2025 年 37 巻 1 号 p. 27-32
多くの陸上植物は土壌中に根を伸ばし、様々な微生物と相互作用しながら生活している。ダイズなどのマメ科植物は根に根粒と呼ばれるコブ状の器官を形成し、土壌中の根粒菌と共生関係を築く。根粒菌の感染過程を理解する上で顕微鏡観察が有効な手法であるが、従来の根粒共生研究ではほとんどの場合、根を土から掘り出し観察するため、観察時に観察点で生じる一時的な現象を捉えるにとどまっていた。本稿では顕微鏡を用いた土壌中の根粒共生ライブイメージングのために我々が構築したRhizosphere Frame システムについて紹介する。根と根粒菌と土壌の空間情報を保持したまま根粒共生過程の連続観察を可能にする本システムは、土壌中でおこる植物と微生物のダイナミクスを解き明かす一助になると期待される。
Most land plants grow roots in the soil and interact with various soil microorganisms throughout their life. Legumes, such as soybeans, form symbiotic structures called root nodules through interaction with rhizobia. Microscopic observations have advanced our understanding of rhizobial infection processes. However, previous research has primarily relied on the destructive method of excavating roots from the soil. In this paper, we introduce the Rhizosphere Frame system, which we have developed for nondestructive observation of root nodule symbiosis in the soil. This system is expected to facilitate a deeper understanding of the dynamics of plant-microbe interactions in the soil environment.
植物は根から土壌中の水分や栄養分を吸収するとともに、根圏において様々な土壌微生物と相互作用している。マメ科植物と窒素固定細菌である根粒菌の間に成立する根粒共生は、根で起こる植物微生物相互作用の代表的な現象である。土壌中の根粒菌が放出する共生シグナルを感知した宿主植物は根毛を変形させて根粒菌を捕捉し、根粒菌が根の内部へと侵入するための通り道となる感染糸と呼ばれる管状の構造を形成する。また同時に根の皮層細胞が分裂し根粒原基が形成される。根毛の内部を伸長する感染糸が根粒原基へと到達すると根粒菌が放出され、根粒菌は根粒原基内の細胞に取り込まれる。その後、根粒原基は成熟した根粒へと発達し、根粒細胞内にコロナイズした根粒菌が大気中の窒素をアンモニアへと固定する (Oldroyd 2013, Roy et al. 2020)。
これまで蛍光タンパク質によって標識された根粒菌を用いた顕微鏡観察により、感染過程の理解が深められてきた (Gage et al. 1996, Stuurman et al. 2000, Gage 2002, Fournier et al. 2008, Ledermann et al. 2015)。一方で従来の根粒共生研究は植物を土から掘り出し根を洗浄して観察する破壊的な方法が主流であり、土壌と接触する根毛近傍での根粒菌の振る舞いや、根表面でのコロニー形成、コロニー形成から宿主植物への侵入に至る過程などの相互作用に重要な時空間情報が失われていた。感染過程のタイムラプスイメージングには寒天培地が使用されることがあるが、土壌中で起こる相互作用を完全に再現することは困難である。
植物は土壌から水分や栄養分を効率的に吸収するために、根の成長パターンを変化させる。環境変化に応答した根系の表現型可塑性を研究するうえで、土壌中の空間情報を維持したまま経時的に根の発達を観察するための非破壊的な根系計測技術が開発されてきた。土を詰めた透明の箱を用いて植物を栽培する根箱は土壌中の根の形態を非破壊のまま観察するための代表的な装置として知られている (Huck and Taylor 1982, Neufeld et al. 1989, Zhao et al. 2022)。またX線CT (Computed Tomography) やMRI (Magnetic Resonance Imaging) を用いることで、土壌中の根系を３次元的に可視化することが可能となった (Rascher et al. 2011, Mooney et al. 2012, van Dusschoten et al. 2016, Teramoto et al. 2020)。近年、発光ベースのレポーターを発現する植物を透明の容器で栽培しCCDカメラを用いて撮影することにより、土壌中で成長する根の構造と遺伝子発現パターンを同時に可視化できるGrowth and Luminescence Observatory for Roots (GLO-Roots) システムが開発された (Rellán-Álvarez et al. 2015)。またGLO-Rootsでは発光レポーターを発現するシュードモナス属細菌をシロイヌナズナに接種することにより、根における微生物の局在の根系スケールでの観察を可能にした。一方で微生物の感染動態の詳細を理解するためには、よりミクロなレベルでの観察が必要である。小八重らは土を詰めた薄いガラス底のシャーレ内でアーバスキュラー菌根菌（AM菌）を接種したイネを栽培し、顕微鏡を用いてシャーレの底を観察することにより土壌中でのAM菌と根の相互作用のライブイメージングを行った (Kobae and Fujiwara 2014)。さらに最近では、AMSlideと呼ばれるスライドガラスに似た大きさと形状の植物栽培装置の開発による共焦点顕微鏡を用いた土壌中のAM共生観察法が報告された (McGaley et al. 2024)。これらの手法では、レポーターを用いてAM共生特異的に発現する植物遺伝子を標識することにより、AM菌の感染動態を間接的に可視化している。
我々は顕微鏡を用いて土壌中でおこるダイズと根粒菌の相互作用を連続的に観察するため、根箱の厚みと大きさを実体顕微鏡の観察ステージにあわせて最適化した植物栽培装置Rhizosphere Frame （RhizoFrame, リゾフレーム）を構築した（図1a, Nishida et al. 2023）。リゾフレームは厚さ1mmの透明なアクリル板で構成された薄い箱型の容器である。アクリル板の間の5 mmの隙間に土を入れて根粒菌の培養液を注ぎ、ダイズの実生を移植した後、根を遮光するためのステンレス製のカバーを取り付け水入れに立てて植物を栽培した（図1b-d）。リゾフレームは水入れに設置することで60°に傾き、アクリル板に沿って安定的に根を伸ばすことができる。また、リゾフレームの底にはポリエステルメッシュで覆われた穴が空いており、植物の根をフレーム内に閉じ込めたまま、水入れに供給した水耕液をフレームの底から吸収することが可能である。栽培中の任意の時期にカバーを外して顕微鏡観察を行い、観察後は再び根を遮光して栽培を継続することができる。リゾフレームによって土壌中の根の伸長や根粒形成を非破壊のまま観察することが可能となった（図1e）。
図1 非破壊的な根粒共生観察のための植物栽培装置。 (a) リゾフレーム (b) リゾフレームを遮光するためのステンレスカバー (c) リゾフレームを立てるための水入れ (d) リゾフレームで栽培した14日目のダイズ。リゾフレームを水入れに立てると、60°に傾く。 (e) 栽培14日目のダイズ根と根粒。Bar: 3 cm。 Nishida et al. 2023より引用・改変。
蛍光タンパク質を用いた標識は、微生物の動態を観察するための有用な手法である。我々は根粒菌の局在を可視化するためにZsGreen、DsRed、tdTomatoの３種類の蛍光タンパク質をそれぞれ構成的に発現するダイズ根粒菌 Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110株を作出した（図2a, Nishida et al. 2023）。微生物の動態を追跡するためにはマーカーとして使用する蛍光タンパク質が根粒菌の細胞内に安定的に保持されなければならない。蛍光遺伝子を発現するプラスミドを細胞に導入する手法は根粒菌の標識にも広く利用されている (Cheng and Walker 1998, Stuurman et al. 2000, Shimoda et al. 2020)。一方Bradyrhizobiumのような特定の根粒菌種では、抗生物質による選抜がない場合プラスミドが急速に失われることが報告されている (Stuurman et al.2000)。そこで我々は相同組換えにより蛍光遺伝子を根粒菌染色体中のnifX遺伝子の下流に導入した。nifXは自由生活状態ではほとんど発現しておらず根粒共生後期の窒素固定時にのみ高発現する遺伝子であるため (Pessi et al. 2007)、根粒菌の生育や宿主植物への感染力には関与しないと考えられる。実際、ZsGreenやDsRedで標識した根粒菌株の増殖や根粒共生能力は野生型と同等であり、nifX下流領域への遺伝子導入は根粒共生に影響を与えないことが示唆された（図2b, c）。tdTomato株の根粒形成数は野生型よりもやや低下したが、作出した赤色系列の蛍光標識株の中で最も明るい蛍光強度を示した（図2a-c）。ダイズの成熟根粒はわずかに緑色の自家蛍光を示すため、強い赤系の蛍光を示すtdTomato株は単独の根粒菌の感染動態観察に適している。一方、ZsGreen株とDsRed株は同程度の感染力を示したため、根粒菌株同士の感染競合力の評価に使用できる。
図2 蛍光タンパク質を発現するB. diazoefficiens USDA 110株の作出。 (a) 野生株と各蛍光株 (ZsGreen、DsRed、tdTomato) の懸濁液。蛍光画像は、GFPフィルターとmRFPフィルターをそれぞれ同じ露光時間で撮影した。(b, c) 野生株および各蛍光株を接種した21日目のダイズの根粒形成 (b) および根粒形成数 (c)。Bar: 2 mm。 Nishida et al. 2023より引用・改変。
我々は蛍光根粒菌とリゾフレームを組み合わせてリゾフレームシステムを構築し、蛍光顕微鏡を用いて根粒共生のタイムラプスイメージングを行った（図3a）。DsRed株を接種した5日目のダイズ根では、根粒菌の局在を示す赤い蛍光が強く観察された領域において皮層細胞分裂が観察された。その後分裂した皮層細胞から形成された根粒原基内部へ根粒菌が侵入し、根粒原基が発達するとともに内部の根粒菌が感染領域を拡大していく様子が確認された（図3a 6, 8, 10日目）。このように本システムを用いることで、土壌中の根粒共生を非破壊のまま顕微鏡レベルで追跡することが可能となった。
土壌と根と根粒菌の3点を同時に可視化できることもリゾフレームシステムの利点のひとつである。我々の観察では蛍光根粒菌がバーミキュライト粒子の表面およびバーミキュライトに接触する根毛に局在する様子が確認された（図3b, c）。土壌は岩石、鉱物、堆積物、有機物などから構成されており (Carson et al. 2009, Uroz et al. 2015)、このモザイク状の組成が微生物の活動の場となる多様な微小環境を提供する (Hemkemeyer et al. 2018)。本観察では土壌としてバーミキュライトを使用したが、リゾフレームに入れる土壌を変更することで土壌の種類が根粒菌の感染に与える影響を解析することができる。
図3 リゾフレームシステムを用いたダイズと根粒菌の相互作用の観察。 (a) DsRed株（赤）を接種したダイズ根の感染5日目から10日目までの経時観察。Bar: 500 μm。 (b, c) ZsGreen株（緑）を接種したダイズ根とバーミキュライト粒子の観察。Bar: 200 μm。 Nishida et al. 2023より引用・改変。
自然土壌には様々な種類の根粒菌が存在しており、宿主植物への感染を争っている。根粒菌の感染競合力の評価には、複数の根粒菌を異なる蛍光タンパク質で標識し、混合して植物に接種し感染動態を追跡する手法が有効であると考えられる。そこで我々はリゾフレームシステムを用いてZsGreenおよびtdTomatoで標識したUSDA110株を等量ずつ合わせた根粒菌混合液をダイズに接種し感染過程を観察した（図4）。2種類の根粒菌を混合接種した場合、大部分の根粒にはどちらか片方の蛍光根粒菌のみが感染していたが、一部の根粒では両方の根粒菌株が感染している様子が確認された（図4a, 矢じり）。そこで一つの根粒に対して2種類の根粒菌が感染していく過程を追跡した（図4b）。感染7日目の根の表皮においてZsGreen株を含む感染糸（白矢じり）とtdTomato株を含む感染糸（開放矢じり）が、隣接する異なる根毛細胞で観察された。その後ZsGreen株が根粒原基内へ侵入して感染領域を拡大し、tdTomato株はやや遅れてZsGreen株の感染域を取り囲むように感染域を獲得した。今回の観察において２種類の根粒菌はそれぞれ異なる感染糸を介して宿主細胞に侵入していた。アルファルファなど一部のマメ科植物では異なる根粒菌株を含む単一の感染糸が形成されることが報告されている (Gage et al. 1996, Stuurman et al. 2000, Gage 2002)。一方我々の混合接種実験において観察された感染糸は全て単一の蛍光根粒菌株のみが占めていた。この観察結果はダイズの感染糸に関する過去の報告 (Ledermann et al. 2015) とも一致しており、ダイズの根粒菌感染の特徴であると考えられる。リゾフレームシステムでは非破壊かつ連続的に根圏でおこる感染競合を捉えることができる。今後本システムを用いて蛍光標識した様々な根粒菌を混合接種し、感染過程のどの時点でどのような感染競合が起こるのかを明らかにし、根粒菌同士の感染競合メカニズムの理解を深めたい。
図4 2種類の根粒菌株を混合接種したダイズの根粒共生観察。 (a) USDA110 ZsGreen株（緑）とtdTomato株（赤）の混合液を接種した14日目のダイズの根粒形成。根粒内に感染した根粒菌は蛍光によって区別できる。矢じりは両方の根粒菌が感染した根粒を示す。Bar: 1 mm。 (b) 根粒菌混合液を接種したダイズ根の感染7日目から14日目までの経時観察。右上の写真は7日目の破線領域の拡大を、矢じりは感染糸を示す。Bar: 100 μm（7日目）、200 μm（10、12日目）、1 mm （14日目）。 Nishida et al. 2023より引用・改変。
ここまではマメ科の代表的な作物であるダイズを用いた観察結果を紹介したが、リゾフレームシステムはダイズ以外の植物の観察にも利用することができる。例えばマメ科のモデル植物であるミヤコグサに蛍光標識したミヤコグサ根粒菌 Mesorhizobium lotiを接種した場合、先端が変形した根毛の中を伸長する長い感染糸（図5a）や、枝分かれした感染糸が根粒原基に侵入していく様子（図5b）が観察され、その後多数の成熟根粒の形成が確認された（図5c）。
つづいて我々はリゾフレームシステムを用いたレポーターアッセイの可能性を検証するため、テストケースとして根粒菌感染時のオーキシン応答を観察した。オーキシンは代表的な植物ホルモンのひとつであり、植物の様々な発生過程において細胞の増殖や分化を調節することが知られている (Zhao 2010)。根粒共生の制御においてもオーキシンの関与が報告されているが (Hirsch et al. 1989, Wasson et al. 2006, Plet et al. 2011, Rightmyer and Long 2011)、根粒共生過程においてオーキシンが作用する部位やタイミングは十分に特徴付けられていなかった。寿崎らは、オーキシンレポーターであるDR5::GFP-NLSを発現するミヤコグサを作出し、皮層細胞分裂に先立ったオーキシン蓄積が根粒原基形成に重要であることを明らかにした (Suzaki et al. 2012)。リゾフレームシステムを用いてDR5::GFP-NLSミヤコグサのタイムラプスイメージングを行った結果、根の一部の細胞でオーキシンの蓄積を示すGFPが発現し、その付近で短い感染糸が確認された（図5d 5日目）。その後感染糸が伸長し、根粒原基形成のための皮層細胞分裂と同調的にGFPの発現が強くなっていく様子が観察された（図5d 6, 8日目）。これらの結果は根粒菌感染と同期したオーキシンダイナミクスをリアルタイムで可視化しており、リゾフレームシステムを用いることで、自然環境により近い土壌中での根粒共生動態と遺伝子発現動態を連動させた経時的解析が可能であることを示している。先行研究から根粒共生制御に関与する様々な遺伝子が同定されており (Oldroyd 2013, Roy et al. 2020)、本システムを用いたレポーターアッセイによって、遺伝子発現制御と根粒共生現象の時空間的な関連性の理解を深めることができる。
図5 リゾフレームシステムを用いたミヤコグサと根粒菌の相互作用の観察。 (a-c) M. loti MAFF303099のDsRed株 （a: 赤, c）およびGFP 株（b: 緑）を接種したミヤコグサの観察。矢じりは感染糸を示す。 (d) リゾフレームシステムを用いた根粒共生過程におけるオーキシン応答の観察。DsRed株（赤）を接種したDR5::GFP-NLSミヤコグサの感染5日目から8日目までの経時観察。GFP（緑）はオーキシンの蓄積を示す。Bar: 100 μm (a)、200 μm (b, d)、1 mm (c)。 Nishida et al. 2023より引用・改変。
本稿では我々が構築した根粒共生の非破壊観察系リゾフレームシステムについて紹介した。リゾフレームシステムは土壌と根と根粒菌の空間情報を保持したまま、根の成長や根粒共生過程、遺伝子発現を経時的に観察することができる。また、異なる蛍光で標識した根粒菌を混合接種することにより、土壌中でおこる根粒菌の感染競合を連続的にとらえることが可能となった。リゾフレームシステムは根粒共生のみならず、病原微生物の感染過程や感染に伴う根の形態変化の追跡など様々な植物微生物相互作用の観察に利用できると考えている。一方で、本システムによる微生物の可視化には蛍光標識が必要であるため、形質転換が困難な微生物の動態をいかに観察するかは重要な課題である。リゾフレームシステムがこれまで土壌中に隠されていた根と微生物の相互作用実態の解明に貢献することを期待している。
本稿は、日本植物学会第 88 回大会シンポジウム「植物 / 微生物 / オルガネラの相互作用をイメージングで解き明かす」での講演内容についてまとめたものである。このような機会をくださったオーガナイザーの豊岡公徳博士ならびに永田典子教授に厚くお礼申し上げる。リゾフレームの構築にあたり、株式会社 LINKSu の角川弘晃氏にご協力をいただいた。 また、本研究に使用した M. loti MAFF303099 DsRed 株を理化学研究所の林誠博士に、DR5::GFP-NLS ミヤコグサを筑波大学の壽崎拓哉 准教授に、スペクチノマイシン / ストレプトマイシン耐性pK18mobsacB ベクターを帯広畜産大学の菅原雅之准教授にご提供いただいた。本研究は、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構 (NEDO) ムーンショットプロジェクト (JPNP18016) および科学研究費若手研究 (22K14807) のサポートにより実施した。
