日本人の免疫原性血栓性血小板減少性紫斑病における疾患感受性HLAの同定

Abstract

致死的血栓症である血栓性血小板減少性紫斑病（thrombotic thrombocytopenic purpura: TTP）では，メタロプロテアーゼADAMTS13の活性著減によって全身の微小血管内に血小板血栓が生じ，虚血性臓器障害を来す．免疫原性TTP（immune-mediated TTP: iTTP）は後天的なADAMTS13に対する自己抗体産生によって発症する．自己免疫性疾患の遺伝的な発症リスク因子として疾患感受性HLAが知られており，白人iTTP患者を対象とした複数のHLA解析から，DRB1*11（DRB1*1101およびDRB1*1104）が疾患感受性HLAとして同定されている．しかし，遺伝的背景の異なる日本人における解析は未報告であり，我々は国内の19施設52人のiTTP患者を対象とした次世代シークエンサーを用いたHLA解析を実施した．白人での既報とは全く異なるDRB1*0803が日本人における疾患感受性HLAとして同定された．NetMHCIIpan ver 3.2を用いたin silicoでのADAMTS13結合ペプチドの検索ではCUBドメイン内LFINVAPHARがDRB1*0803およびDRB1*1101由来DR分子の共通の結合部位であることが推測された．今後in vitroでのMHC-ペプチド結合アッセイにおける検討が必要である．

1．はじめに

血栓性血小板減少性紫斑病（thrombotic thrombocytopenic purpura: TTP）は稀な致死的血栓症である^{1, 2）}．後天性の免疫原性TTP（immune-mediated TTP: iTTP）ではADAMTS13に対する自己抗体の産生によって同酵素活性が著減する^{3, 4）}．その結果，微小血管内に病的な血小板血栓が多発し，虚血性の臓器障害を引き起こす．現在，iTTPは自己免疫性疾患として認知されているが，多くの自己免疫性疾患において疾患感受性HLAと呼ばれる特定のHLAアリルが疾患発症のリスク因子として同定されている．iTTPにおいても2010年頃に欧州から白人iTTP患者を対象とした疾患感受性TTPの同定が進み，更にはin vitroでの基礎研究が進行中である．その一方で，遺伝的背景が大きく異なる日本人における疾患感受性HLAは不明であった．最近我々は日本人iTTP患者を対象としたHLA解析研究を行い，疾患感受性HLAの同定に成功した．本稿では遺伝的背景の異なる白人および日本人iTTP患者における疾患感受性HLA同定研究および抗原エピトープとなりうるADAMTS13ペプチドの同定研究について概説する．

2．iTTPの病態

von Willebrand因子（von Willebrand factor: VWF）は血管損傷部位において血小板と共同して止血反応に関与する重要な糖タンパクである^5）．VWF単量体は血小板Glycoprotein Ibとの結合に関与するA1ドメインやADAMTS13切断部位であるA2ドメインなどの複数のドメイン構造をもち，N末端及びC末端同士でジスルフィド結合し，折りたたまれたUltra-large VWF multimer（UL-VWFM）として血管内皮細胞内で合成・貯蔵される．血管内皮から分泌されたばかりのUL-VWFMは各ドメインを内包した球状構造を呈する^6）．血管径が細くなるにつれて，球状のUL-VWFMはずり応力を受け，伸展することで各ドメイン構造が露出する．伸展したUL-VWFMは非常に血栓形成能が強く，微小血管において血小板を巻き込み，血小板血栓による内腔閉塞を来しうる^1）．実際の生体内では過剰な血栓形成を予防するべく，VWF切断酵素であるADAMTS13が存在し，VWFのA2ドメイン（Tyr1605-Met1606間）を切断する．このように，VWFはADAMTS13によって，病的血栓を引き起こさず，かつ適切な止血血栓を形成するという微妙なバランスに血栓形成能が制御されている．ところが，TTP患者では微小血管において本来存在し得ないUL-VWFMがADAMTS13の欠乏によって残存するため，UL-VWFMが循環中の血小板を巻き込んで血小板血栓を形成し，致死的な虚血性臓器障害（心筋梗塞，脳梗塞など）をきたす．（図1　文献7より引用）ADAMTS13活性が著減する機序としては，ADAMTS13遺伝子異常による先天性TTP ^8）およびADAMTS13に対する自己抗体産生による後天性のiTTP ^{3, 4）}の2パターンがあり，90％以上の症例がiTTPである．

図1

VWFとADAMTS13からみたTTPの病態（文献7より引用）

VWFはマルチドメイン構造を有するタンパクであり，A1ドメインで血小板GPIbと結合し，A2ドメインでADAMTS13によって切断される．血管内皮細胞はVWFの主たる合成の場であり，複数のサブユニットがN末端同士，C末端同士でジスルフィド結合によって折りたたまれている（UL-VWFM）．血管内皮から放出されたばかりのUL-VWFMは，折りたたまれたまま大血管から末梢の最小血管まで循環する．血管径が細くなるにつれて，UL-VWFMが受けるずり応力（shear stress）が増大し，次第に各ドメインが露出した伸展構造へと変化する．ADAMTS13活性が正常であれば，適切な分子量にUL-VWFMを切断するため，過剰な血小板血栓は形成されない．しかし，ADAMTS13自己抗体（インヒビター）やADAMTS13遺伝子変異によるADAMTS13活性低下があれば，伸展したUL-VWFMが残存し，循環中の血小板と反応して過剰な血小板血栓を形成する．その結果，血小板数は消耗性に低下し，血管内腔の狭小化により赤血球の破壊が生じる．

3．自己免疫性疾患とHLA

主要組織適合遺伝子複合体（major histocompatibility complex: MHC）は，免疫反応に必要な数多くのタンパクに関連した遺伝子情報を含む，細胞膜表面に存在する糖タンパクである．ヒトにおけるMHCは一般にヒト白血球抗原（human leukocyte antigen: HLA）として認知されている．免疫反応における抗原提示のプロセスにおいてHLAは非常に重要な役割を果たしている．樹状細胞などの抗原提示細胞の表面に表出されたHLA Class II分子は（主に外来）抗原ペプチドと結合しHLA-ペプチド複合体を形成する．そして，同複合体がヘルパーT細胞であるCD4⁺T細胞に提示され，免疫応答が進行する^9）．このHLA分子が認識するペプチドはコーディングされているアリルごとに異なることが知られている．実際に，自己免疫性疾患患者では特定のHLAアリル（疾患感受性HLA）を有することが報告されており，疾患感受性HLA由来のHLA分子が自己ペプチドと効率よく結合し，ヘルパーT細胞へ抗原提示刺激がされると推測されている^10–12）．疾患感受性HLAの保有は遺伝的なリスク因子であると認知されているが，なぜ当該HLAが疾患発症を引き起こすのかが詳細に検討されている疾患はほとんどない．

4．諸外国におけるiTTPの疾患感受性HLA

iTTPは希少疾患であるため，単施設において大規模なHLA解析を行うことは困難であり，疾患感受性HLAの同定研究の報告は限定されたものである．2010年から2012年にかけて白人におけるiTTP患者と健常人とのアリル頻度を比較した研究結果が3施設より報告された．

Scullyら^13）は50人のヨーロッパ人のiTTP患者を対象にclass II HLAタイピング（DRB*, DQB1*）を行い，DRB1*11およびDRB3*，DQB1*0301のアリル頻度が健常人に比して有意に高いことを示した．（それぞれ44.0％ vs. 12.0％［Pc＝0.0024］，84％ vs. 58％［Pc＝0.024］，58％ vs. 34.5％［Pc＝0.048］）一方，DRB1*04およびDRB4の頻度は健常人よりも有意に低く，これらのHLAがiTTP発症に保護的に働くと想定された（10％ vs. 35％［Pc＝0.0096］，26％ vs. 61.5％［Pc＝0.0024］）Coppoら^14）はTMAレジストリーに登録された191人のiTTP患者を対象にclass I（A*, B*）およびclass II（DRB1*, DQB1*）の4座についてアリル頻度を健常人と比較し，同じくDRB1*11の頻度が高いことを報告した．（62％ vs. 23％［Pc＜10^-7］）またDRB1*04はiTTPにおいてアリル頻度が低かった．（10％ vs. 28％［Pc＝0.05］）Johnら^15）はドイツ人のiTTP患者47名を対象にclass II HLAタイピング（DRB1*, DQB1*）を行い，患者群でDQB1*02:02およびDRB1*11の頻度は健常人コントロールと比して有意に高いことを示した．（21％ vs. 1.2％［Pc＜0.001］，48.1％ vs. 23.5％［Pc＝0.003］）また，DRB1*04が保護因子である傾向があると示し（7.4％ vs. 24.6％［Pc＝0.064］）これらの結果より，DRB1*11がiTTPにおける疾患感受性HLAであり，DRB1*04が疾患抵抗性HLAであると認知されるようになった．

Martinoら^16）のグループは2016年に黒人iTTP患者を対象としたHLA解析を行い，黒人のiTTPと健常人の間には白人で重要とされるDRB1*11，DRB1*04，DQB1*03のアリル頻度に統計学的有意差がみられなかったと報告している．興味深いことに，白人と黒人の健常人でアリル頻度を比較したところ，疾患抵抗性HLAとされるDRB1*04の頻度は有意に黒人で低値であった．

5．iTTPにおけるHLA基礎研究とその解釈

白人iTTPを対象とした臨床解析より，疾患感受性HLAであるDRB1*11（のちにDRB1*11:01およびDRB1*11:04）がiTTP発症のリスク因子と考えられるようになった．次に，疾患感受性HLAより発現されるHLA分子がどのようなADAMTS13ペプチドと効率よく結合し，ヘルパーT細胞に抗原提示されるのかに関心が寄せられるようになった．2013年にはオランダのSorvilloらが17人の健常人を対象とした基礎研究結果を報告している．まず彼らの単核球細胞からIL-4およびGM-CSFにて未熟樹状細胞を分化させ，全長のADAMTS13タンパクと共培養し，細胞破砕物よりHLA-DR-ペプチド複合体を精製した．その後，HLA-DRペプチド複合体からのペプチド溶出を行い，質量分析によってそのアミノ酸配列を同定した．HLA-DRB*11および-DRB1*04陽性者では低濃度（100 nM）のADAMTS13抗原刺激においてFINVAPHARおよびASYILIRD含むペプチドがHLA-DR-ペプチド複合体から検出された^17）．また，2016年には同グループよりVerbijらが2名のiTTP患者血液を用いたT細胞アッセイの結果を報告した．患者はそれぞれHLA-DRB1*11およびHLA-DRB1*03を有していた．患者の単核球細胞を回収し，ADAMTS13ペプチド（FINVAPHARおよびASYILIRD）と共培養した．CD40LはヘルパーT細胞がMHC-ペプチド複合体より抗原提示された際に発現するヘルパーT細胞活性化の指標である．Verbijらは培養細胞中のCD40L発現量をフローサイトメトリーで確認し，それぞれの患者の急性期単核球細胞は既知のアリル拘束性T細胞エピトープであるFINVAPHARもしくはASYILIRDとの共培養によってCD40Lの発現量が上昇することを示した^18）．一方，2017年にはフランスのGilardinらはHLA-DRB1*01:01遺伝子組換えマウスよりADAMTS13反応性CD4⁺T細胞ハイブリドーマを作成し，in silico解析より推測されるADAMTS13ペプチドのうち¹²³⁹GDMLLLWGRLTWRKM¹²⁵³がDRB1*01:01アリル拘束性T細胞エピトープであることを示した．そして，このADAMTS13ペプチドはDRB1*11:01を有する2人のiTTP患者より分離したCD4⁺T細胞も活性化することが証明された．同研究では，先行研究で同定されているアリル拘束性ペプチドであるFINVAPHARはDRB1*11:01陽性iTTP患者由来のCD4⁺T細胞を活性化しなかった^19）．

6．日本人におけるiTTPの疾患感受性HLA

前述のように2010年以降，白人を中心にiTTPにおける疾患感受性HLAの同定および，付随するMHC-ペプチド結合アッセイがヨーロッパを中心に実施されてきた．しかし，白人とは遺伝的背景が大きく異なる日本人における同様のHLA解析研究は報告されていなかった．我々は2017年9月より2019年3月までに日本国内の19施設の医療機関を受診した日本人のiTTP患者52名を対象としたHLA解析を実施した．次世代シーケンサー（Miseq®, illumina）による11遺伝子座の同定を行い，そのアリル頻度を既存の日本人の健常人におけるアリル頻度と比較した．疾患感受性HLAを同定するためにコントールとして中島らの日本人の健常人を対象とした解析結果を用いた^20）．解析結果よりDRB1*08:03，DRB3/4/5*blank，DQA1*01:03，DQB1*06:01のアリル頻度が健常人に比してiTTP患者で有意に高値であった（表1）．この4アリルは連鎖不均衡の関係にあり，オッズ比の最も大きなDRB1*08:03が日本人の疾患感受性HLAであると結論づけた．一方，iTTP患者ではDRB1*15:01，DRB5*01:01のアリル頻度が健常人よりも低く，これらのアリル（連鎖不均衡の関係にある）はiTTP発症に対して保護的に働くと推測された．なお，白人iTTPにおいて報告されているDRB1*11およびDRB1*04は日本人においては健常人群とiTTP患者群で有意差がなかった．以上より，日本人と白人ではiTTPの疾患感受性HLAが異なることを同定した^21）．

表1 日本人におけるiTTP患者と健常人のアリル頻度の比較結果

HLA type	iTTP患者におけるアリル頻度（％）	健常人におけるアリル頻度（％）	P値	補正P値（Pc）	オッズ比（95％信頼区間）
	n＝52	n＝516
DRB1
DRB1*08:03	17.3％	6.4％	2.86×10–4	0.005	3.06（1.63–5.51）
DRB1*15:01	2.9％	11.6％	4.22×10–3	0.076	0.23（0.05–0.70）
DRB3/4/5
Blank	27.9％	14.3％	9.13×10–4	0.007	2.30（1.40–3.72）
DRB5*01:01	2.9％	11.6％	4.22×10–3	0.034	0.23（0.05–0.70）
DQA1
DQA1*01:03	29.8％	15.9％	8.94×10–4	0.006	2.25（1.38–3.60）
DQB1
DQB1*06:01	29.8％	14.9％	2.49×10–4	0.003	2.41（1.48–3.88）

注：AおよびB，C，DPB1座では2群間で統計学的有意差のあるアリルは同定されなかった．

文献21より引用

次に我々は「疾患感受性HLAが異なる白人と日本人において何故で同じphenotypeのiTTPを発症するのか」という疑問に答えるため，NetMHCIIpan version 3.2（http://services.healthtech.dtu.dk/）^22）によるMHC-ペプチド親和性の予測シミュレーションを試みた．まず，白人と日本人の疾患感受性HLAであるDRB1*08:03およびDRB1*11:01についてそのHLA分子のポケットモチーフを比較した．図2（文献21より引用）に示すようにDRB1*08:03およびDRB1*11:0由来のHLA分子は異なるポケットモチーフを有していた．通常，ポケットモチーフが異なるHLA分子間では同一のペプチドに対する結合親和性は異なると推測される．次に，既知のヒトADAMTS13アミノ酸配列データを用いて，それぞれのHLA分子がヒトADAMTS13内のどのようなペプチドと高親和性を示すかを予測した（表2）．興味深いことにDRB1*08:03で高親和性ペプチドと予測されたLFINVAPHAはDRB1*11:01で報告されているアリル拘束性T細胞エピトープであるCUBドメイン内FINVAPHARと1アミノ酸残基ずれた配列であった．

図2

DRB1*08:03とDRB1*11:01由来DR分子のポケットモチーフの比較（文献21より引用）

NetMHCpanIIのMotif viewerによるLogosを示す．横軸の数字はポケットモチーフの番号であり，一般に結合に重要なモチーフは1，4，6，7，9番と考えられている．また，アルファベットはアミノ酸残基の略称を示し，青・赤・緑色のアミノ酸はそれぞれ塩基性・酸性・中性アミノ酸を表す．文字の高さは各ポケットとの親和性である．DRB1*08:03とDRB1*11:01は異なるポケットモチーフを有している．

表2 高親和性ADAMTS13由来ペプチドと疾患感受性HLA

		ADAMTS13 peptide	ADAMTS13 Domain*	Sequence (Core Sequence)	％Rank
DRB1*08:03	1	101–115	M	ERYVLTNLNIGAELL	1.9
	2	570–584	S	YLTFLTVTPNLTSVY	1.1
	3	914–928	T5	ELRFLCMDSALRVPV	1.7
	4	1324–1338	CUB2	GCRLFINVAPHARIA	0.3
	5	1334–1348	CUB2	HARIAIHALATNMGA	1.6
DRB1*11:01	1	267–281	M	RRQLLSLLSAGRARC	0.6
	2	589–603	S	RPLFTHLARIGGRY	1.7
	3	1246–1260	CUB1	GRLTWRKMCRKLLDM	0.3
	4	1325–1339	CUB2	CRLFINVAPHARIAI	1.1

*M: metalloprotease, S: spacer, T: thrombospondin-1

％Rank＜2％をStrong binderと定義した．

文献21より引用・筆者改変

以上の結果をまとめると，白人と日本人はそれぞれ疾患感受性HLAとしてDRB1*11:01およびDRB1*08:03をそれぞれ持ち，発現されるHLA分子は異なるポケットモチーフを有している．ADAMTS13のCUBドメイン由来のペプチドであるLFINVAPHARについて，それぞれのHLAのポケットモチーフで結合しうることが推測された．

7．iTTPにおけるHLA解析の今後の展望

iTTPにおける疾患感受性HLAの同定は，生体内においてどのようなADAMTS13ペプチドが樹状細胞からT細胞に認知されるのかという疑問につながり，最終的にはいかにしてiTTPは発症するのかという根本的な疑問を解決する糸口となりうる．今のところ，白人を対象としたT細胞アッセイやMHC-ペプチドアッセイからは幾つかのADAMTS13ペプチドが指摘されているが最終的な結論はついていない．また，日本人iTTP患者で同定された疾患感受性HLA由来のDR分子の高親和ペプチドについてはin silico解析で予測されているのみである．つまり，あくまでも予測でしかないため，in vitroでの検証が不可欠とされている．現在，我々は筑波大学遺伝医学の宮寺浩子先生と共同研究を行い，HLA density assayを用いたDRB1*08:03およびDRB1*11:01の高親和性ADAMTS13ペプチドの検索を行っている^23）．今後，抗原ペプチドの同定結果と自己抗体のエピトープマッピングの関連を解析することで，iTTP発症のメカニズムの解明につながると考えられる．

8．おわりに

iTTPはADAMTS13に対する自己抗体を産生する自己免疫性疾患であることが判明し，発症リスクとしての疾患感受性HLAの同定が欧州を中心に進められてきた．さらにHLA結合ペプチド溶出による抗原ペプチドの質量分析やiTTP患者単核球分画細胞を用いたT細胞アッセイなどによりアリル拘束性T細胞エピトープの同定が進んでいる．我々は日本人iTTPにおけるHLA解析研究より，異なる疾患感受性HLAを持つ白人と日本人が共通した自己ADAMTS13ペプチドを認識し，同じiTTPを発症する可能性を示した．現在，in vitroの実験系での検証が進行中である．

筆者の利益相反（COI）の開示：

本論文発表内容に関連して開示すべき企業等との利益相反なし

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