Periodontitis is one of the most common osteolytic inflammatory diseases in humans. Formation of a periodontal bacteria-associated biofilm is thought to be a trigger for the development of periodontitis, but it is not believed to be sufficient by itself to sustain the disease, as compromise of the host immune response is critical for inflammatory tissue breakdown and disease progression. Macrophages play an important role in the immune response both during the initiation and resolution of the inflammation. Macrophages are broadly classified into two phenotypes, pro-inflammatory M1 and wound-healing M2 cells. Since M2 macrophages contribute to the tissue-remodeling process, effective M2 macrophage induction would provide a favorable environment for resolution of the inflammation and tissue regeneration.
Mesenchymal stem cell (MSCs) have been applied for the purpose of inducing tissue regeneration and treating autoimmune disorders. Specifically, MSC-derived exosomes have attracted much attention for cell-free MSC therapy, because of their ability to transport vesicular cargo molecules, including growth factors and regulatory miRNAs, which mediate cell-to-cell communication. As compared with other somatic MSCs, gingival tissue-derived MSCs (GMSCs) have the unique capacity for pronounced immunoregulation and secrete large amount of exosomes. Recent studies have indicated that appropriate preconditioning of MSCs with disease-related stimuli can optimize the contents of the exosomes to efficiently support the repair of specific diseases.
In this review, we report the therapeutic effects of TNF-α-preconditioned-GMSC-derived exosomes on periodontal disease and discuss the underlying molecular mechanisms. Our study revealed that TNF-α-enhanced exosomal CD73 expression leading to anti-inflammatory M2 macrophage polarization and exosomal miR-1260b is an important negative regulator of osteoclastogenesis. Accordingly, our findings may pave the way for the development of a novel therapeutic strategy for patients with periodontitis.
歯周炎は口腔内の歯周病細菌によって引き起こされる慢性炎症で，歯を支える歯槽骨の吸収を特徴とする。しかし通常の歯周炎治療は，細菌性プラークと歯石除去を中心とした原因除去療法が中心である。そのため，歯周炎で喪失した歯槽骨の再生はほとんど期待できず，病状の進行を食い止める対処療法であるのが現状であった。
このような状況を打開すべく，歯周組織再生療法の開発が行われてきた。現在に至るまで様々なオプションの開発を経ながら，一定の成果があがってきているものの適応症は限定的である。一方，近年注目されている幹細胞を中心とした細胞移植による細胞治療はめざましい成果をあげつつも，必要設備・コストなどの面から，歯科臨床への普及には多くのハードルが課せられているのが現状である。いずれの治療においても，統一的見解に基づいた分子基盤の確立は，安全性とさらなる治療効果の向上に必須である。
間葉系幹細胞MSCs（Mesenchymal stem cells）は，細胞治療の代表的ソースとして利用されている。近年，従来の細胞治療の概念に加え，幹細胞からの分泌因子による効果が注目を集めている。すなわち，MSCsによる疾病治療効果には，MSCsから分泌されるエクソソームと呼ばれる細胞分泌小胞が中心的役割を果たし，内包されるmiRNA（microRNA）を介した遺伝子発現制御が組織再生に重要であることが明らかとなりつつある1)。
本稿では，我々が独自に研究を進めてきた歯肉幹細胞（gingival tissue-derived MSCs：GMSCs）が分泌するエクソソーム（exosome）を応用し，特に歯周組織における炎症の起点と収束のコントロールに重要なマクロファージを標的とした治療戦略について概説する。
細胞治療の代表的なツールであるMSCsは骨髄や脂肪など，生体の中胚葉性組織に由来する体性幹細胞である。組織再生に必須の多分化能のみならず，抗炎症作用，障害部位への集積能など様々な能力を有することから，MSCsを用いた治験は2000年以降増加の一途をたどっている2)。全身性に投与されたMSCsは障害部位へ集積し，免疫抑制効果や組織再生効果を持つといわれる3)。しかしながら，静脈から投与されたMSCsの大部分は肺静脈に滞留していることが確認されていることから，近年ではMSCsの分泌能による治療効果に注目が集まってきている4)。実際，未分化MSCs移植による治療効果の多くの報告では，MSCが目的組織の細胞へと直接分化することなく治療効果を発揮することが報告されてきた5)。すなわち，MSCsは再生目的組織の機能そのものを代替すると言うよりはむしろ，障害を受けた組織の再生を強力にサポートすることで治療効果を発揮している可能性が示唆されている。そして，その中心的役割を担う細胞外分泌物が，エクソソームである。
エクソソームは直径100 nm程度の細胞分泌小胞で，血液・唾液などの体液に多量に含まれており細胞間の情報伝達を担っている。2007年にエクソソーム内にはmiRNAが豊富に含まれることが発見され，このmiRNAがエクソソーム由来細胞の情報伝達機構の中心を担っていることが明らかにされたことから6)，それらを標的とした治療法の確立を示唆する成果が報告されつつある7,8)。
このように，MSCs由来エクソソームによる治療効果には，抗炎症や組織修復促進のみならず，再生効果も報告されつつある。その主な機序は，エクソソーム含有miRNAからの伝達を介した遺伝子発現制御であることされる。一般に組織再生を誘導するエクソソームの動態経路は以下の2つに大別される。① 損傷細胞から分泌されたエクソソームをMSCsが取り込み，損傷組織の細胞へ分化。② MSCsから分泌されたエクソソームが損傷細胞に取り込まれ，組織の再生シグナルを活性化。すなわち，MSCsと障害組織由来の細胞の双方向からのエクソソームを介したクロストークにより，組織再生が誘導されると考えられている1)。
エクソソームは体液中で非常に安定であるとともに，内包されるmiRNAはエクソソームの脂質二重膜に守られており分解されない。そのため長期保存が可能であり，臨床応用上の操作性の点でも優れているうえに，法令上細胞治療に該当しないため同種であれば汎用的に使用できる。さらに，エクソソーム治療を担うmiRNAを効果的に誘導することが可能になれば，最小限のMSCsから効率的な治療効果を誘導するコストパフォーマンスに優れた安全性の高い次世代幹細胞治療の開発につながる。
GMSCsは筆者の共同研究グループにより2009年に単離された9)。歯肉組織（有棘層）に存在するため，歯科領域の研究者にとって採取が容易であるという利点があげられる。GMSCsはMSCsとしての多能性を有すると同時に，制御性T細胞（Treg）の誘導による免疫制御能に優れている9)。また，細胞増殖が速くテロメレース活性が高いうえに非腫瘍形成性であることから，治療用の細胞培養にも有利である10)。さらに特筆すべきことに，骨髄など他組織由来のMSCsと比較しエクソソームの分泌量が多いという特徴を有する11)。GMSCs由来エクソソームは継代過程P5までの培養上清20-30 mLから十分採取可能なため，効率的で実現性の高い治療法として注目に値する。
筆者らは九州大学医系地区倫理審査委員会の承認を得て（29-124号），当科患者の歯周外科時に採取した歯肉組織からGMSCsを単離し，MSCsの定義12)に必須であるコロニー形成能，MSCマーカー発現，多分化能（脂肪・骨・軟骨）の評価を確認している13)。MSCsのなかでもエクソソーム分泌量の多いGMSCsは，通常外科処置後廃棄される歯肉片から採取するためコストパフォーマンスに秀でている。GMSCsは3-4 mm3程度の歯肉から単離可能で，最小1歯の歯周外科手術から対象となる。歯肉は生体内で最も再生速度の速い組織であるため，健常歯肉からも採取後の欠損を生じない。そのため，乳歯歯髄や歯根膜由来幹細胞と比較してGMSCsは採取が極めて容易であり，なおかつ抜歯対象歯の存在に左右されないという利点を有する。
慢性炎症疾患である歯周炎の発症・進行と創傷治癒には，歯周組織に浸潤したマクロファージの機能が深く関わっており，歯周炎の各ステージにおいて異なる表現型で存在する14)。マクロファージは，炎症誘導型のM1マクロファージと創傷治癒型のM2マクロファージの2つの表現系に大別され，それぞれTh1/Th2タイプの応答性を有している（図1）。炎症誘導型のM1マクロファージは，LPSもしくはIFN-γのようなTh1サイトカインにより活性化され，iNOS，ROS，TNF-α，IL-1β，IL-6などの炎症誘導性因子を産生する。対照的に創傷治癒型のM2マクロファージは，Th2サイトカインであるIL-4，IL-13によって誘導され，IL-10やTGF-β，VEGFなどの抗炎症性サイトカインを産生し，血管新生やスカベンジングを促進することで，炎症応答を収束させ組織修復へと転換していくフェーズにおいて中心的役割を担っている15)。すなわち，歯周組織破壊には炎症性（M1）マクロファージが主に関与する一方で，歯周組織再生の成功には，bFGFをはじめとした成長因子を分泌する修復型（M2）マクロファージの誘導が不可欠であるとされる。
歯周組織におけるM2マクロファージの役割について，筆者らはエナメル基質タンパク（EMD）の主成分であるアメロジェニンが，M2マクロファージの誘導を介して，抗炎症効果の一端を担うことを報告した16)。また，歯根膜幹細胞（PDLSCs）がM2マクロファージとの共培養により歯周組織再生に重要なセメント芽細胞へより分化することも報告もされている17)。さらに最近では，M2マクロファージの分泌するエクソソームにもマウス歯周炎モデルでの骨吸収抑制効果が報告されており18)，M2マクロファージ誘導による歯周炎の抗炎症効果のみならず，歯周炎組織再生促進効果のエビデンスが構築されつつある。
歯周炎における炎症の起点と収束をつかさどるマクロファージ
歯周炎組織におけるマクロファージは，炎症誘導型のM1マクロファージと修復型のM2マクロファージに大別される。M1マクロファージが炎症の惹起と進展に関与するのに対し，M2マクロファージは炎症の収束と組織修復への転換に重要な役割を担っている。
そこで筆者は，GMSCsの有する抗炎症効果がエクソソームにも備わっている場合，M2マクロファージ誘導効果があるのではとの仮説を抱き検証を行った。そのために，GMSCsの培養上清からエクソソームを精製し，共焦点顕微鏡撮影で蛍光標識したエクソソームが経時的にマクロファージへ取り込まれることを観察した13)。次に，GMSCs由来エクソソームでマクロファージを刺激してM2マクロファージのマーカー発現をフローサイトメトリーで確認したところ，IL-4/13刺激と同様に有意なM2マクロファージ誘導効果が確認された。さらに，MSCsが疾患に由来する刺激に応じて治療効果が増幅するという報告19)に着眼し，GMSCsに種々の炎症性刺激を加えた後に培養上清からエクソソームを回収し，M2マクロファージ誘導能を比較した。その結果，TNF-α刺激が最も効果的にM2マクロファージを誘導するだけでなく，M1マクロファージからM2マクロファージへの転換能も有することを確認した13)。
次にin vivoで検証を行うため，マウスの背面皮下に表皮欠損を作成し，創傷治癒モデルを用いて検証した。創傷部位において，M2マクロファージの誘導は創傷治癒の促進に必須であることが知られている20)。GMSCs由来エクソソームを局所投与して経時的な創傷治癒効果を比較したところ，無刺激エクソソーム群（Exo-Ctrl）はコントロール（PBS）群と比較して有意な創傷治癒が認められたが，TNF-α刺激後エクソソーム群（Exo-TNF）ではさらに創傷治癒の促進効果が確認された13)。このときの組織切片においても，TNF-α刺激後エクソソーム群はM2マクロファージの早期集積を認め，同時に炎症性細胞浸潤の早期減少および創傷部位の上皮化の亢進が観察された。以上から，GMSCsへのTNF-αによる炎症刺激でネガティブフィードバック機構をかけることにより，M2マクロファージ誘導の増強効果が確認された。
GMSCs由来エクソソームによるM2マクロファージ誘導を介した歯周炎治療の可能性を検証するため，絹糸結紮誘導性マウス歯周炎モデル21)での歯槽骨吸収抑制効果について検証した13)。歯肉へのエクソソーム注入（Exo-Ctrl）により歯槽骨吸収の抑制が認められたが，TNF-α刺激後エクソソーム群（Exo-TNF）ではさらに骨吸収抑制効果の改善が確認された。また組織像においても，TRAP陽性破骨細胞数の減少が認められた。
近年，M2マクロファージのIL-4/13刺激以外の誘導経路について，アデノシン（ADO）およびその受容体を介した分化経路が報告されている22)。以前より，M1マクロファージ，M2マクロファージという二つの状態の変化ではすべての免疫応答と疾患との関係は説明がつかないことから，他の免疫細胞同様にサブタイプの存在が提唱されていた。現在では，M2マクロファージはさらにM2a～M2dの4つのサブタイプの分類が確立されている。IL-4/13で誘導誘導される代表的なM2aマクロファージに対し，M2dマクロファージはADO刺激を受けたM1マクロファージから誘導される23)。ADOは抗炎症分子であり，炎症反応を誘導するアデノシン三リン酸（ATP）から細胞膜酵素CD39/CD73による脱リン酸化カスケードを経て産生されるが24)，CD73は代表的なMSC陽性マーカーとしてGMSCsにも恒常的に発現している。
筆者はGMSCsへのTNF-α刺激によりCD73mRNA発現が亢進することに着目し，エクソソームにおけるCD73の発現を確認した。その結果，GMSCs由来エクソソームには無刺激でもCD73が恒常的に発現しており，TNF-α刺激によりその発現が増強することを発見した13)。一方，エクソソームをCD73中和抗体で処理するとM2マクロファージ誘導が有意に阻害された。すなわち，GMSCsへのTNF-α刺激により誘導されるエクソソームCD73がM2マクロファージ誘導に重要であることが明らかとなった。
以上から，TNF-α刺激で高発現したエクソソームCD73がADO産生を促進することで，歯周炎組織で優位な炎症性M1マクロファージをM2dマクロファージに転換させ，抗炎症効果を発揮する可能性が示唆された。
GMSCs由来エクソソームによる骨吸収抑制機構の分子機構について検討するため，エクソソーム内包miRNAについてマイクロアレイ解析を行った。九州大学病院歯周病科における患者3名から単離したGMSCsについて，それぞれTNF-α刺激有無に分けての培養上清からエクソソームを回収した13)。これら3種類のGMSCsにおいて，TNF-α刺激で共通して発現亢進がみられたエクソソーム内包miRNAのうち，特に発現誘導が上位3位に含まれていたmiR-1260bに着目した。現在までのmiR-1260bの機能に関する報告は数少ないが，歯周炎患者の歯肉組織における発現が減少しているとの報告がある25)。そこで，エクソソームを介した歯周組織へのmiR-1260b供給が及ぼす影響を検証するため，標的遺伝子をデータベース検索した。その結果，miR-1260bの標的遺伝子には数多くの骨吸収関連遺伝子を含んでいることが明らかとなった。miRNAによる遺伝子制御は，一般的にmRNAの3’側非翻訳領域（3' untranslated region：3'UTR）への相補的配列への結合を介した遺伝子発現抑制として知られている。すなわち，GMSCs由来エクソソームに内包されるmiR-1260bが，歯周炎における歯槽骨吸収の抑制に作用しているのではないかとの仮説を抱いた。
歯周組織におけるRANKL/OPG（receptor activator of NF-κB ligand / osteoprotegerin）比は歯槽骨吸収の指標として広く認知されており，歯根膜細胞（periodontal ligament cells：PDLCs）が密接に関与していることが明らかとされている26)。そこでGMSCs由来エクソソームが，PDLCsにおけるRANKL/OPG比に及ぼす影響について検証した。PDLCsへのLPS刺激によるRANKL/OPG比の上昇はExo-Ctrlで抑制され，Exo-TNFではさらに減少した13)。一方，Exo-TNFで高発現するmiR-1260bのデータベース上の標的遺伝子には，Wnt関連遺伝子が数多く含まれていた。その中でも最もスコアの高かったWnt5aは，RANKL発現を誘導することが報告されているが27)，PDLCsにおいてもRANKL発現がリコンビナントWnt5a刺激で亢進し，Wnt5aノックダウンにより阻害されることを確認した13)。PDLCsへのmiR-1260b導入によりWnt5a発現が抑制されたことから，miR-1260bはWnt5aの抑制を介してRANKL発現阻害に関与していることが示唆された。さらにRANKL発現シグナルについて検証した結果，Exo-TNFおよびmiR-1260bによりJNKシグナルの特異的阻害が確認された13)。
以上より，TNF-α誘導性miR-1260bはWnt5aおよびJNKシグナルの阻害を介して，PDLCsにおけるRANKL発現を抑制することが明らかとなった。
MSCs由来エクソソームは，HLA-DR陰性で拒絶反応のリスクがないうえ，同種幹細胞ではないことから倫理的なハードルも低い利点を有する。本研究において，GMSCsへのTNF-α刺激によるネガティブフィードバック機構により，エクソソームの抗炎症能が促進されることで抗炎症性のM2マクロファージが誘導され，さらに内包されるmiR-1260bによる骨吸収抑制効果が確認された13)（図2）。M2マクロファージは炎症応答を収束させ組織修復へと転換していくフェーズにおいて中心的役割を担っている。そのため，GMSCs由来エクソソームは歯周治療に必須の炎症の収束に加え，組織のリモデリングと再生を包括的に誘導する可能性をも秘めており，歯周組織再生に大きなアドバンテージがもたらされると考えられる。今後は，TNF-α刺激GMSCs由来エクソソームを応用した歯周炎治療のみならず，歯周組織再生効果についても検証を予定している。
また，本研究の後続研究としてGMSCsへの前処理条件について再検証した結果，TNF-α/IFN-αによる共刺激によりエクソソームによるM2マクロファージ誘導能がさらに増強されることが確認された28)。さらに，miR-1260b単独で骨吸収抑制機構を検討することで，新規核酸製剤としての可能性についても検証を行っている。
GMSCs由来エクソソーム内包miRNAについてIngenuityⓇ Pathway Analysis（IPA™）でのオミックス解析を行ったところ，生活習慣病および難治性疾患への応用が期待できるパスウェイが多数，上位に上がっていることを確認している。今後は，歯肉幹細胞由来エクソソームが有するmiRNAを介した抗炎症作用の機序解明を通して，将来的にヒトを対象とした研究に向けた分子基盤を構築し，歯周病治療にとどまらず「口腔から全身の健康」に繋がる治療戦略への応用を目指したいと考えている。
歯肉幹細胞（GMSCs）由来エクソソームによる歯周炎治療戦略
GMSCsをTNF-α前処理して回収したエクソソーム（Exo-TNF）においてCD73とmiR-1260bの発現が増強する。エクソソームCD73はアデノシンの産生触媒を促進することでM1マクロファージからM2マクロファージへの転換を誘導し，歯周炎組織の炎症の収束と組織修復を促す。エクソソーム内包miR-1260bは歯根膜細胞（PDLCs）におけるWnt5aを介したRANKL発現阻害により，破骨細胞分化および歯槽骨吸収を抑制する。
稿を終えるに当たり，ご指導を頂きました九州大学大学院歯学研究院口腔機能修復学講座歯周病学分野 西村英紀教授に心より感謝申し上げます。また，現在までの研究の遂行において，日本学術振興会「頭脳循環を加速する戦略的国際研究ネットワーク推進プログラム」の支援で留学中にご指導頂いた米国ペンシルバニア大学のSongtao Shi教授，その他九州大学歯周病学教室の先生方に厚く御礼申し上げます。
今回の論文に関連して，開示すべき利益相反状態はありません。
