プロトロンビン凍結乾燥試薬調整時の個人差と液状試薬コアグピア^® PT-Liquidの基礎的検討

Abstract

プロトロンビン凍結乾燥試薬コアグピア^® PT-N（PT-N）を調整する際の個人差と，液状PT測定試薬であるコアグピア^® PT-Liquid（PT-L）の基礎的検討を行った。ホールピペット，マイクロピペットのいずれにおいても，ピペットで試薬調整し測定した場合には技師毎の測定値に有意差が認められた。調整操作が不要なPT-Lの基礎的性能評価では，正確性，同時再現性，オンボード安定性，希釈直線性，検出限界については良好な結果が得られ，干渉物質の影響については，遊離型ビリルビン，抱合型ビリルビン，ヘモグロビン，乳びは，いずれにも最終濃度まで影響を認めず，ヘパリンはPT正常域では0.8 U/mLまで，PT異常域では1.0 U/mLまで影響を認めなかった。PT-LとPT-Nとの相関性は，PT活性%で回帰式 y = 0.95x + 0.58，相関係数r = 0.99と良好であった。コアグピア^® PT-Lは試薬調整に伴うエラーがないこと，調整に時間を要さずすぐに使えることなどからも利便性が高く臨床への貢献が期待される試薬であると考えられた。

Translated Abstract

We conducted a basic study of individual differences in the preparation of the prothrombin freeze-drying reagent Coagupia^® PT-N (PT-N) and the liquid PT measurement reagent Coagupia^® PT-Liquid (PT-L). For both whole pipettes and micropipettes, significant differences were observed in the measured values among medical technicians when reagents were adjusted and measured with a pipette. In the basic performance evaluation of PT-L, which does not require adjustment, good results were obtained for accuracy, simultaneous reproducibility, onboard stability, dilution linearity, and detection limit, and the effects of interfering substances were determined. Bilirubin, conjugated bilirubin, hemoglobin, and chyle had no effect up to the final concentration, and heparin had no effect up to 0.8 U/mL within the normal PT range and 1.0 U/mL within the abnormal PT range. The correlation between PT-L and PT-N was good with a regression with y = 0.95x + 0.58 and a correlation coefficient r = 0.99 in% PT activity. Coagupia^® PT-L is considered to be a highly convenient reagent that is expected to contribute in clinical settings because there are no errors associated with reagent preparation, and it can be used immediately without requiring time for preparation.

I　 はじめに

プロトロンビン時間（PT）は，1935年Quickにより考案された血液凝固検査における最も基本的な外因系スクリーニング検査である。経口抗凝固療法のモニタリングや急性肝疾患の重症度の指標などとして測定されている^1)～3)。PT測定試薬は，組織因子とリン脂質の複合体である組織トロンボプラスチンとカルシウムイオンの混液であるが，溶液中での組織トロンボプラスチンの安定性が低いため試薬のほとんどが凍結乾燥試薬である。凍結乾燥試薬を使用する際には，①試薬を室温に戻す，②ホールピペットやマイクロピペットを用いて溶解する，③溶解後一定時間静置する，という工程が必要である。この溶解操作に伴うピペット類の取り扱い手技の個人差やヒューマンエラーが起こりえる。また，試薬が使える状態になるまでの時間が必要であることなどの問題点がある。特に，希釈に用いるホールピペットやマイクロピペットを正確に操作できるようになるには経験が必要なこと，普段ピペット操作を行わない当直者等には扱いにくいこと，使用するホールピペットやマイクロピペットがきちんと校正されているかどうかということ，なども問題となる。今回，凍結乾燥試薬であるコアグピア^® PT-N⁴⁾（積水メディカル株式会社，以下PT-N）を用いて凍結乾燥試薬調整手技による個人差を検討すると共に，溶解操作が不要な液状試薬であるコアグピア^® PT-Liquid⁵⁾（積水メディカル株式会社，以下PT-L）の基礎的検討を行ったので報告する。

II　 検討項目・方法

1． 凍結乾燥試薬溶解手技の個人差についての検討

凍結乾燥試薬であるPT-Nをホールピペットとマイクロピペットを用いて溶解調整し，同一の検体を測定，その測定値の平均値，標準偏差（SD）を算出しt検定を行った。

1） ホールピペットを用いた個人差の検討

日常的にピペット操作を行う血液担当者2名（A・G），業務で検体検査を行わない技師5名（B・C・D・E・F）が，それぞれホールピペットを用いてPT-Nを溶解調整し，循環器内科以外から依頼された患者検体より無作為に血漿を集めたプール血漿をPT正常域（PT活性90%付近，以下正常域PP）とした。また，循環器内科から依頼された患者検体より無作為に血漿を集めたプール血漿をPT異常域（PT活性35%付近，以下異常域PP）とし，これらを試料として各濃度10回連続測定して，技師Aの測定結果に対して各技師の測定結果を比較した。

2） マイクロピペットを用いた個人差の検討

日常的にピペット操作を行う血液担当者4名（H・I・J・K）が，それぞれマイクロピペットを用いてPT-Nを溶解調整し，PT活性110%付近のコアグトロールIX（正常域，シスメックス株式会社⁶⁾，以下IX）およびPT活性50%付近のコアグトロールIIX（異常域，シスメックス株式会社⁷⁾，以下IIX）を試料として各濃度10回連続測定して，技師Gの測定結果に対して各技師の測定結果を比較した。なお，今回の検討は東京慈恵会医科大学倫理委員会で承認された「受付番号26-348（7854），臨床検査を終了した検体（残余検体）の精度管理，検討，教育のための使用について」に則って行った。

2． コアグピア^® PT-Liquidの基礎的検討

1） 対象

試料は2濃度（正常域および異常域）の専用コントロールであるコアグピア^®用コントロールP-N（積水メディカル株式会社⁸⁾，以下正常域P-N，異常域P-N），2濃度のプール血漿と検査依頼によりPTを測定し，室温保存していた60件の凝固検査用3.2%クエン酸ナトリウム加血漿残余検体を用いた。また，本検討に用いる検体などは凝固検査検体取扱いに関するコンセンサス⁹⁾に従い適切に取り扱った。

2） 方法

検討試薬は PT-L，対照試薬はPT-Nを使用し，血液凝固自動分析装置CP3000^TM（積水メディカル株式会社）を用いてPTを測定した。

3） 検討項目

基礎的性能評価のため次の7項目について検討した。

① 正確性

正常域P-N，異常域P-Nを試料として各濃度3回連続測定し，表示値に対する正確性を算出した。

② 同時再現性

正常域P-N，異常域P-Nをそれぞれ10回連続測定し，得られた測定値から平均値，標準偏差（SD）および変動係数（CV）を算出した。

③ オンボード安定性

測定開始日にキャリブレーションを行い，試薬を機器保冷庫内で開封後開栓した状態で保管し正常域P-N，異常域P-Nを用いて10日間連続測定した。

④ 希釈直線性

生理食塩水を用いてPT活性130%以上の検体の11段階希釈系列を調整し，各濃度を2回測定した。

⑤ 検出限界

生理食塩水を用いてPT低活性検体の11段階希釈系列を調整し，各濃度を10回測定し，平均値 ± 2.6SD法で判定した。

⑥ 干渉物質の影響

正常域PPおよび異常域PPをベース試料として，干渉チェックAプラス（シスメックス株式会社）とヘパリンナトリウム（以下，ヘパリン）を添加した試料を調整し，干渉物質を添加していない0濃度試料を含めた各試料を2回測定し，0濃度試料に対する相対比が80～120%となる添加濃度の最大値を干渉物質による影響を認めない濃度として判定した。

⑦ 現行試薬との相関

患者試料60件を検討試薬PT-Lと対照試薬PT-Nで測定し，相関係数と回帰式を算出した。

III　 結果

1． 凍結乾燥試薬溶解手技の個人差についての検討（Figure 1）

Figure 1 ホールピペットを用いた個人差の検討

ホールピペットを用いてPT-Nを溶解し同一の検体を測定した。

1） ホールピペットを用いた個人差の検討

日常的にピペット操作を行うA・Gと行わないB・C・D・E・Fが溶解した試薬を用いてPTを測定して比較検討した結果，正常域の検体において，AとBの溶解した試薬の測定値には誤差は認められないが，C・D・E・F・Gが溶解した試薬の測定値では，Aと有意差を認めた。

例えば，Aが溶解した試薬の測定値が117.4%に対し，Cが溶解した試薬の測定値は106.9%で10.5ポイント低値であった。一方，Aと同様日常的にピペット操作を行うGが溶解した試薬の測定値は121.2%であり，Aとは3.8ポイントの有意な相違が認められた。異常域検体では，日常的にピペット操作を行っているAとGが溶解した試薬の測定値はそれぞれ31.6%と32.1%で0.5ポイントの差による有意差が認められた。日常業務でピペット操作を行わないB・C・D・E・FのうちEが溶解した試薬の測定値は31.7%でありAの31.6%と同程度となり有意差は認められなかった。しかし，他のB・C・D・Fの溶解した試薬では測定値のばらつきが大きくAと有意差が認められた。

2） マイクロピペットを用いた個人差の検討（Figure 2）

Figure 2 マイクロピペットを用いた血液検査担当者間の個人差の検討

各技師がマイクロピペットを用いてPT-Nを溶解し同一の検体を測定した。網掛けは当院精度管理許容範囲±1SDを表す。

日常的にピペット操作を行う血液検査担当者4名（H・I・J・K）が溶解した試薬について正常域の検体を用いてPTを測定した。その結果，H・I・Kが溶解した試薬の測定値はそれぞれ113.3%，112.5%，114.0%であり有意差は認められなかった。しかし，Jが調整した測定値は110.8%であり，H・I・Kと比較して低活性であり有意差を認めた。

異常域検体では，H・I・K が溶解した試薬の測定値はそれぞれ48.9%，48.4%，48.9%となり有意差は認められなかった。しかし，Jが溶解した試薬の測定値は46.8%と低活性であり有意差を認めた。なお，このJの測定値は当院における精度管理の許容管理幅内ではあった。

2． PT-Lの基礎的検討

前述の検討で明確になったとおり，凍結乾燥試薬の場合は試薬調整の段階で個人差が生じるため，測定値に影響を及ぼす可能性がある。そのため，試薬調整が不要な液状試薬であるPT-Lの基本的性能を評価した。その結果を①〜⑦に示す。

① 正確性（Table 1）

Table 1  正確性

試料	正常域P-N			異常域P-N
表示値（活性%）	95			37
測定値（活性%）	94.9	93.6	96.2	36.1	35.9	37.5
正確性%	99.9	98.5	101.3	97.6	97.0	101.4

表示値に対する正確性は，正常域P-Nでは98.5～101.3%，異常域P-Nでは97.0～101.4%と良好であった。

② 同時再現性（Table 2）

Table 2  同時再現性

試料	正常域P-N			異常域P-N
	活性%	秒	INR	活性%	秒	INR
Mean	93.0	12.4	1.04	36.8	21.8	1.89
SD	1.07	0.07	0.007	0.66	0.27	0.027
CV（%）	1.2	0.6	0.7	1.8	1.2	1.4
Max	94.5	12.6	1.06	38.0	22.3	1.94
Min	90.1	12.3	1.03	35.6	21.3	1.84
Range	4.4	0.3	0.03	2.4	1.0	0.10

正常域P-NのCVは1.2%（活性%），0.6（秒），0.7（INR），異常域P-NのCVは1.8%（活性%），1.2（秒），1.4（INR）と良好であった。

③ オンボード安定性（Figure 3, Table 3）

Figure 3 オンボード安定性

CP3000保冷庫内でPT-Lを開封後，開栓した状態で保管し10日間正常域P-N，異常域P-Nを測定した時の測定結果を示した。

Table 3  オンボード安定性

試料	正常域P-N			異常域P-N
	活性%	秒	INR	活性%	秒	INR
平均値	93.7	13.4	1.04	36.4	24.6	2.09
SD	1.67	0.13	0.013	0.82	0.40	0.039
CV（%）	1.8	1.0	1.3	2.3	1.6	1.9

10日間の正常域P-NのCVは1.8%（活性%），異常域P-NのCVは2.3%（活性%）と良好であった。

④ 希釈直線性（Figure 4, Table 4）

Figure 4 希釈直線性

生理食塩水を用いてPT活性130%以上の検体から11段階希釈系列を調整し，各濃度を2回測定した時の測定結果を示した。

Table 4  希釈直線性

希釈倍率	測定値（1回目/2回目）	平均値	理論値	相対比%
1/10	18.0/18.7	18.35	18.35	100.0
2/10	36.9/36.3	36.60	33.03	110.8
4/10	68.3/68.3	68.30	62.39	109.5
6/10	89.9/93.6	91.75	91.75	100.0
8/10	115.8/115.8	115.80	121.11	95.6
10/10	136.6/133.9	135.25	150.47	89.9

測定値が各濃度の期待値に対し ±20% 以内であることを希釈直線性ありと判断すると，

PT活性の最大値は154.2%であり，良好な希釈直線性が得られた。

⑤ 検出限界（Figure 5, Table 5）

Figure 5 検出限界

生理食塩水を用いてPT低活性検体から11段階希釈系列を調整，各濃度を10回測定し，2.6SD法で判定した時の結果を示した。

Table 5  検出限界

希釈倍率	2/10	3/10	4/10	5/10	10/10
測定値（活性%）	3.9	6.4	9.1	11.7	22.1
	3.9	6.4	9.0	11.4	23.0
	4.0	6.3	8.9	11.1	23.2
	4.0	6.5	8.9	11.7	23.1
	3.9	6.5	8.9	11.9	23.0
	4.1	6.5	9.1	11.5	23.2
	4.3	6.4	9.0	11.6	23.2
	4.0	6.3	8.9	11.5	22.8
	3.9	6.3	9.0	11.6	23.3
	4.0	6.5	8.8	11.6	23.3
平均	4.0	6.4	9.0	11.6	23.0
SD	0.12	0.08	0.09	0.20	0.34
2.6SD	0.31	0.22	0.24	0.53	0.88
CV（%）	3.0	1.3	1.0	1.7	1.5

CP3000^TM装置上で未検出とならず，同時再現性（10重測定のCVが5%以下）を満たす0濃度の平均値 + 2.6SD値と重ならないPT活性の希釈限界値は3.9%であった。

⑥ 干渉物質の影響（Figure 6）

Figure 6 干渉物質の影響

正常域PPおよび異常域PPをベース試料として，干渉チェックAプラス（シスメックス株式会社）とヘパリンNaを添加した測定試料を調整し，干渉物質を添加していない試料を含めた各試料を2回測定し，平均値を示した。

遊離型ビリルビンは20.0 mg/dL，抱合型ビリルビンは20.0 mg/dL，ヘモグロビンは500 mg/dL，乳びは3,000ホルマジン濁度まで測定値に影響を認めなかった。また，ヘパリンは正常域試料で添加によりPT活性が若干低下する傾向は見られたが，0.8 U/mLまでは0濃度試料に対する相対比は80%以上であり，有意な低下とは判断されなかった。

⑦ 現行試薬との相関（Figure 7）

Figure 7 現行試薬との相関

60件の患者試料を検討試薬PT-Lと対照試薬PT-Nで測定し，相関係数rと回帰式を算出した。

検討試薬PT-Lと対照試薬PT-Nの相関は，PT（活性%）では回帰式y = 0.95x + 0.58，相関係数r = 0.99（n = 60），PT（秒）ではy = 0.88x + 1.44，r = 0.99，PT（INR）ではy = 0.93x + 0.10，r = 0.99であった。

IV　 考察

PTは抗凝固薬の管理，肝機能の評価などに幅広く用いられており，その値は治療に直結するものである。測定値には正確性と精密性が求められ，試薬に関する検討はなされているが，凍結乾燥状態にある試薬を検査可能にするための溶解操作についてはほとんど検討されていない。試薬自体の基本性能が高くても，試薬の調整段階で誤差が生じると測定値に影響を及ぼすため，より誤差の少ない検査が可能となる試薬の導入が必要となる。今回我々は，凍結乾燥試薬の調整に関する個人差を検討するとともに，溶解が不要なPT-Lの基本性能について検討した。

従来用いられている凍結乾燥試薬のPT-Nを複数の検査技師がピペットを用いて調整し，同一検体のPTを測定した。その結果，ホールピペットおよびマイクロピペットを使用して調整した場合，正常域，異常域ともに調整者間の測定値に有意差が認められた。さらに日常的にピペットを扱う業務経験の豊富な血液検査担当者間においても測定値に有意差が生じていた。ピペッティングで個人間の誤差が生じた原因については，溶解液を添加する時のチップの角度，ホールピペットの使用方法，マイクロピペットの操作方法などが考えられる。今回の検討では対象数も少ないため今後の検討課題である。より正確な検査を行うために調整が不要な試薬を用いる必要があることを示唆している。

PT試薬の調整に関わる測定誤差を減らすため，溶解操作が不要なPT-Lについて，その基礎的検討を行った。今回行った基礎的検討において，PT-Lの正確性・同時再現性・オンボード安定性はいずれも良好であり，希釈直線性および検出限界の検討でも，添付文書に記載された測定範囲⁵⁾を満たしていることが確認できた。干渉物質では遊離型ビリルビン，抱合型ビリルビン，ヘモグロビン，乳びについて，今回検討した濃度域においては測定値への影響は認められなかった。ヘパリンについては，正常域試料は0.8 U/mLまで，異常域試料では1.0 U/mLまでは0濃度試料に対して20%を超える変動は認められず，影響を受けないことを確認した。さらに，対照試薬PT-Nとは，PT活性（%），PT（秒），PT（INR）において，いずれも良好な相関関係が認められた。

V　 結語

以上より，凍結乾燥試薬の溶解手技で生じる技師間における誤差は有意差が認められ無視することはできない。今回，液状試薬であるコアグピア^® PT-Liquidの基礎的性能の検討を行い良好な結果から，溶解手技によるエラーの回避が可能であることが確認できた。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献

• 1)   福武  勝幸：日本血栓止血学会用語集プロトロンビン時間．https://www.jsth.org/glossary_detail/?id=342（2020年11月3日アクセス）
• 2)   山崎  哲：「プロトロンビン時間」，スタンダード検査血液学第3版，161–162，日本検査血液学会（編），医歯薬出版，東京，2015.
• 3)   朝倉  英策：「活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT），プロトロンビン時間（PT），フィブリノゲン」，臨床検査ガイド，545–550，大西 宏明，Medical Practice編集委員会（編），文光堂，東京，2020.
• 4)  積水メディカル：「コアグピア^® PT-N」添付文書　第4版，2017年1月改訂．
• 5)  積水メディカル：「コアグピア^® PT-Liquid」添付文書　第2版，2020年1月改訂．
• 6)  シスメックス：「コアグトロールIX」添付文書，2020年5月改訂．
• 7)  シスメックス：「コアグトロールIIX」添付文書，2020年5月改訂．
• 8)  積水メディカル：「コアグピア^®用コントロールP-N」添付文書，2011年4月．
• 9)  日本検査血液学会標準化委員会凝固検査標準化ワーキンググループ：「凝固検査検体取扱いに関するコンセンサス」，日本検査血液学会雑誌，2016; 17: 149–157.