Elucidating the Pathophysiology of Various Diseases by Investigating the Role of Molecules in Brain Wiring

Summary

Semaphorins and their receptors plexins are axon guidance molecules that navigate axons to their final destinations during neural development. Semaphorins and plexins exert distinct roles in regulating biological functions such as the immune system and bone homeostasis. They also participate in the development and progression of various diseases such as osteoporosis and allergic diseases. This review describes the varied phenotypes revealed by the analysis of semaphorin or plexin knockout mice and discusses the association with pathogenesis and therapy of atherosclerosis, agenesis of the corpus callosum, and neuropsychiatric diseases. The deletion of semaphorin 4D in atherosclerosis-prone Apolipoprotein E-deficient mice mitigated atherosclerotic lesions, indicating its crucial involvement in the progression of atherosclerosis. Semaphorin 4D is also implicated in apoptosis induced by the estrogen-dependent generation of soluble semaphorin 4D and the active form of plexin-B1 in the postnatal vaginal opening in mice. Plexin-A1 knockout BALB/cA mice exhibited the agenesis of corpus callosum. This study indicates the crucial role of plexin-A1 in the midline crossing of callosal pioneer axons projecting from the cerebral cortex during the early phase of callosal formation. Adult plexin-A1-deficient mice exhibit reduced prepulse inhibition deficit, an endophenotype of schizophrenia, in addition to excessive self-grooming. Parvalbumin-expressing interneurons in the medial prefrontal cortex are significantly decreased in plexin-A1 knockout mice. In the parvalbumin neurons, oxidative stress is significantly increased in plexin-A1 knockout mice. Accordingly, plexin-A1 deficiency may augment oxidative stress in parvalbumin neurons, thereby impairing the parvalbumin neuron network and leading to behavioral abnormalities relevant to neuropsychiatric diseases.

はじめに

神経系の発達過程では，成長中の軸索周囲に存在する多様な神経軸索ガイダンス分子と軸索先端部の受容体との相互作用を介して，軸索が標的に向かうための経路が決定される．^1）哺乳類神経系の細胞外環境には，多くの誘因性又は反発性の軸索ガイダンス分子が発現している．この軸索ガイダンス分子の中で広大なファミリーをなす分子群の一つがセマフォリン（semaphorin: Sema）ファミリーである．^2） Semaの受容体としてプレキシン（plexin: Plxn）ファミリーがある．^3） SemaとPlxnは，軸索の伸長方向の決定を担うが，^4）免疫機能の遂行及び細胞の移動，骨形成や血管新生等の多彩な作用を発揮する．^5–14） Semaとプレキシンは，アレルギー疾患や骨粗鬆症等の多様な疾患の発症・進展及び治療法開発に重要な分子群として注目されている．^15–19）本総説では，セマフォリン及びプレキシンの遺伝子改変マウスの解析により明らかになった多様な表現型を紹介し，動脈硬化症や脳梁欠損症，及び精神神経疾患の病態との関連について概説したい．

1. セマフォリンと受容体プレキシン

Semaファミリーには，分泌型のSema2, Sema3, SemaV（viral），細胞膜貫通型のSema1, Sema4, Sema5, Sema6及びGPIアンカー型のSema7の8つのサブクラス（Sema1–7, V）がある（Fig. 1）．^2,3,20） Semaの受容体にはニューロピリン（neuropilin: NRP1, NRP2）とプレキシン（PlxnA1/A2/A3/A4, PlxnB1/B2/B3, PlxnC1, PlxnD1）がある（Fig. 2）．^3,20） Sema3は，PlxnD1に直接結合して作用するSema3Eを例外として，^21）共受容体のNRPに結合し，NRPと会合したPlxnAがSema3の情報を細胞内に伝達する．^20） Sema3以外のSemaは，直接Plxnに結合しPlxnを介して信号を伝達する（Fig. 2）．^20）

Fig. 1. Semaphorins (Semas) and Plexins (Plxns)

(a) The Sema family contains transmembrane, secreted, and cell surface-attached proteins, and each is characterized by a single conserved extracellular sema domain. The Sema family is classified into eight based on structural features. Class 1 and 2 Semas are present in invertebrates, whereas classes 3–7 are observed in vertebrates. Class V Semas are observed in viruses. Classes 1, 4, 5, and 6 are transmembrane; classes 2, 3, and V are secreted; and class 7 are glycosylphosphatidylinositol (GPI)-linked types. (b) The plexin (Plxn) family works as Sema receptors. Plxns mediate most of the Sema signaling. Plxns are transmembrane receptors with an extracellular sema domain that participates in the interaction with Semas. Plxns have other extracellular protein domains and an intracellular domain containing a GTPase-activating protein (GAP) homology domain. Four classes of Plxns exist in vertebrates (A–D).^2,3,20) Basic, short basic domain; GAP homology domain (conserved 1); GAP(C2), GTPase-activating protein homology domain (conserved 2); GPI: glycosylphosphatidylinositol, Ig: immunoglobulin domain, IPT: immunoglobulin–plexin–transcription factor domain, MICAL-IR: MICAL interacting region, PSI: plexin–semaphorin–integrin domain, RBD: Rho GTPase binding domain, Sema: sema domain, TSP1: thrombospondin type 1.

Fig. 2. Plxns Mediate Sema Signaling

Semas (classes 4–6) bind to Plxns, and the Plxn GAP is activated. The Plxn GAP activity increases the GDP-bound form of Ras family GTPase, which deactivates integrin–extracellular matrix-mediated adhesion. Class 3 Semas bind to neuropilins, and the signals are transmitted to PlxnAs through the interaction of neuropilins and PlxnAs, which leads to Plxn GAP activity-mediated de-adhesion. PlxnAs that received Sema signals also activate MICAL through the interaction on MICAL-IR of PlxnAs and induce F-actin disassembly.^3,20) NRPs: neuropilins, MICAL: molecule interacting with CasLs.

2. クラス4セマフォリンSema4Dと動脈硬化

アテローム性動脈硬化症は，その進行に免疫系が関与する炎症性疾患である．^22）アテローム性プラーク内のマクロファージは細胞表面にCD40分子を発現し，T細胞はCD40リガンド（CD40L）を発現している．^23,24）プラーク内でのCD40とCD40Lを介するマクロファージとT細胞間の相互作用によりプロテアーゼと炎症促進因子が誘導され炎症が増大する．^23）アテローム性動脈硬化症モデルマウスにおいて，CD40とCD40L間の結合阻害やCD40L遺伝子の欠損により，プラークが減少する．^25,26）抗CD40抗体で免疫細胞を刺激すると，クラス4 SemaのSema4Dの発現が誘導される．^6）そのため，CD40刺激による免疫細胞活性化に伴い，T細胞表面の膜結合型Sema4Dがタンパク分解による切断を受け可溶性Sema4Dとなりプラーク内に分泌され，アテローム性プラークの悪化に係わる可能性がある．^27–29）プラーク内のリンパ球，マクロファージ，内皮細胞，及び血小板は，細胞膜表面にSema4D受容体のPlxnB1を発現している．^27–29）試験管内及び生体内において，Sema4Dは内皮細胞を遊走させ血管新生作用を示す．^30,31）したがって，アテローム性プラーク内の血管新生におけるSema4Dの作用が，プラークの成長に影響する可能性がある．アテローム性動脈硬化におけるSema4Dの関与検証のため，アテローム性動脈硬化を発症するApoE欠損マウスにおいて，Sema4D遺伝子を欠損させ，アテローム性プラークの成長，プラーク内における血管新生及びマクロファージの浸潤について解析を行った．その結果，6ヵ月齢のApoE:Sema4D二重欠損マウス（C57BL/6J背景）では，同齢のApoE欠損マウスと比較しプラーク面積が有意に減少していた．プラーク内浸潤リンパ系細胞におけるSema4Dと新生血管内皮細胞におけるSema4D受容体PlxnB1の発現が確認された．さらに，ApoE:Sema4D二重欠損プラークにおけるisolectin B4陽性面積若しくはCD31陽性面積の割合は，ApoE欠損プラークよりも有意に減少することがわかった．そのため，ApoE:Sema4D二重欠損プラークではApoE欠損プラークよりも有意に新生血管が減少していることが判明した．ApoE:Sema4D二重欠損プラークにおけるマクロファージの浸潤はApoE欠損プラークよりも有意に減少していた．したがって，発達中の動脈硬化性プラーク内へ浸潤したTリンパ球から切断される可溶性Sema4Dがプラーク内への内皮細胞を遊走させ血管新生を誘導後，新生血管を介してマクロファージを浸潤させ，アテローム性動脈硬化プラークの成長を促進すると考えられる（Fig. 3）．^32） Sema4Dを抗体でブロックして疾患の進行を阻止しようという試みは，ヴァクシネックス社がハンチントン病やアルツハイマー病等に対しヒト型抗Sema4D抗体の治験を進めている．^33） Sema4Dを抗体やナノボディ^16）等でブロックし動脈硬化症の進行が阻止されるか今後の治療への応用研究が期待される．

Fig. 3. Sema4D Facilitates Neovascularization in the Atherosclerotic Plaque

The development of the atherosclerotic plaque is delayed in Sema4D/ApoE knockout mice, which are prone to atherosclerosis but also have Sema4D deficiency. Sema4D is detected in infiltrating lymphoid cells, and PlxnB1 is present in endothelial cells in the atherosclerotic plaque. Neovascularization and macrophage infiltration in the plaque are significantly reduced in Sema4D/ApoE double knockout mice compared with ApoE knockout mice. Accordingly, Sema4D may facilitate atherosclerosis progression by promoting plaque neovascularization, which enhances macrophage infiltration.³²⁾

3. マウス雌性外生殖器組織リモデリングとSema4D

マウスでは，性ホルモン分泌の急増する思春期の生後5週齢で起こる体内環境変化に伴い皮膚近傍の膣腔盲端部上皮のアポトーシスが誘導され，膣腔が皮膚に開口する生後組織リモデリング現象が起こり雌性外生殖器の発達が完成する．^34）生後エストロゲンが増加する思春期の膣開口時において膣上皮に誘導されるアポトーシスにはBcl-2ファミリーの関与が示されていた．^34–38）しかし，膣開口時のアポトーシスについて詳しい機序は不明のままであった．^34,39） BALB/cA系統のSema4D欠損マウスが膣閉鎖症を高率で発症することを見い出した．10週齢を超える雌のSema4D欠損マウスは膣口がなく膣閉鎖を認め，子宮が膨張し内部に多量の血性の液体を含んでいた．膣閉鎖の発症頻度は，Sema4D欠損マウスで有意に高かった（野生型：0%，ヘテロ：7.3%，Sema4D欠損：59.5%）．膣開口期の5週齢のSema4D欠損マウスの血清エストロゲン値に有意な低下はなかった．Sema4Dは野生型膣上皮の基底上層に局在し，Sema4D受容体のPlxnB1は野生型及びSema4D欠損マウス両者の膣上皮全層に局在することがわかった．5週齢のSema4D欠損膣上皮におけるアポトーシス細胞は，野生型と比べて有意に減少していた．Sema4Dがマウス膣上皮細胞にアポトーシスを誘導するか検証するため，Sema4D欠損マウス由来の初代培養膣上皮細胞に組換えSema4Dを添加すると，アポトーシスが誘導された．さらに，培養膣上皮細胞でのPLxnB1ノックダウンにより，Sema4Dで誘導されるアポトーシスが抑制された．そのため，Sema4Dは膣上皮細胞のPlxnB1に作用しアポトーシスを誘導することが示唆された．^40,41）次に，マウス膣開口時のアポトーシスにおけるSema4D信号伝達のエストロゲン依存性を検証するため，Sema4D，PlxnB1，信号伝達分子の構造的・機能的変化について解析した．膜貫通型Sema4Dのタンパク分解による可溶性Sema4Dの放出とPlxnB1のタンパク分解による活性型への変換が，膣開口期にある5週齢の野生型膣組織でピークになることがわかった．卵巣摘出後の野生型マウスへのエストロゲン補充が，エストロゲン依存性に可溶性Sema4Dの放出とPlxnB1活性型への変換及び膣上皮アポトーシスが起こることを示した．卵巣摘出後のSema4D欠損マウスへのエストロゲン補充では，膣上皮アポトーシスを誘導できなかった．そのため，Sema4Dは，膣開口の組織リモデリングでエストロゲン作用の下流で働く必須のアポトーシス誘導因子と考えられる．以上より，生後の膣開口における膣上皮のアポトーシスは，Sema4DとPlxnB1のエストゲン依存性の構造変化に起因するSema4Dの信号伝達の増強により誘導されると示唆される（Fig. 4）．^41）エストロゲン依存性にSema4DとPlxnB1を切断する酵素についても興味が持たれる．メタロプロテアーゼのAdamts18遺伝子欠損マウスが膣閉鎖を示すことが報告された．^42,43）エストロゲン依存性のSema4Dの可溶化がAdamts18と関連があるかは今後の課題である．

Fig. 4. Sema4D Induces Vaginal Epithelial Apoptosis to Open the Vaginal Cavity to the Skin, a Postnatal Tissue Remodeling in Mice

Sema4D-deficient BALB/cA mice exhibit vaginal atresia at high frequency and significant attenuation of vaginal epithelial apoptosis. Both Sema4D and the receptor PlxnB1 are expressed in mouse vaginal epithelia. Sema4D binds to PlxnB1 to induce the apoptosis of cultured vaginal epithelial cells. The vagina opens at 5 weeks of age when estrogen levels increase rapidly. Estrogen induces soluble Sema4D release and PlxnB1 conversion into the active form by proteolysis in the vaginal tissues. Accordingly, the secretion of soluble Sema4D and PlxnB1 activation are both dependent on estrogen, and these events lead to vaginal epithelial apoptosis to control this postnatal tissue remodeling.⁴¹⁾

4. プレキシンA1（PlxnA1）欠損マウスにおける脳梁欠損

Sema受容体のPlxnA1を欠損するマウス（BALB/cA背景）では，左右大脳半球を連結する神経軸索の束からなる脳梁を高頻度に欠損することが判明した．そのため，胎生期の脳梁形成初期に大脳皮質から投射する軸索の正中線交差におけるPlxnA1の重要な役割が示唆された．^44）中枢神経系発達において，脳・脊髄の左右の同等領域をつなぐために，ニューロンの軸索は，それぞれ対側の標的ニューロンに向かい伸長を続ける．やがて，軸索は正中線を越えて対側に到達し，多くの神経軸索が集まる太い束となり，前交連や脳梁などの交連が形成される．^1,45）有胎盤哺乳類で左右の大脳半球間を結び付ける脳梁は，左右半球間の情報を交換し，知覚や記憶を統合する．^46）胎生期に脳梁が形成される正中線領域において，神経軸索が標的に向かい伸長していくためのガイドとなる道標guidepostが形成される．^{45,47–49）}これらの道標には，軸索の伸長する方向を導くセマフォリンやスリット（Slit）などの軸索ガイダンス因子が発現している．^{45,47–49）}神経軸索は，軸索ガイダンス因子に対する受容体を発現し，軸索伸長の誘引，あるいは反発活性を示す軸索ガイダンス因子の作用を受けて伸長方向を定める．その結果，神経軸索は正中線を交差し，対側の標的ニューロンに到達する．マウスでは胎生15.5日（E15.5）に，帯状回皮質（Fig. 5, cingulate cortex: CCi）からパイオニア軸索（pioneer axons: PA）が正中線（midline）への伸長を開始し，後に正中線に到達する新皮質からの脳梁軸索（Fig. 5, callosal axons: CA）の足場を提供する．^50）正中線腹側の道標内に集まるcalretinin陽性グルタミン作動性ニューロン（Fig. 5, CR+ glutamatergic neurons）には，セマフォリン3C（Sema3C）が発現している．Sema3Cは，その受容体のニューロピリン1（NRP1）を発現するパイオニア軸索の伸長を正中線側に誘引する．^51）セマフォリンがNRP1に結合した後，細胞内への信号伝達は，PlxnAサブファミリー（PlxnA1, A2, A3, A4の4種）を介して行われると考えられる．これまでに，Richardsらの研究グループがNRP1分子N末端側のSema結合領域内の7アミノ酸をほかのアミノ酸に置換したNRP1ミュータントマウス（クラス3 SemaがNRP1に結合できない）を用い，NRP1がパイオニア軸索の正中線方向への誘引に必要なことを明らかにした．^50） NRP1ミュータントマウスのパイオニア軸索（NRP1-mutant pioneer axons）は，正中線に近づくことがなく異所性に中隔（septum）内に投射する軸索ガイダンス異常を示した．^50）さらに，CR+ glutamatergic neuronsに局在するSema3Cが，軸索先端部の成長円錐に発現するNRP1に結合して帯状回皮質に由来するパイオニア軸索を正中線に誘引することも明らかになった．^51） Sema3C欠損マウスにおいても，パイオニア軸索が，正中線ではなく異所性に灰白層グリア等の中に投射するような軸索ガイダンス異常を示した．^51）以上の結果より，Sema3Cがパイオニア軸索のNRP1に作用してパイオニア軸索を正中線側に誘引することがわかった．^50,51）しかしながら，NRP1は単独では細胞内に信号を伝達できないので，このパイオニア軸索を正中線まで誘導するSema3Cの信号を細胞内へ伝達する分子がPlxnなのか，NRP1に会合するほかの分子のL1CAMやVEGF受容体等なのかは不明のままである．^52）

Fig. 5. PlxnA1-deficient Mice Exhibit a Midline Crossing Defect of Callosal Axons

In wild-type BALB/cA mice at embryonic day 17.5, neuropilin-1 positive (NRP1+) pioneer axons originating from the cingulate (CCi) cortex, and the later-growing callosal axons from the frontal (CFr) and parietal (CPa) cortexes cross the midline and extend toward the contralateral hemisphere. Sema3C expressed by calretinin-positive glutamatergic neurons attracts these axons to the midline.^50,51) In PlxnA1-deficient BALB/cA mice at E17.5, NRP1+ pioneer axons from CCi and callosal axons from CFr and CPa do not cross the midline and are stalled just anterior to the midline. Mistargeting to any area other than the midline was not observed in the axons originating from the callosal projection neurons of PlxnA1-deficient embryos. These indicate the specific role of PlxnA1 in the midline crossing of callosal pioneer axons and later-growing callosal axons.⁴⁴⁾ CA: callosal axons, CR+ glutamatergic neurons, calretinin-positive glutamatergic neurons.

C57BL6/Jマウスの胎生15–17日齢（E15–E17）脳では，PlxnA1はNRP1及びL1 cell adhesion molecule（L1CAM）とともに，帯状回皮質のパイオニアニューロンで発現している．^50）クラス3SemaのSema3A及びSema3CのmRNAsは，E15–17のC57BL6/Jマウスの皮質正中線領域に発現している．^50） E16.5の野生型BALB/cAマウスでは，中隔，帯状回皮質の表層と深層にPlxnA1の局在が確認された．E17.5の野生型マウスでは，中隔，帯状回皮質深層，正中線を横断する帯状回皮質由来のパイオニア軸索及び新皮質由来の脳梁軸索におけるPlxnA1の局在が確認された．E17.5の野生型マウスでは，NRP1陽性の帯状回皮質由来のパイオニア軸索と前頭皮質及び頭頂葉皮質由来の脳梁軸索は，正中線を交差していた（Fig. 5, wild-type mice）．一方，E17.5のPlxnA1欠損マウスのほとんどで，帯状回皮質由来のNRP1陽性パイオニア軸索及び脳梁軸索は正中線の手前まで伸長するが，正中線を交差していなかった（Fig. 5, PlxnA1 knockout mice）．PlxnA1欠損マウスにおけるNRP1陽性パイオニア軸索の正中線交差の頻度は，野生型と比べて有意に低いことがわかった（野生型：24匹中18匹が正中線交差，PlxnA1欠損：25匹中4匹が交差，χ² test p<0.05）．カルボシアアニン色素のDiIを帯状回皮質に注入し軸索の伸長を追跡した実験においても，16匹中14匹のPlxnA1欠損軸索は正中線手前で停止し正中線を交差せず，異所性に投射することもないことが確認された．PlxnA1欠損パイオニア軸索及び脳梁軸索が，約2日後の生後0.5日齢（P0.5）でどうなるか確認するため，P0.5の野生型とPlxnA1欠損マウス脳を用いて抗L1CAM抗体で免疫組織化学を行った．P0.5の野生型マウスでは，16匹中16匹で，吻側部，中央部，尾部においてL1CAM陽性軸索の正中線交差が確認できた．そして野生型マウスの16匹では，脳梁欠損を示すマウスは皆無であった．PlxnA1欠損マウスからの全スライスの解析により，PlxnA1欠損マウスの18匹中15匹で脳梁の前半部分が欠損していることが判明した．以上の結果をまとめると，E17.5のPlxnA1欠損マウスにおける帯状回皮質由来のパイオニア軸索を含む脳梁軸索の正中線交差は，同日齢の野生型マウスと比較すると，有意に障害されていた．P0.5のPlxnA1欠損マウスの76%において，脳梁の前半部における脳梁欠損が起こっていた．E17.5のPlxnA1欠損マウスのNRP1陽性パイオニア及び脳梁軸索は，正中線領域のSema3Cに誘引されて正中線近傍まで伸長していくことがわかった．しかし，PlxnA1欠損マウスの84%（21/25匹）では，NRP1陽性パイオニア軸索及び脳梁軸索は正中線を交差していなかった（Fig. 5）．^44）そのため，NRP1陽性軸索が正中線を交差する段階で，PlxnA1が重要なはたらきをすることが示唆される．PlxnA1欠損NRP1陽性パイオニア軸索が正中線のSema3Cの方に誘引され異所性の投射も起こらず正中線手前で停止していたことは，PlxnA1はNRP1陽性パイオニア軸索の正中線への誘因には必須ではなく，正中線の交差に必須の役割を担うことを示唆する．

ヒトの脳梁欠損症（agenesis of the corpus callosum: AgCC）の発生頻度は放射線学的には約0.7%といわれる．^53）脳梁欠損症には，完全脳梁欠損とPlxnA1欠損マウスのように部分欠損がある．完全脳梁欠損であっても純粋に脳梁だけが欠損している場合（脳のほかの部位に異常がなく，脳以外の身体部位に異常がない）は，前交連や後交連などのほかの交連が代償するようになるため，ほとんど症状がなく無症候性で日常生活には支障がないとされている．^54）ただし，詳細な心理学的検査を行うと，コミュニケーションや，視覚認知，及び言語機能の障害が検出される．^54）脳梁欠損症720症例の大規模研究では，兄弟姉妹と比較し運動発達の遅延，平衡維持及び両手間協調運動の困難，筋緊張の低下，奥行き知覚の低下，疼痛知覚の低下，睡眠障害，左利きと交差利きの割合の増加等がみられた．^55）脳梁欠損症に合併する病気として，脳梁欠損以外にほかの脳部位での異常や身体異常を合併する症候群で原因遺伝子が同定されたものもいくつか知られている．L1CAMの遺伝子異常で脳梁欠損を起こすが，ほかに精神遅滞，言語遅滞，筋の痙直，母指屈曲内転拘縮及び水頭症など多彩な症状を示す．^56）したがって，脳梁形成におけるプレキシンの役割に関する研究は，脳梁形成機構と脳梁欠損症の病因の解明及び治療法の開発への貢献が期待される．

5. PlxnA1欠損マウスにおける行動異常とパルブアルブミン陽性介在ニューロンの異常

ヒトのPlxnA1遺伝子座は，3番染色体長腕にある．統合失調症患者の中には，PlxnA1遺伝子の4021番目の配列がatgからttgにミスセンス変異しており，PlxnA1タンパクの1401番目のアミノ酸がメチオニンからロイシンに置換しているケースがみつかっている．^57）さらに，ゲノムワイド関連解析（genome-wide association study: GWAS）により稀な神経発達障害患者でPlxnA1遺伝子のミスセンス変異がみつかっている．^58）PlxnA1遺伝子が精神疾患の発症に関与するか興味が持たれるが，神経行動学的パフォーマンスのために重要な神経ネットワークの発達におけるPlxnA1の神経生物学的な役割は未解明である．成体マウスの複雑な行動におけるPlxnA1の役割解明のため，PlxnA1欠損マウス（BALB/cA背景）の行動学的表現型を同定し，PlxnA1欠損マウスで異常行動が同定されれば，その原因を探ることにした．PlxnA1欠損マウスの行動異常として，Wire hang testにおける四肢の筋力は野生型と同等でrotarod testにおける運動協調性は亢進，オープンフィールド及びホームケージ内での毛繕い運動の亢進，高架式十字迷路試験における不安様行動の低下，聴覚性驚愕反応プレパルス抑制試験におけるプレパルス抑制の低下が判明した（Table 1）．^59,60） Y maze testでの自発交替行動試験における作業記憶，及びFear conditioning testにおける恐怖記憶は野生型との間に違いはなかった．Social interaction testにおける社交性及び社会的新規性とも野生型との違いはみられなかった（Table 1）．^59,60）

Table 1. Behavioral Abnormalities in PlxnA1 Knockout Mice

Wire hang test	NS
Rotarod test	↑* (trials 1–3)
Open field	Increased grooming numbers ↑****
	Increased grooming times ↑****
	AgCC enhanced grooming behavior
Home cage grooming	Grooming time ↑**** (20.00–22.00)
	Scratching time ↑**** (all time bin, 20.00–8.00)
Y maze test	NS (spontaneous alteration)
Elevated plus maze test	↑** (more time on the open arms)
	↓* (less time in the closed arms)
Social interaction test	NS (both sociability and social novelty)
PPI test	↓* (%PPI at 86 dB, KO<WT)
	↓* (%PPI at 78 dB and 86 dB, KO-CC<WT)
Fear conditioning test	NS (freezing time on both contextual and cued conditioning)

PlxnA1 knockout mice exhibit superior motor coordination in the rotarod test. PlxnA1 knockout mice exhibit significantly excessive self-grooming behavior in both the open field and home cage. PlxnA1 knockout mice spend significantly more time on the open arms but less on the closed arms of an elevated plus maze, which indicated reduced anxiety. PlxnA1 knockout mice also exhibit significant PPI impairment.^59,60) ↑: increased, ↓: decreased, KO: knockout, NS: not significant, WT: wild type. * p<0.05, ** p<0.01, **** p<0.0001, significantly different compared with WT; KO, PlxnA1 KO mice; KO-CC, PlxnA1 KO mice with an intact corpus callosum (CC).

Glutamic acid decarboxylase 67（GAD67）遺伝子内に緑色蛍光タンパク（green fluorescent protein: GFP）遺伝子をノックインしたマウス（BALB/cA背景）の内側前頭前皮質のGAD67-GFP陽性ニューロン，すなわちgamma-aminobutyric acid（GABA）作動性ニューロンの中で，51%のニューロンがPlxnA1 mRNAを発現していた．PlxnA1 mRNAは，成体マウス前頭前皮質内のパルブアルブミン（parvalbumin: PV）発現介在ニューロン（PV細胞）に発現していた．内側前頭前皮質のPV細胞の中で42%のPV細胞がPlxnA1 mRNAを発現していた．PlxnA1欠損マウスの内側前頭前皮質（medial prefrontal cortex: mPFC）において，GABA作動性介在ニューロンの有意な減少及びPV細胞の有意な減少を認めた．

8-Oxo-2′-deoxyguanosine（8-oxo-dG）により測定される酸化ストレスは，野生型よりもPlxnA1欠損PV細胞で有意に高いレベルを示す．そのため，PlxnA1欠損マウスのmPFCのPV細胞における酸化ストレス亢進が明らかになった．^61）そのため，酸化ストレス亢進とPV細胞密度の減少が，PlxnA1欠損マウスにおける異常行動発症の決定要因かもしれない．PlxnA1欠損マウスは，離乳前の生存率の低下と生後の成長障害を認め，脳梁欠損は，胎生期よりも低い頻度で認める（16.25%; 80匹中13匹）．PlxnA1欠損マウスは，統合失調症の齧歯類モデルにおける陽性症状を示唆する常同的毛繕い行動の有意な増加を示した．^59–63）PlxnA1欠損マウスは，有意なプレパルス抑制の障害を示した．プレパルス抑制の障害は，統合失調症患者で観察される情報処理障害の一つのエンドフェノタイプとされる．^64）PlxnA1欠損マウスの行動異常は，統合失調症様行動の中の陽性症状と認知障害という限定的な特徴を持つことを示唆している．

本研究は，PlxnA1欠損マウスの内側前頭前野内のPV細胞における酸化ストレス亢進を明らかにした．酸化ストレスは，免疫組織化学染色におけるPV免疫反応性の低下を含め，PVニューロンの正常表現型を消失させる．^65,66）そのため，PlxnA1欠損マウスの内側前頭前野内のPV細胞数が減少したと考えられる．PV細胞は，近傍の錐体ニューロンの発火を制御し，脳内の各領域間で同期する神経活動の形成を介して，脳内の情報処理を促進している．^67–69）したがって，PlxnA1欠損マウスの内側前頭前野内のPV細胞数の減少は，皮質神経回路における情報処理障害をもたらし，PlxnA1欠損マウスにおけるプレパルス抑制の障害，過剰な反復性毛繕い行動，不安用行動の低下等の行動異常を引き起こしたと考えられる（Fig. 6）．^59,61） PV細胞の酸化ストレス亢進に対する抗酸化剤の投与がいくつかの統合失調症様マウスや統合失調症患者の病態を緩解する．^70–72）したがって，プレキシンA1欠損マウスのようにPV細胞の酸化ストレス亢進と行動異常を示すマウスの病態解析は，神経発達障害及び精神疾患の病態解明及び治療法開発研究への発展が期待される．

Fig. 6. Augmented Oxidative Stress in Parvalbumin-expressing Neurons May Cause Behavioral Abnormalities in PlxnA1-deficient Mice

The immunohistochemical study with oxidative stress marker reveals increased oxidative stress in parvalbumin-expressing interneurons (PV-INs) in the medial prefrontal cortex of PlxnA1-deficient BALB/cA mice. Enhanced oxidative stress makes PV-INs lose their normal phenotypes and lowers the immunoreactivity of PV and glutamic acid decarboxylase 67 (GAD67) in immunohistochemistry.^64,65) Thus, the enhancement of oxidative stress in PV-INs may result in the decrease of PV-INs in the medial prefrontal cortex of PlxnA1-deficient mice. PV-INs promote information processing in the brain through the formation of neural activities that synchronize among respective brain regions by regulating the activity of neighboring pyramidal neurons.^66–68) Accordingly, the decrease in PV-INs in the medial prefrontal cortex of PlxnA1-deficient mice may disrupt information processing in the cortical neural circuit and result in behavioral abnormalities including prepulse inhibition deficit, excessive self-grooming, and lowered anxiety.^59,61)

おわりに

筆者は，上述のように軸索ガイダンス分子のセマフォリンとその受容体のプレキシンを中心に，動脈硬化症，生後組織リモデリングの異常，脳梁欠損，行動異常など多様な病態について研究を続けてきた．退職後も名城大学の研究員として，脳梁軸索の伸長をガイドする道標として働く灰白層グリアの形成にセマフォリンとプレキシンが係わるという仮説のもとに，研究を続けている．若い先生方や学生さんと比べると，実験の進み具合も遅くなったが，興味深い研究結果が得られれば今後も学会等で発表したいと願っている．

謝辞

本研究を行うにあたり，貴重な遺伝子改変マウスの供与を賜りました大阪大学の菊谷　仁名誉教授と熊ノ郷淳教授，群馬大学の柳川右千夫教授，理化学研究所バイオリソース研究センターに深甚なる感謝を申し上げます．教育と研究では数々の御指導と御鞭撻を賜りました名城大学薬学部の教職員の皆様に深く御礼申し上げます．生理学研究室開催当初より教育と研究のために，ひとかたならぬ御尽力を賜りました故 竹内典子先生，故 吉田謙二先生に心より感謝を申し上げます．また教育と研究において御支援と御助言を賜りました生理学研究室の根岸隆之准教授と都築孝允助教に深謝の意を申し上げます．

利益相反

開示すべき利益相反はない．

Notes

本総説は，2023年度退職にあたり在職中の業績を中心に記述されたものである．

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