分子シャペロンの遺伝子異常により引き起こされる血小板増多

Abstract

巨核球の腫瘍性増殖による末梢血中の血小板増多を呈する本態性血小板血症の大部分の症例では，サイトカイン受容体に結合するチロシンキナーゼJAK2，トロンボポエチン（thrombopoietin: TPO）受容体MPL，分子シャペロンCALRに，相互排他的な遺伝子変異が見いだされる．JAK2とMPL変異はいずれも機能獲得型変異であり，TPOシグナルの恒常的な活性化による巨核球の異常増殖によって，血小板増多が生じる．一方で，これらの中で最後に変異が見つかったcalreticulin（CALR）遺伝子は，それまでTPOシグナルや巨核球分化などとの関連が全く報告されておらず，CALR変異が血小板増多を引き起こすメカニズムは不明であった．本論文では，筆者らがこれまでに明らかにしてきた，変異型CALR蛋白質によるTPOシグナル伝達経路の恒常的な活性化の分子メカニズムについて概説する．

1．本態性血小板血症

血小板増多症の1つである本態性血小板血症（essential thrombocythemia: ET）は，骨髄増殖性腫瘍（myeloproliferative neoplasms: MPN）に分類される造血器腫瘍である．ETは，造血幹細胞に体細胞変異が生じ，変異を有した造血幹細胞が増幅した結果，血小板産生を行う巨核球が異常に増加することで発症すると考えられている．2005年に，ETを含む多くのMPN患者に共通して，サイトカイン受容体シグナルを伝達するチロシンキナーゼJAK2に機能獲得型の体細胞変異が見いだされた（図1）^1–4）．さらに2006年には，JAK2変異陰性のET患者の一部において，血小板産生を促す造血因子トロンボポエチン（thrombopoietin: TPO）の受容体MPLに機能獲得型の体細胞変異が見いだされた（図1）^{5, 6）}．これらの発見により，ETではJAK2あるいはMPLの変異によってMPL下流のJAK2シグナル伝達経路が恒常的に活性化し（図2），異常な巨核球の増加と，それに伴う血小板の増加が生じていることが明らかになった．またMPLは，巨核球のみならず造血幹細胞の維持や増殖にも関与していることから^7–9），変異を有する造血幹細胞の腫瘍性増殖にも寄与していると考えられている．

図1

本態性血小板血症で見いだされる変異遺伝子

筆者らがWHO2016分類に基づき本態性血小板血症と診断した患者の遺伝子変異頻度を記した．3例の患者が，2つの遺伝子変異を有していた．Triple-negativeは，JAK2，CALR，MPL遺伝子のいずれにも変異が見いだされない症例である．

図2

変異蛋白質によるMPL下流シグナルの活性化

文献（29）の図を改変して転載．正常な状態では，TPOの有無により下流シグナルの調節が行われているが，本態性血小板血症では，JAK2，MPL，あるいはCALRのいずれの変異型蛋白質も，TPOの無い環境でも下流のシグナル伝達経路を活性化する．

2．CALR遺伝子変異の同定

JAK2変異とMPL変異の発見によりETの分子病態の解明が大きく進んだものの，約半数のET症例においてこれらの変異が見いだされなかった．そのため長期にわたって，MPL-JAK2経路に関与する因子の変異検索が行われたが，決定的な変異は見いだされず空振りに終わった．しかし2013年末に，高速シークエンサーを用いた全エクソン配列解析により，JAK2とMPL変異が陰性の患者の約75％に共通して，分子シャペロンをコードしているcalreticulin（CALR）遺伝子に体細胞変異が見つかった^{10, 11）}．CALRは通常，蛋白質分泌経路の出発点である小胞体において，将来細胞外に分泌される蛋白質や細胞膜に局在する受容体の折りたたみを促す分子シャペロンとして働いている．また，アポトーシスを起こした細胞では細胞表面に出て，マクロファージによる貪食を促進することが知られている．このため当初，変異型CALRは，受容体の成熟不全を引き起こすことでMPL-JAK2経路を活性化，あるいは抗腫瘍免疫からの回避に関与し，ETを発症させるのではないかと考えられた．一方で，分子シャペロンの異常がシグナル伝達経路の活性化を引き起こす事例が存在しなかったことや，他の腫瘍でCALR変異が報告されていなかったことなどから，CALR変異の報告を懐疑的に感じたのは，筆者だけではなかったと想像する．

しかし，CALR変異の特徴が，この変異が偶然生じたものではないことを強く物語っていた．CALR変異は，全てが最終エクソンの限定された領域における短い塩基の挿入か欠失であり，蛋白質に翻訳するコドンの読み枠がずれるフレームシフト変異であった．さらに，通常の機能喪失型のフレームシフト変異では，1あるいは2塩基の読み枠のずれがランダムに生じるのに対し，ET患者で見いだされるCALR変異の読み枠のずれは，1塩基だけであった．このため，CALR変異遺伝子から産生される変異型CALRのカルボキシル末端には，変異型蛋白質に共通する特異的なドメインが存在する（図3）．これらのことから，CALR変異が機能獲得型の変異であることが強く疑われた．

図3

CALR蛋白質のドメイン構造

文献（21）の図を改変して転載．野生型CALRの構造は，小胞体移行に必要なシグナルペプチド配列（SP），N型糖鎖結合ドメイン（N），Pドメイン，Cドメイン，小胞体回帰シグナル（KDEL）に分けられる．変異型CALRは，フレームシフト変異により，Cドメインの後半に変異型特異的ドメインが付加している．このドメインは，分子間相互作用によるホモ多量体化を引き起こし，Nドメインを介したMPLとの強固な結合に必要な構造変化を惹起していると考えられる．

3．CALR変異遺伝子による血小板増多

そこで筆者らは，ET患者において，JAK2，MPL，CALR変異が相互排他的に見いだされることに着目し，野生型のJAK2とMPLが機能しているUT-7/TPO細胞^12）を用いて，機能不明のCALR変異遺伝子の解析を行った．その結果，1）TPO依存性に増殖するUT-7/TPO細胞が，CALR変異遺伝子の発現によりTPO非依存性に増殖すること，2）この際に，MPL下流のJAK2の活性化が生じていること，3）変異型CALR依存性の細胞増殖にMPLが必要であること，が明らかになった^13）．また他のグループから同様の研究結果に加えて^{14, 15）}，CALR変異遺伝子を発現させた造血幹細胞を放射線照射したマウスに移植すると，骨髄中における巨核球の増加，それに伴う末梢血中の血小板の増多が観察され，ETの病態が再現されることや^{14, 16）}，トランスジェニックマウスやノックインマウスでも同様の結果が報告された^{17, 18）}．一方筆者らは，CALR変異陽性の患者から樹立したiPS細胞を造血幹・前駆細胞に誘導すると，TPO非依存性に巨核球に分化すること，さらにこの分化にMPLが必須であることを示した^{13, 19）}．これらのことから，変異型CALRが未知の機能でMPLを恒常的に活性化させることで巨核球の増加を引き起こし，ETを発症させることが明らかになった（図2）

4．フレームシフト変異により出現した変異型特異的ドメインの役割

次に筆者らは，変異型CALRによるMPLの特異的な活性化が生じる分子メカニズムを明らかにするために生化学的な解析を行い，変異型CALRがMPLと強固に結合することを見出した^13）．そして変異型CALRには，フレームシフト変異により生まれた変異型特異的なドメインが存在することから，このドメインがMPLの結合ドメインと考えて解析を続けたが，結合は全く検出できなかった．そこで変異型CALRの様々な欠失変異体を作成して結合試験を行ったところ，1）野生型にも存在するNドメインがMPLとの結合を担っていること，2）野生型CALRではNドメインによるMPLとの結合がPドメインにより抑制されていること，3）変異型CALRではこの抑制が変異型特異的ドメインにより解除されるためMPLと結合できること，が明らかになった（図3）^13）．これにより変異型CALRが，野生型では見られないMPLとの強い結合能を獲得し，MPLの活性化を引き起こしていると考えられたが，依然としてMPLの活性化を引き起こす分子メカニズムは不明であった．

MPLの含まれるI型サイトカイン受容体は，細胞外ドメインにサイトカインが結合してホモ2量体化し，受容体の細胞内ドメインに結合したチロシンキナーゼが相互をリン酸化することで，活性化する（図 2左）．そこで筆者は，変異型CALRがMPLの2量体化を引き起すモデルとして，変異型CALRのホモ2量体化を考えた．これは，2つのMPL結合ドメインを有する1つの変異型ホモ2量体が，2分子のMPLと結合することで，MPLのホモ2量体化を引き起こすというモデルである．これを検証するために生化学的な解析を行い，変異型CALRが分子間相互作用によりホモ多量体を形成することを明らかにした^20）．さらに解析を進めたところ，変異型CALR同士の分子間相互作用は，フレームシフト変異により生じた変異型特異的ドメインで生じていることが明らかになった．また，このような変異型CALRのホモ多量体化を阻害すると，MPLとの結合や活性化が著しく低下することが明らかになった^20）．これらのことは，変異型特異的ドメインにおけるホモ多量体化が構造変化を引き起こし，先に述べたPドメインによるMPL結合抑制を，解除していることを強く示唆している（図3）^21）．以上の解析により，変異型CALRはMPLのリガンドのように働いて，MPLの活性化を引き起こしていることが明らかになった（図 2）．

5．変異型CALRによるCALR変異陽性細胞選択的なMPL活性化

次に筆者らは，変異型CALRが，TPOと同じように細胞外から細胞表面に発現しているMPLを活性化する可能性について検討した．変異型CALRは，フレームシフト変異により，野生型CALRのカルボキシル末端に存在する小胞体回帰シグナルが喪失するため（図3），細胞外に分泌される^22）．そこで変異型CALRを分泌する細胞と，MPLを発現するUT-7/TPO細胞を共培養して増殖を調べたが，分泌された変異型CALRはUT-7/TPO細胞の表面に発現するMPLを活性化しなかった^13）．これは，変異型CALRがMPLのリガンドのように振る舞うというモデルと一見矛盾する結果であるが，CALR変異細胞のMPLを選択的に活性化することから，CALR変異陽性患者で見られる腫瘍細胞の増殖優位性とは合致している．

このような変異型CALRによる，CALR変異陽性細胞に特異的なMPLの活性化が生じる背景には，MPLの成熟の違いがある．先述のとおり，野生型CALRは小胞体内で受容体などの分子の折りたたみに関与しているが，折りたたみを行う必要のある新たに合成された蛋白質を識別する必要がある．この識別には，標的蛋白質のアスパラギン（N）残基に付加されたN型糖鎖の成熟が関与しており，未成熟な場合にのみCALRが結合し，折りたたみが終了しN型糖鎖が成熟すると結合できなくなる（図4左下）^23）．このN型糖鎖結合能は，変異型CALRにおいてMPL結合を担っているNドメインに存在し，N型糖鎖結合部位を破壊するとMPLとの結合や活性化ができなくなる^{15, 24, 25）}．これらのことは，変異型CALRが，野生型CALRに備わっていた未成熟なN型糖鎖結合能を使ってMPLと結合していることを示している（図4）．そのため，通常の細胞表面に発現している成熟したN型糖鎖を有するMPLに結合できないことから，通常の細胞に対しては，サイトカインのように働かない（図5）．

図4

変異型CALRによるMPLの活性化メカニズム

文献（30）の図を改変して転載．分子シャペロンである野生型CALRは，未成熟なN型糖鎖を認識してMPLと結合し，MPLの折りたたみの完了に伴うN型糖鎖の成熟により，MPLから解離する．一方で，変異型CALRはMPLと強固な複合体を形成し，小胞体回帰シグナルを喪失しているために（図3），ゴルジ体を経由して細胞表面まで移行し，下流のシグナル伝達経路を活性化する．

図5

変異型CALRによるCALR変異細胞選択的なMPL活性化

文献（31）の図を改変して転載．変異型CALRは，正常細胞表面の成熟型MPLを活性化せず，CALR変異細胞で発現しているMPLを活性化する．分泌された変異型CALRが，CALR変異細胞表面のMPLを活性化できることが示されている．一方で，細胞内で形成された変異型CALRとMPLの複合体も細胞表面で活性化していると考えられることから，分泌された変異型CALRによる活性化が患者細胞でどの程度生じているかは未解明である．

6．変異型CALRによるMPLの活性化が生じる場所

次に筆者らは，変異型CALRによるMPLの活性化が生じる細胞内での場所を調べた．先述のとおり，変異型CALRは細胞外に分泌されることから，CALR変異を有する細胞において未成熟なN型糖鎖を有するMPLが細胞表面に発現していれば，それをautocrineに活性化する可能性が考えられる．一方で，小胞体で変異型CALRとMPLが結合して複合体を形成し，細胞内で活性化する可能性もある．そこで筆者らは，蛋白質の細胞表面への輸送や細胞外への分泌を阻害したときのMPLの活性化状態を調べ，変異型CALRによるMPLの活性化が，輸送や分泌の阻害に対して耐性であることを見出した^24）．これは，細胞内で変異型CALRとMPLが複合体を形成し，細胞表面に到達する前に，活性化していることを示唆していた．これを確認するために筆者らは，細胞表面の蛋白質をプロテアーゼにより取り除いて，MPL下流の活性化状態を調べたが，予想に反して，活性化は速やかに消失した．また，変異型CALRを発現する細胞の表面におけるMPLの挙動を調べたところ，本来のリガンドであるTPOで惹起されるような迅速な細胞内への移行（internalization）は観察されず，長時間にわたって細胞表面に存在していることが明らかになった．これらのことから，変異型 CALRの結合したMPLは，細胞表面において持続的に活性化していることが明らかになった（図4，図5）^24）．なお，細胞表面でMPLを活性化する変異型CALRが，細胞内からMPLと結合していたものであるのか，細胞外に分泌されたものが結合したのかについては不明であるが，細胞外に分泌された変異型CALRがCALR変異細胞表面のMPLを活性化できることは示されている（図5）^26）．

本稿で紹介したように，分子シャペロンの異常が，当初は全く想像もしていなかった分子メカニズムで受容体のリガンドとしての機能を獲得し，細胞の腫瘍化を引き起こしていることが明らかになった．しかし，変異型CALRの細胞内動態には不明な点も多く，分子構造も解明されていないことから，今後の解析により，さらなる驚きの発見があるかもしれない．また最近になって，変異型CALRが核内での転写調節^27）や，細胞外での免疫抑制に関与する^28）との報告がなされている．今後，CALR変異による血小板増多の分子病態の解明がさらに進むことで，新たな治療法が開発されることを期待したい．

著者の利益相反（COI）の開示：

本論文発表内容に関連して開示すべき企業等との利益相反なし．

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