体腔液塗抹染色標本の観察部位が細胞分類結果に及ぼす影響については，これまでほとんど議論されていない。今回われわれは，塗抹染色法による体腔液細胞分類の標準化に向けて，下記の検討を行った。対象は，体腔液100例（胸水66件，腹水34件）で，塗抹染色法で作製した標本中の5ヶ所（①および③：辺縁部位，②：中心部位，④および⑤：引き終わり周辺部位）の各々にみられた100個の細胞を，「リンパ球」，「多形核球」，「その他の細胞」に分類し，それらの出現の割合を計測した。次に，その結果と計算盤法で求めた細胞数の割合との相関を検討した。「リンパ球」の中央値は，塗抹標本②で最も多く，②と③，②と④，②と⑤の間に有意差を認めた（p < 0.01）。「その他の細胞」は，⑤で最も多く，①と⑤，②と⑤，③と⑤の間に有意差を認めた（p < 0.01）。計算盤法と塗抹染色法との相関係数は，「リンパ球」，「多形核球」，「その他の細胞」のいずれも観察部位①～⑤の平均が一番高かった。一般的に塗抹染色法では，大型の細胞が標本の引き終わりに，小型の細胞が中心に多くみられるが，この偏りは観察部位を変えて複数ヶ所の細胞を計測し，平均値を得ることでほぼ解消した。従って，塗抹染色法による細胞分類のために，辺縁部位の2ヶ所，中心部位の1ヶ所，引き終わり周辺部位の2ヶ所の計5ヶ所でそれぞれ100個，合計500個について細胞を分類するという観察方法を，標準化に向けた提案としたい。
体腔液の貯留は，循環障害，炎症，悪性腫瘍の浸潤や播種，などさまざまな要因で引き起こされる。そのため，貯留した要因を明らかにし，適切な治療を行うために，体腔液が採取され検査が行われる。一般的には微生物学的検査，細胞診検査，一般性状検査，細胞分類などの検査が施行されるが，そのなかでも細胞分類は体腔液中に出現する細胞を的確に分類し，主体を占める細胞の種類を明らかにすることで，急性炎症と慢性炎症の鑑別や結核などの疾患を推定する重要な検査法として位置づけられている1)。一般的には，細胞分類の方法としてはサムソン液やチュルク液を用いた染色を施し，計算盤を用いて観察する方法（以下，計算盤法）とウェッジ法で塗抹標本を作製し，メイギムザ（May Giemsa）染色を施して観察する方法（以下，塗抹染色法）などが行われている。前者は，検体に直接染色液を加え，その一部を計算盤に入れると速やかに顕微鏡で観察できるため，迅速性に優れているが，細胞質や核所見などの詳細な観察には向いていない。一方，後者は染色には数十分の時間はかかるものの，核と細胞質が鮮明に染め分けられ，特に血液細胞の観察には極めて優れた方法である。
鏡検に際しては，計算盤法では，検体に染色液を加えて充分攪拌し，その一部を直接計算盤に入れるために計算盤上の観察部位によって細胞の分布に大きな差はみられない。これに反し，塗抹染色法では，引きガラスを使用して検体を塗抹するため，大型の細胞は標本の引き終わりや辺縁部位に2)，小型の細胞は中心部位により多く塗抹される。しかし，大小さまざまな大きさの異なる細胞が出現する体腔液の細胞分類について，塗抹染色法を用いる場合の観察方法に関する議論はこれまでほとんどなされていない。そこで，今回われわれは塗抹染色法による体腔液細胞分類の標準化に向けて，塗抹染色標本の観察部位が細胞分類結果に及ぼす影響について検討を行った。
検討対象には，平成28年1月～5月までの期間に諏訪中央病院，獨協医科大学越谷病院で提出された体腔液100症例（胸水66件，腹水34件）を用いた。
塗抹染色法には，試薬として，May-Grünwald染色液（武藤化学，東京），Giemsa染色液（武藤化学，東京），1/15 mol/Lリン酸緩衝液（pH 6.4）（武藤化学，東京）を使用した。計算盤法には，サムソン液（武藤化学，東京）を用い，Fuchs-Rosenthal計算盤（C-Chip, Nano EnTek）を使用した。使用試薬はすべて同一ロットで実施した。
塗抹染色法に関しては，染色法や標本作製法等は一般検査技術教本3)に準じて実施した。すなわち，検体10 mLを2,000 Gで5分間遠心後上清を除去し，少量（10 μL以下）の沈渣をスライドグラスに積載し，引きガラスを用いて引き終わりができるように検体を塗抹した。出現細胞の分類は，塗抹染色法により作製した標本の引き始めから中間付近までの上縁と下縁のやや内側の部位（①および③：辺縁部位），中心に近い部位（②：中心部位），引き終わりよりもやや手前の部位（④および⑤：引き終わり周辺部位）（Figure 1）について赤血球を除いた細胞をそれぞれ100個カウントした。但し，集塊はそれを構成する細胞1つにつき1カウントとした。細胞のカウントは，体腔液検査の経験が豊富な4名の技師で行った。細胞分類法は，リンパ球，多形核球，その他の細胞の3分類法とした。多形核球には好中球，好酸球，好塩基球，その他の細胞には単球，組織球，反応性中皮細胞，悪性細胞などが含まれる。観察部位①～⑤におけるリンパ球，多形核球，その他の細胞の出現割合について，統計的手法を用いて比較検討を行った。統計解析ソフトはIBM SPSS Statisticsを使用し，Wilcoxon検定を行った。有意差はp value < 0.01とした。
塗抹染色標本の模式図と観察部位
次に，体腔液中に出現している細胞については，一般検査技術教本3)に準じて計算盤法により算定を行った。検体は，生理食塩水で予め3倍に希釈し，その希釈検体180 μLにサムソン液20 μLを加えてよく撹拌した。その検体の一部をピペットで採取し，Fuchs-Rosenthal計算盤に流し込み，湿潤箱に入れて1～2分静置した後，細胞を観察した。細胞分類は，塗抹染色法による検討と同様にリンパ球，多形核球，その他の細胞の3分類法を行い，それぞれの細胞の割合を算出し，それらの値について，塗抹染色法により得られた同じ種類の細胞の値と比較検討を行った。解析は，散布図を作成し，回帰式と相関係数を求めた。
なお，本研究は諏訪中央病院および獨協医科大学越谷病院倫理委員会の承認を得て行った（27諏訪中央－倫理第9号）。
Figure 1に示した標本の5ヶ所で細胞の分布を比較検討した。多形核球，リンパ球，その他の細胞に関する観察部位別の最大値，最小値，平均値，中央値，標準偏差についてTable 1に示す。多形核球の中央値をみると，②で7.5%と最も多く，次に③で6.5%，①で5.0%，④で4.0%，⑤で4.0%の順であり，②と④および②と⑤の間に有意差を認めた（Figure 2）。リンパ球の中央値をみると，②で70.0%と最も多く，次に①で60.5%，③で58.0%，⑤で50.5%，④で48.5%の順であり，①と④，①と⑤，②と③，②と④，②と⑤，③と④および③と⑤の間に有意差を認めた（Figure 3）。その他の細胞の中央値をみると，⑤で22.0%と最も多く，次に④で21.0%，①で13.5%，③で12.0%，②で7.5%の順であり，①と②，①と④，①と⑤，②と③，②と④，②と⑤，③と④および③と⑤の間に有意差を認めた（Figure 4）。
| 観察部位① | 観察部位② | 観察部位③ | 観察部位④ | 観察部位⑤ | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 多形核球 | 最大値（%） | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 最小値（%） | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | |
| 平均値（%） | 22.7 | 24.6 | 22.9 | 20.7 | 21.2 | |
| 中央値（%） | 5.0 | 7.5 | 6.5 | 4.0 | 4.0 | |
| 標準偏差（%） | 31.6 | 31.6 | 30.9 | 30.9 | 31.1 | |
| リンパ球 | 最大値（%） | 99.0 | 100.0 | 100.0 | 99.0 | 100.0 |
| 最小値（%） | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | |
| 平均値（%） | 55.3 | 59.0 | 53.1 | 48.8 | 48.8 | |
| 中央値（%） | 60.5 | 70.0 | 58.0 | 48.5 | 50.5 | |
| 標準偏差（%） | 32.6 | 33.2 | 32.5 | 32.5 | 32.8 | |
| その他の細胞 | 最大値（%） | 93.0 | 88.0 | 92.0 | 93.0 | 90.0 |
| 最小値（%） | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | |
| 平均値（%） | 21.9 | 16.7 | 24.0 | 30.5 | 30.1 | |
| 中央値（%） | 13.5 | 7.5 | 12.0 | 21.0 | 22.0 | |
| 標準偏差（%） | 22.1 | 19.2 | 24.9 | 28.2 | 27.9 | |
塗抹染色標本の観察部位別に比較した多形核球の分布
塗抹染色標本の観察部位別に比較したリンパ球の分布
塗抹染色標本の観察部位別に比較したその他の細胞の分布
計算盤法による細胞数は1 μL当り最低14個，最高339,200個，中央値は693個であった。
塗抹染色法と計算盤法の細胞分布について相関性をみると，多形核球は，塗抹染色標本の観察部位による大きな差はなく，計算盤法と概ね良好な相関を示した（Figure 5）。塗抹染色標本の観察部位別に計算盤法との回帰式と相関係数をみると，観察部位①との関連は，y = 1.002x − 0.8697，r = 0.9732で，観察部位②との関連は，y = 0.9901x + 1.2518，r = 0.9636で，観察部位③との関連は，y = 0.9755x − 0.0847，r = 0.969であった。観察部位④との関連は，y = 0.9574x − 1.8175，r = 0.953で，観察部位⑤との関連は，y = 0.9698x − 1.6717，r = 0.959で，観察部位①～⑤の平均との関連は，y = 0.9811x − 0.74，r = 0.9753であった。リンパ球は，塗抹染色標本の観察部位②は，計算盤法よりも高値を示す症例が多く認められた。一方，塗抹染色標本の観察部位④および⑤は，計算盤法よりも低値を示す症例が多く認められた（Figure 6）。塗抹染色標本の観察部位別に計算盤法との回帰式と相関係数をみると，観察部位①との関連は，y = 1.0405x − 0.2053，r = 0.937で，観察部位②との関連は，y = 1.0544x + 2.6636，r = 0.9306で，観察部位③との関連は，y = 1.0155x − 1.0734，r = 0.916であった。観察部位④との関連は，y = 1.0004x − 4.6265，r = 0.9028で，観察部位⑤との関連は，y = 1.0069x − 4.9101，r = 0.8999で，観察部位①～⑤の平均との関連は，y = 1.0235x − 1.6479，r = 0.948であった。その他の細胞は，塗抹染色標本の観察部位②は，計算盤法よりも低値を示す症例が多く認められた。一方，塗抹染色標本の観察部位④および⑤は，計算盤法よりも高値を示す症例が多く認められた（Figure 7）。塗抹染色標本の観察部位別に計算盤法との回帰式と相関係数をみると，観察部位①との関連は，y = 0.9203x − 0.4558，r = 0.8399で，観察部位②との関連は，y = 0.7896x + 1.7659，r = 0.8279で，観察部位③との関連は，y = 1.0194x + 0.196，r = 0.825であった。観察部位④との関連は，y = 1.1632x + 3.3524，r = 0.8314で，観察部位⑤との関連は，y = 1.1616x − 3.0214，r = 0.8395で，観察部位①～⑤の平均との関連は，y = 1.0119x + 1.032，r = 0.885であった。
多形核球における塗抹染色標本の観察部位別に比較した計算盤法との相関
リンパ球における塗抹染色標本の観察部位別に比較した計算盤法との相関
赤い円で囲んだ部分は，計算盤法よりも塗抹染色法の方が高い割合を示した症例群。
黒い円で囲んだ部分は，塗抹染色法よりも計算盤法の方が高い割合を示した症例群。
その他の細胞における塗抹染色標本の観察部位別に比較した計算盤法との相関
赤い円で囲んだ部分は，計算盤法よりも塗抹染色法の方が高い割合を示した症例群。
黒い円で囲んだ部分は，塗抹染色法よりも計算盤法の方が高い割合を示した症例群。
相関係数はリンパ球，多形核球，その他の細胞のいずれにおいても観察部位①～⑤の平均が一番高かった。
塗抹染色法は，スライドガラスに少量の検体を滴下し，引きガラスで検体を一定の速度でスライドさせて塗抹し，冷風で急速に乾燥させる。塗抹標本にMay Giemsa染色を施すと，細胞の核，細胞質を明瞭に染め分けることができる。そのため，形態の観察や細胞分類に極めて優れた方法として末梢血をはじめ，骨髄，体腔液などで広く用いられている。末梢血では，塗抹染色法で標本中の白血球をより適切に分類するための最も鏡検に適する部位は，背景にみられる赤血球が密で均一に分布し，2個の重なりが50%以内の範囲とされている4)。この範囲では，末梢血に出現する白血球の大きさが比較的均一なため，観察部位による著しい偏りはなく，概ね血液中に浮遊している白血球の割合を反映する。しかし，体腔液には白血球に加えて，組織球，反応性中皮細胞，各種悪性細胞が出現するため，標本の中には長径が10 μm程度のリンパ球から100 μmを超える組織球や悪性細胞まで様々の大きさのものが混在する。特に，悪性細胞をはじめとする大型細胞は，塗抹することにより引き終わりや辺縁の周囲に分布し易いため1)，標本中の観察部位によっては細胞の分布に相当の偏りが生じることになる。
今回の検討では，標本の観察部位を，辺縁部位，中心部位，引き終わり周辺部位に分けて細胞の分布を比較しているが，中心部ではリンパ球が，引き終わり周辺部ではその他の細胞が多くみられている（p < 0.01）。この所見は，その他の細胞に含まれる組織球，反応性中皮細胞，各種悪性細胞などからなる大型細胞が引き終わりに集まり，リンパ球などの小型細胞が中心に集まる傾向にあり，これまで指摘されていること2)を裏付けている。また，計算盤法により細胞分類した値と塗抹染色法の観察部位ごとに細胞分類した値を散布図として比較すると，塗抹染色法の中心部位（観察部位②）では小型細胞であるリンパ球は計算盤法よりも多い集団が，大型細胞であるその他の細胞は計算盤法よりも少ない集団が認められている。逆に，塗抹染色法の引き終わり周辺部位（観察部位④および⑤）ではリンパ球は計算盤法よりも少ない集団を認め，その他の細胞は計算盤法よりも多い集団として認められている。しかし，このような観察部位による細胞分布のばらつきは，塗抹染色法において辺縁部位，中心部位，引き終わり周辺部位の5ヶ所の観察部位からそれぞれ100個の細胞をカウントして得られた値を平均したものと計算盤法の値との比較では，リンパ球とその他の細胞ともに計算盤法との乖離を示す症例は減少し，相関係数も上昇している。また，このような観察方法で得られた値は，体腔液に出現するリンパ球は，結核性胸膜炎5),6)，好中球は，肺炎随伴性胸水や細菌性腹膜炎など7),8)，白血球の種類と疾患とは密接な関連が知られているが，リンパ球，多形核球ともに計算盤法と良好な相関を示すことからも，より病態を反映するデータとして臨床に寄与するものと考えられる。従って，塗抹染色法で体腔液の標本を作製し細胞分類を行う場合は，細胞分布のばらつきを考慮し，上述した辺縁部位の2ヶ所，中心部位の1ヶ所，引き終わり周辺部位の2ヶ所からそれぞれ100個ずつ，合計500個の細胞をカウントすることが精度の点からも重要であり，この観察方法を標準化へ向けた一つの提案としたい。
今回われわれが示した提案が体腔液細胞分類の標準化に向けた「たたき台」となり，将来的には自動化も視野に入れたさらなる精度の向上を目指した検討につながることを期待する。
体腔液細胞分類の塗抹染色法を用いた観察方法に関して検討を行った。塗抹染色法は，大きな細胞が標本の引き終わりに，小さな細胞が標本の中心に多くみられるが，この偏りは観察部位を変えて複数ヶ所から細胞をカウントすることで改善できた。塗抹染色法を用いて体腔液細胞分類を行う場合は，辺縁部位の2ヶ所，中心部位の1ヶ所，引き終わり周辺部位の2ヶ所からそれぞれ100個ずつ，合計500個の細胞をカウントする観察方法を標準化へ向けた一つの提案としたい。
本論文の要旨は，第65回日本医学検査学会（2016年，神戸）で発表し，一般社団法人日本臨床衛生検査技師会より平成29年度日臨技学術奨励賞優秀演題賞の評価を頂いた。
| 日本臨床衛生検査技師会 穿刺液標準化ワーキンググループ | ||||
| 委員長 | 保科ひづる | 組合立諏訪中央病院技術部検査科 | ||
| 委員 | 羽原 利幸 | 公立学校共済組合中国中央病院臨床検査科 | 日本臨床衛生検査技師会 | |
| 小関 紀之 | 獨協医科大学埼玉医療センター臨床検査部 | 小澤 優 | 学校法人京都保健衛生専門学校臨床検査学科 | |
| 内田 一豊 | 豊橋市民病院中央臨床検査室 | 岡田 茂治 | 埼玉県立がんセンター検査技術部 | |
稿を終えるにあたり，ご指導いただいた岡山労災病院病理診断科 園部宏先生に深謝いたします。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
