%（96/100）と同定率に関して良好な成績であり，処理時間も約10分と短いことが利点である11)。しかし，専用の機材と試薬が必要であること，1検体あたりのランニングコストが高いこと（定価800円），また同時に複数検体を処理するには不向きであることが欠点として挙げられる。
一方，本研究の同定率はグラム陰性菌で99.0%（297/300），グラム陽性菌で98.4%（365/371），真菌80%（4/5），合計98.5%（666/676）であり，1検体あたりのランニングコストも100円程度で実施することができ，複数検体にも対応可能な簡便な方法と思われた。また第1ステップのみの場合は，アルコールやギ酸処理を行わないため，質量分析装置を導入していない施設においても，従来の自動同定機器での同定および感受性検査，また簡易同定キットなどにも使用できる汎用性の高い前処理方法であると考えられた。
なお本論文の要旨は，第65回日本臨床医学検査学会（2016年9月，神戸）にて発表した。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
