Rubisco大サブユニットを部位特異的に分解する葉緑体プロテアーゼの精製と同定

抄録

　私たちは、暗所に静置したコムギ葉緑体の破砕液において、Rubisco 大サブユニット（LSU）がPhe⁴⁰-Arg⁴¹間で切断され44 kDa の分解断片を生ずることを先に報告した（Kokubun et al., Plant Cell Physiol., 43, 1390-5, 2002）。本研究では、このLSUの分解を担う葉緑体プロテアーゼの精製と同定を目的とした。
　分解を担うプロテアーゼ活性を特異的に検出するために、LSUの切断部位周辺のアミノ酸配列をもとに消光性蛍光ペプチド（Nma-LAAFRVSK(DNP)rr-NH₂）を作成し、これを基質として用いた。ホウレンソウの新鮮重500 g から可溶性タンパク質を抽出し、硫安分画に続き、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びゲルろ過により、最終的に15 μg の精製タンパク質を得た。最終精製画分のプロテアーゼ活性はEDTAやo-phenanthrolineによって抑制された。SDS-PAGEの結果、この画分には2種類のポリペプチド(MW 80 kDa, 103 kDa)が存在したため、これらを単離した後、それぞれの部分アミノ酸配列を決定した。そのうち103 kDa のポリペプチドの内部アミノ酸配列は、シロイヌナズナでその存在が知られている金属プロテアーゼの一つとその配列において一致した。