GONAD：採卵，顕微注入，移植を要しない新規ゲノム編集マウス作製法

抄録

【目的】近年，CRISPR/Cas9系を含めたゲノム編集技術の開発によって，簡便にノックアウト（KO）マウス等のゲノム編集マウスを作出できるようになってきた。現行法では，（1）過排卵処理を施した雌マウスを雄マウスと交配して受精卵を採取する，（2）CRISPR関連核酸を受精卵へ直接顕微注入する，（3）顕微注入処理した胚を偽妊娠マウスの卵管へ移植する，という3つのステップを経て作製する方法が一般的である。しかしながら，これらは熟練した技術とmicromanipulatorという高価な設備を必要とするため，誰もが容易に実施できる環境にある訳ではない。そこで我々は，採卵，顕微注入，移植の手間を省くことが可能な，新規ゲノム編集マウス作製法「Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery （GONAD）法」を考案した。【方法】麻酔処置を施された妊娠雌マウスから2細胞期受精卵を有する卵管を体外に露出させ，ガラスピペットを用いてCRISPR関連核酸溶液を卵管内に注入し，その後，直ちに卵管全体に対し電気穿孔法を施す。術後，卵管を雌マウスの体内に戻し，そのまま発生させる。【結果】本手法の妥当性を確認するために，まず，本技術によってRNA導入が可能であるかを検証した。GONAD法を用いてeGFP mRNAの導入を試みたところ，卵管上皮細胞および着床前胚でのeGFPの発現が観察された。そこで，次にCRISPR関連RNA（Cas9 mRNAとsgRNA）の導入を試みた。その結果，着床前胚において複数の内在性遺伝子，およびeGFP遺伝子のKOに成功した。また，着床後胚においてもeGFP遺伝子のKOにも成功した。これらの結果から，卵管内の受精卵に核酸を直接導入することにより，採卵や顕微注入，移植という一連の高度であるが，煩雑な工程を全てスキップしてゲノム編集マウスを簡便に作製できることが示された。