2019 Volume 18 Issue 5 Pages 208-210
An RNA aptamer that binds with high affinity and specificity to human immunoglobulin G (IgG) is a 24-mer single-stranded oligonucleotide containing 2′-fluoro pyrimidine nucleotides. Using X-ray crystallographic analysis, a Ca2+ ion was reported as being located near the G7 phosphate of the RNA aptamer. Surface plasmon resonance analysis showed that the RNA aptamer could not bind to IgG in a buffer without Ca2+ ions. To elucidate the role of Ca2+ ions in the binding of the RNA aptamer to IgG, we performed molecular dynamics simulation for the RNA aptamer/IgG complex with and without Ca2+ ions in a solvent. In the presence of Ca2+ ions, the RMSD of the RNA aptamer backbone remained below approximately 3.0 Å from the crystal structure during a 1,500-ns simulation. The distance between the centroids of the RNA aptamer and IgG was maintained between the centroids in the crystal structure. However, in the absence of Ca2+ ions, the RMSD increased and the structure of the RNA aptamer changed from the initial structure. These results indicate that Ca2+ ions play a role in maintaining the conformation of the RNA aptamer to the binding form.
RNAアプタマーは, 標的分子に対して, 高い親和性と特異性を有する一本鎖のRNA分子である [1]. RNAアプタマーは, 様々な二次構造モチーフを組み合わせることで, 標的分子の表面構造に応じた多様な立体構造を形成することができる. その結果, 標的分子に対して, 複雑な形状認識ができるため, 標的分子に対して, 高い親和性と特異性を生み出すことができる. このことから, 近年RNAアプタマーは, 新機能性分子として幅広い分野での応用が期待されている [2].
ヒト免疫グロブリンG (IgG)に特異的に結合するRNAアプタマーは [3], X線結晶構造解析によって, RNAアプタマーの7番目に位置するヌクレオチドのリン酸付近にCa2+が存在していることが明らかとなった(Figure 1A) [4]. また, 表面プラズモン共鳴法による解析によって, 溶媒中のCa2+が非存在下では, このRNAアプタマーは, IgGと結合することができないことが示された [5]. これらの実験結果から, Ca2+は, RNAアプタマーの標的分子との結合に重要な役割を担っていることが示されたが, その分子メカニズムについては未だ明らかとなっていない.
Structure of the RNA aptamer and the RNA aptamer/IgG complex. (A) Secondary (left) and tertiary (right) structures of the bound RNA aptamer. Symbol: f, 2′-fluoro modification. Watson-Crick base pairs are shown by solid lines; Non-canonical base pairs are shown by filled circle. The dashed line between fU6 and G7 shows the base flipping conformation. Ca2+ ion is shown as orange sphere. (B) The RNA aptamer/IgG complex.
本研究では, Ca2+の存在がRNAアプタマーの立体構造にどのような影響を与えるのか, また標的分子であるIgGとの複合体構造の形成にどのような影響を与えるのか, 分子動力学(MD)計算を用いて解析した.
溶媒和モデルは, 溶媒中にCa2+が存在するモデル(Figure 2A)と溶媒中にCa2+が存在しないモデル(Figure 2B)の2つのモデルを作成した. 各モデルにおいて, RNAアプタマー/IgG複合体の立体構造は, 量子化学計算による相互作用解析で報告された手順に従い [6], 結晶構造(PDB ID: 3AGV)を基に作成した(Figure 1B). 溶媒中にCa2+が存在するモデルでは, RNAアプタマー内部の1個のCa2+に加え, RNAアプタマー/IgG複合体の周囲に, カウンターイオンとして, 10個のCa2+と1個のNa+を配置した. 溶媒中にCa2+が存在しないモデルの作成では, RNAアプタマー内部に存在するCa2+を配置し, カウンターイオンとして, 21個のNa+だけを配置した. 各モデルにおける, 溶媒和ボックスの大きさは, 93×93×93Å3とし, TIP3Pモデルの水分子を配置した.
Solvation box of the RNA aptamer/IgG complex. Orange sphere: Ca2+ ion inside the RNA aptamer, green sphere: Ca2+ ions in the solvent, blue sphere: Na+ ions in the solvent. (A) Ca2+ ions are presence in the solvent. (B) Ca2+ ions are not presence in the solvent.
MD計算は, 作成したそれぞれの溶媒和モデルに対して, 次に示す一連の計算を実行した. 昇温計算では, 100 psで, 溶媒和モデルの温度を0Kから300Kまで上昇させた. この昇温計算において, RNAアプタマー/IgG複合体および結晶構造に存在するCa2+には, 2.0kcal/(mol•Å2)の束縛を課した. 次に, 密度平衡化計算では, 100psで溶媒和モデルの密度平衡化を行った. この密度平衡化計算において, RNAアプタマー/IgG複合体および結晶構造に存在するCa2+には, 20ps毎に2.0, 1.5, 1.0, 0.5および0.1kcal/(mol•Å2)の束縛を課し, 段階的に束縛する力を緩めた. 最後に, 合計1500nsのproduction runは, 1bar, 300Kの条件で実行した. 計算プログラムには, AMBER18を利用し, 力場はff14SB, ff99bsc0_chiOL3を使用した. また, リボース2'位にフルオロ基が修飾されているヌクレオチドの力場には, antechamberを用いて算出したAM1-BCC電荷を適用した.
MD計算によって得られたトラジェクトリーに基づき, 溶媒和モデルの構造を基準とした主鎖骨格のRoot Mean Square Deviation (RMSD)を算出した. RMSDの計算に用いた原子は, RNAアプタマーではP, O5ʹ, C5ʹ, C4ʹ, C3ʹおよびO3ʹとしIgGはCA, CおよびN原子とした. その結果, IgGのRMSD変化は, 溶媒中にCa2+が存在しているモデル(A)では, 平均値および標準偏差が2.20 ± 0.53Åであり, 溶媒中にCa2+が存在しないモデル(B)では, 1.86 ± 0.44Åであった(Figure 3-I). また, RNAアプタマーのRMSD変化は, 溶媒中にCa2+が存在しているモデル(A)では, 平均値および標準偏差が1.86 ± 0.16Åであるのに対して, 溶媒中にCa2+が存在しないモデル(B)では, 4.00 ± 0.68Åであることが分かった(Figure 3-II). そこで, 時間経過に伴うRNAアプタマー/IgG複合体の立体構造変化を解析した. その結果, 溶媒中にCa2+が存在しているモデル(A)は, 1500ns間を通して, RNAアプタマー/IgG複合体の立体構造が結晶構造を維持しているのに対して, 溶媒中にCa2+が存在しないモデル(B)では, RNAアプタマーの立体構造が崩れていることが分かった(Figure 3-III). よって, Ca2+は, RNAアプタマーの立体構造維持に重要な役割を担っていることが示唆された.
(I) Time-dependence of the RMSD for the IgG of the RNA aptamer/IgG complex calculated with respect to the initial structure. (II) Time-dependence of the RMSD for the RNA aptamer of the RNA aptamer/IgG complex calculated with respect to the initial structure. (III) Snapshots of an MD simulation for the RNA aptamer/IgG complex every 300 ns. White structure is the crystal structure. (A) Ca2+ ions are presence in the solvent. (B) Ca2+ ions are not presence in the solvent.
次に, 時間経過に伴うRNAアプタマーとIgGの重心間の距離の変化を解析した(Figure 4). その結果, 溶媒中にCa2+が存在しているモデル(A)は, 平均値および標準偏差が27.37 ± 0.64Åであり, 結晶構造時の二点間距離27.48 Åを維持しているのに対して, 溶媒中にCa2+が存在しないモデル(B)では, 平均値および標準偏差が29.83 ± 0.77Åとなり, 200ns付近を経過するまでに, 二点間距離が離れ, 以後その状態が続いていた. よって, Ca2+非存在下では, RNAアプタマーは, IgGとの結合状態を維持することができないことが明らかとなった．
Time-dependence of distance between the centroids of the RNA aptamer and IgG. The distance between their centroids of in the crystal structure is shown by dashed lines. (A) Ca2+ ions are presence in the solvent. (B) Ca2+ ions are not presence in the solvent.
RNAアプタマー/IgG複合体の立体構造に対してMD計算を行い, Ca2+がRNAアプタマーの立体構造に与える影響, およびIgGとの複合体構造の形成に与える影響を解析した. その結果, Ca2+はRNAアプタマーの立体構造を結合状態の構造に保つ役割を持ち, RNAアプタマーとIgGとの結合状態の保持に重要であることが明らかとなった.
本研究は，JSPS科研費(JP18K11536)，JST地域産学バリュープログラムおよび日本大学学術研究(社会実装研究)の助成を受けたものです.
