有機質肥料 (OF) で栽培した露地トマト (品種サターン) と無機質肥料 (IF) で栽培したトマトの食味を比較するため官能検査を行なった結果, 各年ごとに傾向は必ずしも同じではなかった。
1) 1980年度は, 3および5果房ともIF区よりOF区のほうが顕著に優れていると評価された。
2) 81年度は, 3果房はOF区が優れていたが, 1および6果房ではあまり差がなかった。
3) 82年度は, 3果房は明らかにOF区が優れていたが1,2,4～7および8果房には差がなかった。
4) 各年とも3果房のOF区が優れていたが, これは養分吸収との関係で検討を要する。
5) 色については, 官能検査で有意差が示された試料が, 必ずしも, 色調測定の結果示された傾向とは一致しなかった。

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　本研究では，実大橋脚模型の震動台実験とこれに合わせた縮小模型実験に基づき，震動実験時に生じたひずみ領域における実大橋脚と模型橋脚の鉄筋強度の違いがRC橋脚の破壊特性及び曲げ復元力に及ぼす影響を検討した．その結果，鉄筋強度の違いを考慮して設計した縮小模型は，実大橋脚模型の曲げ復元力を約7%大きく評価することが明らかとなった．この違いは，縮小模型の方が実大橋脚模型よりも，かぶりコンクリートの剥落やコアコンクリートの圧壊の進展は小さいことが原因と考えられる．

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　縮小模型実験により実大RC橋脚の地震時の破壊特性や曲げ復元力をどの程度正確に評価することができるのかは，従来，実大模型に関する実験データがほとんど存在しなかったため，ほとんど検討されてきていない．本研究では，実大橋脚模型の震動台実験とこれに合わせた縮小模型実験の比較から，粗骨材の最大寸法と鉄筋断面積の評価法がRC橋脚の破壊特性及び曲げ復元力に及ぼす影響を検討した，その結果，1) 粗骨材の最大寸法が13mmの縮小模型に比較し，5mmの縮小模型の方が塑性ヒンジ部におけるコアコンクリートの圧壊が著しいこと，2) 鉄筋の断面積を呼び径に基づいて評価した場合に比較して，鉄筋の最小断面積に基づいて評価した場合の方が，より実大橋脚模型に近い曲げ復元力を与えること，3) 縮小模型に比較して，実大橋脚模型の方が，かぶりコンクリートの剥落，軸方向鉄筋の座屈，コアコンクリートの圧壊といった損傷の進展が著しく，縮小模型実験に基づいて正しく実大模型の損傷の進展を再現できないことを明らかにした．

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放線菌は、微生物由来二次代謝産物の7割近くを生産する土壌微生物である。近年では抗生物質生合成遺伝子の改変による非天然型抗生物質の創製も盛んに行われており、創薬の研究シーズとして期待される。放線菌Streptomyces rochei 7434AN4株は構造の異なる2つのポリケチド抗生物質ランカサイジン (LC) およびランカマイシン (LM) を生産し、それら生合成遺伝子群は全長210 kbの巨大線状プラスミドpSLA2-L上にコードされていた（図1）。さらにこれらの制御遺伝子 (srr genes)も本プラスミド上にコードされていた ¹⁾。

現在までにLCの特異な大員環形成機構およびモジュラー・反復混合型ポリケチド生合成系、LMの分子多様性を規定する生合成酵素、さらには二次代謝生合成制御機構に関する成果を挙げてきた²⁾。本発表では抗生物質生産を誘導するシグナル分子SRB (Streptomyces rochei butenolide) に着目し、(1) SRBの単離・構造決定、(2) SRBの生合成機構解析、に関する研究成果について報告する。

(1) 抗生物質生産を誘導する新規ブテノライド型シグナル分子SRBの単離・構造決定

　Streptomyces属放線菌には、 A-factor などの低分子シグナル化合物（図2）による二次代謝制御機構が広く存在している。S. rochei の線状プラスミド pSLA2-L には、LC, LM生合成遺伝子群のほかにシグナル分子 (SRB) 合成遺伝子 (srrX)、SRB リセプター遺伝子 (srrA)、SARP 型活性化遺伝子 (srrY) などがコードされている。我々は既に SrrX→SrrA→SrrY→LC, LM 生産という抗生物質制御カスケード（図3）を明らかにしているが、SRB の化学構造は不明のままであった。

　放線菌のシグナル分子は nM オーダーで抗生物質生産を誘導するが、その生産量は極微量であり、単離・構造決定は困難を極める。S. griseus (streptomycin 生産菌) のA-factor，Streptomyces virginiae (virginiamycin生産菌) の virginia butanolide などのシグナル分子は、いずれも g-ブチロラクトンを共通骨格としていた。しかし近年 Streptomyces coelicolor (methylenomycin 生産菌) からフラン骨格を有するシグナル分子 methylenomycin furan (MMF)、Streptomyces avermitilis (avermectin 生産菌) からブテノライド型分子 avenolide が発見され（図2）、S. rochei が生産するシグナル分子SRBの構造に興味が持たれた。そこで我々は本菌を大量培養 (160リットル) し、ゲル濾過およびシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより SRB 画分を精製した (250 mg) 。なお活性画分は，srrX 破壊株の LC, LM 生産性回復により検出した。精製した活性成分の高分解能質量分析を行ったところ、２つの化合物 (SRB1, SRB2) の存在が確認でき，分子式はそれぞれ C₁₅H₂₄O₅，C₁₆H₂₆O₅であった。さらに各種二次元 NMR で解析したところ、SRB1は[2-(1’-hydroxyl-6’-oxo-8’-methylnonyl)]-3-methyl-4-hydroxybut-2-en-1,4-olide、SRB2は [2-(1’-hydroxyl-6’-oxo-8’-methyldecyl)]-3-methyl-4-hydroxybut-2-en-1,4-olideと決定できた。これらはいずれも2,3-二置換4-ヒドロキシブテノライド骨格を有する新規シグナル分子であった (図3)。

　また、分岐鎖の C-1’ 位水酸基の立体化学は、化学合成サンプルとの比較解析により明らかにすることとした。SRB1 (1) に関しては、炭素鎖 6 のモノベ

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　Jawsamycin（1）はStreptoverticillium fervensHP-891から単離された天然物であり（図１）、植物病原菌に対して顕著な抗菌活性を示す¹。その構造的な特徴は、①ポリケチド鎖と核酸部がアミド結合を介して縮合している点、②４つの連続したシクロプロパン（CP）と独立したCPが一つの炭素鎖上に導入されている点、③全てのCPが同一の立体配置を有する点にある。1のポリケチド鎖は多様な分子構造の宝庫である天然物の中でも極めて稀な構造であり、類似の構造的特徴を有する天然物はStreptomyces sp. UC-11136が生産するU-106305（2）の一例しか報告されていない（図１）²。その構造は多くの有機合成化学者の注目を集め、FalckおよびBarrettらのグループにより全合成が達成されている^3,4。一方、1の生合成経路についても興味がもたれてきたが、その詳細は未解明であった。我々は、1に見られるポリシクロプロパン骨格の構築には新しい生合成マシナリーが関与していると予想して生合成研究を開始した。最近、①標識前駆体・中間体アナログの取り込み実験^5-7、②生合成遺伝子クラスターの同定と機能解析⁸を通して、ラジカルSAM酵素によるポリシクロプロパン骨格構築機構を提唱するに至ったのでその詳細を報告する。

標識前駆体・中間体アナログの取り込み実験

　CPの構築機構に対する知見を得るため、生産菌への各種標識前駆体の取り込み実験を行った（図２）。興味深いことに標識酢酸が全く取り込まれないことがわかったので、酢酸の代わりとしてD-[U-¹³C₆]glucoseと[1,3-¹³C₂]glycerol、加えてL-[Me-¹³C]methionineを実験に用いた。各標識体の取り込みパターンから、酢酸ユニットが連結したポリケチド鎖にS-アデノシルメチオニン（SAM）由来のメチル基が導入されることでCPが構築されることがわかった。次いで、CP構築のタイミングに対する知見を得るべく、重水素標識したジケチドアナログ3の取り込み実験を行った。生成した1の²H-NMR解析の結果、末端メチル基のシグナルが観測された。これに対し、3のエナンチオマーは取り込まれなかった。以上より、炭素鎖構築の過程でCPが立体選択的に導入されることが強く示唆された。一方、ヌクレオシド部については、[5,5’-²H₂]-5,6-dihydrouridineの取り込みが確認された。上記取り込み実験の結果から、核酸部はウリジン（誘導体）から生合成されることがわかった。

生合成遺伝子の解析

　CPの構築に関与する酵素遺伝子を同定するため、1生合成遺伝子クラスターの取得を試みた。まず、ポリケチド鎖の縮合を触媒するKetosynthase（KS）ドメインに対する縮重プライマーを用いてPCRによる生合成遺伝子の取得を検討した。その結果、マルチモジュラー型のポリケチド合成酵素（PKS）遺伝子を含む遺伝子クラスターが２種類得られたが、そのドメイン配列は1のポリケチド鎖の化学構造から予想される配列とは一致しなかった。そこで、生産菌ゲノムDNAのドラフトシーケンス解析を行い、二次代謝産物生合成遺伝子を網羅的に探索した。PKSに加えてアミノウリジンの構築に関与する既知の酸化/アミノ基転移酵素

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Lankamycin (2), produced by Streptomyces rochei 7434AN4, is a 14-membered macrolide antibiotic attached with two deoxysugars, L-arcanose and D-chalcose. To reveal the order of glycosylation steps in lankamycin biosynthesis, we carried out gene disruption of two glycosyltransferase genes, Ikm1 and IkmL. The /km/ mutant produced 3-O-L-arcanosyl lankanolide (3), while the IkmL mutant accumulated 8-deoxylankanolide (4). These results indicated that LkmL transfers L-arcanose to the C-3 hydroxyl of 4, while Lkml does D-chalcose to the C-5 hydroxyl of 3. Taking together with previous results of gene disruption of two P450 hydroxylases, we propose the biosynthetic pathway of lankamycin including two hydroxylation and two glycosylation steps. Compound 2 contains a 3-hydroxy-2-butyl side chain at C-13. To analyze the function of IkmE which encodes type-II thioesterase in the lankamycin cluster, we carried out a gene disruption experiment. Disruption of IkmE resulted in a 70% decrease of lankamycin production concomitant with an accumulation of novel lankamycin derivatives (LM-NSO1A and LM-NSO1B), in which the C-13 side chain is replaced by a 1-carboxyethyl group. The biosynthetic origin of 1-carboxyethyl group was confirmed by incorporation of deuterium in [3-2H]3-methyl-2-oxobutyrate (10) into the C-14 position. These results indicate that the biosynthesis of LM-NSO1A and LM-NSO1B starts from isobutyryl CoA in place of (S)-2-methylbutyryl CoA and LkmE removes the aberrantly loaded starter unit and restores lankamycin production.

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Incednine is a 24 membered macrolactam glycoside isolated from Streptomyces sp. ML694-90F3 as an inhibitor of anti-apoptotic function of Bcl-2/Bcl-xL oncoproteins. In the present study, to understand the biosynthesis of the unique amino acid starter unit of macrolactam aglycon (incednam), a series of incorporation study and enzymatic analyses of the biosynthetic enzymes encoded in the corresponding gene cluster were conducted. Feeding experiments with [1-^<13>C_1] acetate, [1,2-^<13>C_2] acetate, [1-^<13>C_1] propionate, and [^<13>C_3]glycerol revealed that incednam is constructed with five malonyl-CoA, four methylmalonyl-CoA and one methoxymalonyl-CoA (ACP) as the extender units of polyketide synthases (PKSs). Interestingly, one intact acetate was also incorporated into the C1-C2 position of 3-aminobutyrate moiety, suggesting that the starter unit would be derived from L-glutamic acid rather than L-lysine and acetoacetyl-CoA. In fact, intact incorporation of L-[^<13>C_5,^<15>N_1]glutamic acid was observed. Further, to elucidate the missing biosynthetic link between L-glutamic acid and the starter unit, possible deuterium labeled amino acids were synthesized and fed to the producer strain. As a result, the free form of 3-[3-^2H]aminobutyric acid and β-[2,2,4,4-^2H_4]glutamic acid were efficiently incorporated to the starter unit, indicating that these amino acids are direct precursors of the starter unit of incednam. These results also implied that the unprecedented β-decarboxylation of β-glutamic acid to give 3-aminobutyric acid would be involved in the starter unit biosynthesis. As the next, to fish out the expected unique biosynthetic gene cluster of incednine, we used unique deoxysugar biosynthetic genes and methoxymalonyl-ACP biosynthetic gene as probes. Consequently, the incednine biosynthetic gene (idn) cluster, which is localized to a 138 kb contiguous DNA from Streptomyces sp. ML694-90F3, was identified. The idn gene cluster contains six modular type I PKS genes (idnPl-P6), deoxysugar biosynthetic genes (idnS1-S9), possible starter biosynthetic genes (idnLM1-LM7) and several modification enzymatic genes. To understand the unique starter unit biosynthesis, we attempted to characterize several recombinant enzymes, which were expressed in heterologous hosts. One of the most striking results was that IdnLM3 was found to catalyze β-decarboxylation of β-glutamic acid to give 3-aminobutyric acid. In the presentation, we will discuss the unique starter biosynthetic pathway based on the characterized enzymatic functions of the incednine biosynthetic enzymes.

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