NETsと自己免疫疾患

Abstract

新たな生体防御機構として2004年に発見された好中球細胞外トラップ（neutrophil extracellular traps: NETs）は，自然免疫にとどまらずその制御不全が自己免疫疾患にも根本的に関わることが明らかとなってきた．NETsは自己免疫疾患の発症と進展へ少なくとも次の4つの点で寄与している．①病原性自己抗体産生における自己寛容（tolerance）の破綻②NETs成分の露出による自己抗原の供給③炎症の増幅④炎症に伴う血栓症（thromboinflammation）である．2007年，NETsが臓器損傷を誘発して宿主を傷つける可能性が初めて示唆されたのを契機に，NETosis阻害により様々な感染症における組織損傷を軽減できることが報告され，現在では，全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus: SLE），関節リウマチ（rheumatoid arthritis: RA），糖尿病，アテローム性動脈硬化症，全身性血管炎，血栓症，がんの転移，創傷治癒，外傷など様々な病態に関与していることが報告されている．しかし，NETsは本来生体防御機構の一つであり，感染防御のみならず何らかの有益な機能を果たしている可能性も忘れてはならず，NETsの制御法は重要な研究テーマの一つとなっている．

1．NETsの自己免疫への関与

好中球細胞外トラップ（neutrophil extracellular traps: NETs）は，様々な自己免疫疾患の炎症病変部位に高濃度に存在することが示されている．これまでの報告から，NETsのクリアランスの低下，NETsの高濃度化，あるいはNETsと他の免疫細胞との相互作用が自己寛容（トレランス）の破綻に重要な役割を果たしていると考えられている．NETosisでは，好中球の細胞質内タンパク，核内のヒストン，脱凝縮したクロマチンDNAなどが細胞外に露出されることにより，自己抗原が宿主の免疫系に提示される．これが，全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus: SLE），全身性血管炎，関節リウマチを始めとする自己免疫疾患において病原性の自己抗体の産生につながり，その免疫複合体が炎症を惹起するというメカニズムが想定されている^1）．すなわち免疫系が自己抗原に耐えられず（不寛容），自己抗体や自己反応性リンパ球などのエフェクターメカニズムを引き起こす病態が起きていると考えられている．NETsは適応免疫系を活性化させるだけでなく，補体系やインフラマソームを活性化して炎症を増幅させる損傷関連分子パターン（damage-associated molecular patterns: DAMPs）としても作用する^2）．NETsに結合したDNAは，Toll-like receptor 9（TLR9）依存的にB細胞の活性化を引き起こし^3），またI型インターフェロン（interferon: IFN）の主たる産生源である形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid dendritic cells: pDCs）を活性化することができる．自己核酸は正常では細胞外環境で速やかに分解されるが，NETsに含まれる内因性抗菌ペプチドLL37やヒト好中球ペプチド（human neutrophil peptide: HNP）は，自己DNAをpDCの活性化因子に変換する重要な分子であることが示されている．臨床的にもLL37の発現は，抗好中球細胞質抗体（anti-neutrophil cytoplasmic antibody: ANCA）関連血管炎（ANCA associated vasculitis: AAV）における全身および腎臓の炎症と関連していたと報告されている．これを説明する説として，LL37やHNPがNETsのDNAと複合体を形成し，pDCによるDNAの認識を増幅しIFN-αやカスパーゼ-1の産生を増加させてインフラマソームの形成を促進するというメカニズムが提唱されている^{4, 5）}．pDCsの活性化と同様に，NETsはT細胞の活性化閾値を下げて，T細胞を特定の抗原や共刺激がない場合でも直接プライミングすることができる^6）．このようにNETsがT細胞を直接活性化することができるという報告は，好中球の獲得免疫への直接的な関与を示すものである．産生されたNETsは積極的なエンドサイトプロセスを経てマクロファージによって飲み込まれることにより免疫学的にはサイレントな方法で制御され，最終的にリソソームで分解される^{7, 8）}．

一方，NETsは，血小板や赤血球の接着や凝集の足場を提供し刺激となって凝固を促進し^9），血栓症を誘導する^10）．NETの主な構成要素（DNA，ヒストン，プロテアーゼ）はいずれも血液凝固促進作用を示す．NETsのDNAが有する陰性荷電は第XII因子を活性化して内因系凝固経路を活性化する．細胞外ヒストンは，上皮細胞や内皮細胞の死を直接誘導し ^11），生体内での血栓症を引き起こす^12）．また細胞外ヒストンはトロンビンの生成を促進することで血漿の抗凝固作用を阻害し，トロンボモジュリンの機能を妨げる^{13, 14）}．エラスターゼは組織因子経路インヒビターを不活性化し，その結果，in vivoでの凝固とフィブリン沈着をさらに増加させる．このように，NETsは炎症性疾患におけるthromboinflammationの主役と考えられている．

冒頭で述べたように，NETsは自己免疫疾患において病原的な役割だけでなく，炎症の治癒にも関わっている可能性がある．尿酸ナトリウム結晶に対する急性無菌性炎症反応を特徴とする痛風の炎症反応が自然に治まるのは，セリンプロテアーゼを介してサイトカインやケモカインを分解する好中球と凝集したNETsの機能に関係している^15）．このように，NETsは様々な角度から自己免疫疾患に関わっており，NETsの産生や分解処理の多様性が，自己免疫疾患の多様性や活動性を形成しているという見方もできる．

2．ANCA血管炎とNETs（図1）

図1

ANCA関連血管炎におけるNETsの自己免疫学的関与

AAVは，ANCA産生を特徴とする全身性血管炎症候群で，急速進行性糸球体腎炎（rapidly progressive glomerulonephritis: RPGN）や肺出血を呈する重篤な疾患群である．病理学的には肺，腎臓，末梢神経，腸管など多臓器の小～中サイズの動脈においてほとんど免疫沈着を伴わない（pauci-immune）一次性の全身性壊死性血管炎である．全身型の多発血管炎性肉芽腫症（granulomatosis with polyangiitis: GPA），顕微鏡的多発血管炎（microscopic polyangiitis: MPA），好酸球性肉芽腫性多発血管炎（eosinophilic granulomatosis with polyangiitis: EGPA），さらに臓器限局型の腎限局型血管炎（renal-limited vasculitis: RLV）に細分化されている．

AAVが発見された当初は，約90％の患者が早期に死亡していたが，この30年間で寛解導入のための強力な治療法として，ステロイドに加えシクロホスファミドとリツキシマブによる治療が確立したことで約90％の患者が長期生存できるようになった．しかし一方で，AAV患者の生存期間が長くなったことにより合併症や薬剤による有害事象が注目されることになった^{16, 17）}．

AAVの特徴として好中球細胞質のミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase: MPO）とプロテイナーゼ3（proteinase 3: PR3）に対する自己抗体が患者の血中から検出されることは古くから知られていたが，2004年，BrinkmannらによりNETsが発見されMPOとPR3がいずれもNETs内に存在してANCAの形成に関与している可能性が示唆された^18）．続いて2009年にKessenbrockら^19）によりAAVにおけるNET形成の役割が明らかにされ，その免疫学的意義が改めて脚光を浴びることとなった．AAV患者は，循環中のNETsのレベルが高く，AAV患者の腎組織生検標本における壊死性病変にNETsの存在が確認されている．これらのNETs構造は高い免疫原性を持ち，B細胞の活性化や自己抗体の産生など適応免疫反応を引き起こす．それではNETsはどのようにAAV発症に関与しているのであろうか？　本来生体防御機能として放出されたNETsは，血中のDNaseにより即座に分解されてその生体への有害性が制御される．一方AAV患者においては過剰なNETs形成は，ANCA産生の抗原を提供するだけでなくNETsに関連して放出されるヒストンやMMPの細胞毒性により，内皮細胞に損傷を与える．

AAVの患者は静脈および動脈の血栓症を発症するリスクが2～3倍高く，AAVの活動期のみならず寛解期にも発生する．静脈血栓性イベントとしては深部静脈血栓症（deep vein thrombosis: DVT），肺血栓塞栓症（pulmonary thromboembolism: PTE）が代表的であるが，心血管疾患（cardiovascular disease: CVD）や冠動脈疾患（coronary artery disease: CAD）につながる動脈血栓イベント（arterial thromboembolism: ATE）もAAV患者では増加する．そのメカニズムとして活性化好中球から放出されるNETsが，組織因子を発現するだけでなく，ヒストンやFXIIにより血栓形成を促進することが挙げられる．また，AAVによる腎障害がある患者では血栓イベントのリスクが高い^{20, 21）}．多くの研究では静脈血栓塞栓症（venous thromboembolism: VTE）のリスク上昇が報告されているが，寛解期のAAVの末梢血でも血栓形成能が高まると報告されている^22）．また，好中球の活性化はAAVの重要な病原性として認識されているが，特に，腫瘍壊死因子α（tumor necrosis factor: TNF）などの炎症性サイトカインによって活性化されたAAVの好中球はPR3やMPOの顆粒を細胞膜上に発現している．これらの顆粒は，抗PR3や抗MPO抗体によって認識され，好中球の脱顆粒やNETs産生を引き起こすことができる^23）．これらのNETsはさらなるPR3やMPOなどの持続的な供給源となり，ミエロイド樹状細胞への提示を可能にしている^24）．このように，ANCA産生におけるNETsの関与が注目を集めているが，ANCA産生の抗原源は他にもある可能性がある．例えば，PR3（PRTN3とも呼ばれる）の逆鎖には，ある種の黄色ブドウ球菌のタンパク質と相同性を示すペプチドがコードされているという擬態仮説がある．この場合，感染に対する免疫反応によって抗体が生成され，この抗体は宿主のPR3と交差反応するとともに，PR3抗体自体にも抗イディオタイプ結合することになる^25）．

ANCA関連血管炎における血管炎症状は，出血と血栓症でありthrombo-hemorrhagic inflammationを呈する．興味深いことに，これらの患者の血栓にはNETsが豊富に含まれている．ANCA関連血管炎患者においてNETsに活性化された組織因子が発現していることが示されており，本疾患の血栓形成傾向に関与している^26）．また，前述のようにヒストンのような他のNETs成分は，血小板依存的に血栓形成をさらに増加させる．Neutrophil elastase（NE）によりtissue factor-pathway inhibitor（TFPI）という凝固を抑制する分子が局所的にタンパク分解される^{9, 13）}．我々は，血管炎における血栓形成におけるNEの重要性を報告している^27）．

低密度顆粒球（low density granulocyte: LDG）はSLEだけでなくAAV患者でも確認されておりPR3とMPOを含むNETsを自発的に産生する．AAV患者のこれらのLDGは，疾患活動性の増加やリツキシマブによる治療に対する反応の低下と関連する．NETsはまた，代替補体経路を活性化しAAVの病因に寄与していることも知られている．

前述の抗菌ペプチドLL37の発現量は，AAVにおける全身性および腎臓の炎症の活動性と関連しており^28），また，AAVでは，NETsはTLR-9依存的にpDCと自己反応性B細胞を活性化する^{19, 29, 30）}．活性化されたpDCはIFN-αとIL-8を分泌し，活性化したB細胞はANCAを産生する．最近では，これらのANCAがNETs形成の誘導因子であると想定され，ANCA自体は好中球のオートファジーを誘導し，NETosisを促進する．このように血管炎ではANCAとNETs産生の間に持続的な悪循環が存在し，感染症などのイベントによって増強される^19）．また，ANCAの親和性とNETの形成が密接に関係していることを示す報告が多いが，AAV患者において，NETは病気の重症度とは関係ないとする報告もある．

3．SLEとNETs（図2）

図2

SLEにおけるNETsの自己免疫学的関与

SLEは，遺伝的，環境的，免疫学的な多因子が発症に関与し，免疫学的自己寛容性（トレランス）が破綻することにより病原性自己抗体が産生されることを特徴とする自己免疫疾患であり，腎臓や皮膚，消化管や神経系などの多臓器に重篤な障害を呈する．SLE患者は，血清中に高レベルの抗リボヌクレオタンパク質抗体や抗DNA抗体を有しており，これらの抗体産生メカニズムとしてNETsの関与が候補にあがっている^31）．そのメカニズムは複雑であるが，最近10年間の重要な役者としてDNase，LDGとミトコンドリアDNA（mtDNA）が脚光を浴びてきた経緯がある．

2009年HakkimらはSLE患者の血清は，健常対照者の血清に比べてNETsの分解効率が低く，このSLE患者におけるNETsクリアランス不足は抗NET抗体の高い抗体価や腎機能と相関することを報告した ^32）．血清中のDNase1阻害物質の増加，DNase1遺伝子の稀な突然変異，DNase1のNETへのアクセスを阻害する抗DNase1抗体の存在が，DNase1の活性低下の原因と考えられ，SLEとNETsを結びつける大きな転機となった^32）．

一方，SLE患者には健常者には見られない独特のLDG集団が存在する^{33, 34）}．LDGは，自発的にNETを産生する能力が高く^35），そのNETには健常人の好中球NETよりも多くの病原性自己抗原が含まれているため組織の損傷が増え，これによりpDCが活性化されて，より多くのI型IFNが放出される^36–38）．

ミトコンドリアは細胞の発電所であり，酸化的呼吸によってエネルギーを供給する．しかし，細菌に似ているためか，細胞外に排出されたミトコンドリアは炎症を促進する．哺乳類では，ミトコンドリアの呼吸鎖とNADPHオキシダーゼの両方が独立して活性酸素（reactive oxygen species: ROS）の生成に寄与している^35）．NADPHオキシダーゼを遺伝的に欠損している慢性肉芽腫症の患者は，これまでROSの産生の主要な酵素と考えられてきたNADPHオキシダーゼが機能しないにも関わらずSLEを発症することから，本症においてミトコンドリア呼吸由来のROSの重要性が浮かび上がってきた．またマウスSLEモデルではNADPHオキシダーゼを欠損させるとより重篤な疾患を示す^39）．これを基にLoodら^35）は，CGD患者のLDGではNADPHオキシダーゼが存在しなくても自発的なミトコンドリア呼吸でROSが十分に生成されることを確かめた．またLDGに由来するROSのレベルは，対応する患者I型IFNのレベルと相関していた．この報告は，ミトコンドリアがNETosisを促進することを確認しただけでなく，ミトコンドリア由来のNETosisがSLEを助長する病理学的要因であることを証明し，この領域にブレイクスルーをもたらした．彼らは，SLE患者に検出される自己抗体であるリボヌクレオプロテイン免疫複合体（ribonucleoprotein immune complex: RNP IC）で好中球を刺激してミトコンドリアROS生成を促したところ，ミトコンドリアが低分極化して細胞表面に移動し，さらにROSがmtDNAを酸化させた．この酸化mrDNAをマウスに注射すると，炎症とI型IFNの産生をもたらした^40）．mtDNAがどのようにしてミトコンドリアから排出されるのかは不明であるが，これらのデータは，mtDNAがNETosis中に酸化され，この酸化がSLEにおけるサイトカイン産生の一貫した引き金になることを示唆している．また，SLE患者の免疫複合体の形で循環しているクロマチンにはLL37が含まれている．LL37はpDCのTLR9を活性化し，IFN-αの合成を誘導し，核酸をヌクレアーゼによる分解から保護する^41）．さらに，抗mtDNA抗体はSLE患者の血清中で上昇しており，抗体レベルはIFNスコアや疾患活動性と相関し，mtDNAを含む免疫複合体は核のdsDNAを含む免疫複合体よりも多くのIFN-αを誘導したという．最近，ミトコンドリア呼吸鎖複合体Iを選択的に阻害し，NADPHオキシダーゼ活性を低下させる薬剤として^42）メトホルミンはSLE治療の新たな選択肢として注目されている．メトホルミンはmtDNA-pDC-IFNα経路をダウンレギュレートする効果を示し，PMAによるNET形成とCpG刺激によるpDCのIFNα生成を減少させ，SLE治療の新たな選択肢として期待されている^{43, 44）}．

4．自己免疫疾患の治療標的としてのNETs

RAおよびSLEのマウスモデルにおいて，NADPH-オキシダーゼ複合体を標的としてノックアウトしNETosisを阻害すると，NADPHオキシダーゼが機能しているRAおよびSLEのモデルよりも重篤な疾患になる^39）．また，NADPHオキシダーゼの遺伝子異常を有する患者は，自己免疫疾患のリスクが高い．対照的に，N-アセチルシステイン（N-acetylcysteine: NAC）などのROSスカベンジャーは，SLE患者の疾患予後を改善した．ミトコンドリアの活性酸素生成に特異的なスカベンジャー（MitoTEMPO）をin vivoで投与すると，SLEマウスモデルでは，疾患の重症度とI型IFN反応が低下し，骨髄好中球による自発的なNETosisが減少した^35）．NETosisをブロックする方法として，NADPHオキシダーゼの破壊や酸化剤の阻害を行うことのもう一つの複雑さは，これらのメカニズムが，重篤な感染症を含むCGD様の症状をもたらす可能性があることである．最近報告された，活性酸素の産生を阻害しない内因性のNET阻害剤Signal inhibitory receptor on leukocytes-1（SIRL-1）は，好中球からのNETの放出を抑制したが，好中球の貪食作用，酸化バースト，黄色ブドウ球菌の殺傷作用には影響がなかった^45）．

NETsを阻害するもう一つの有望なターゲットは，PAD4の阻害である．PAD4は，関連する酸化的バーストに影響を与えることなくNETsを阻害する．PADの阻害剤（例えば，Cl-アミジンやBB-Cl-アミジン）やPAD4の欠損は，SLEマウスモデル^46）の疾患の進行を遅らせるが，PAD4の阻害による副作用として感染症の増加が考えられる．前述の阻害剤はPAD4に特異的ではなく，すべてのPADアイソタイプを標的にしている．最後に，MPOもまたNETsの産生に関係しており，PF1355と呼ばれるMPOの阻害剤は，この疾患のマウスモデルにおいて血管炎を減少させた^47）．

NETsの阻害剤としておそらく最もよく使われているのはDNase1であるが，これはNETの産生を阻害するのではなく，NETの構造を解体するものである．利点としては，この薬剤が臨床的に使用されており，毒性を示さないことである．DNase1を投与すると，SLE^48）のマウスモデルでNETが破壊され，疾患の重症度が低下した．しかし，過去に行われたループス患者を対象とした臨床研究では，組換えDNase1を投与しても，血清マーカーや疾患に変化は見られなかった^49）．自己抗体が形成された後にNETを排除することは，すでに手遅れなのかもしれない．さらに，DNase1はDNAを分解するが，ヒストンやエラスターゼなど，血管壁に付着して炎症を起こし続ける可能性のある成分にはほとんど作用しないことが最近明らかになっている^50）．

5．まとめ

NETsは当初の予想を超えて，自然免疫のみならず獲得免疫，炎症，血栓など様々な病態に関与する極めて重要なメディエータであることが判明してきた．NETsは新たな治療標的として，従来の治療と組み合わせることにより難治性であった疾患の治療戦略にブレイクスルーをもたらすかもしれない．

著者の利益相反（COI）の開示：

その他の報酬（大塚製薬，第一三共，中外製薬，持田製薬，エーザイ，あゆみ製薬，マルハニチロ）

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