総説
RND型多剤排出トランスポーターの構造機能研究～輸送素過程の考察
2024 年 64 巻 4 号 p. 185-189
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2024 年 64 巻 4 号 p. 185-189
グラム陰性菌における抗菌薬耐性の主因のひとつであるRNDトランスポーターの結晶構造解析を続けてきた．2023年，新たにバークホルデリア菌由来ホモログの結晶構造を解明した．ホモログの構造ではあるが，これまでに蓄積された知識と統合しRNDトランスポーターの分子メカニズムについてより深い洞察が得られた．
We have continued crystal structural analyses of RND transporters, one of the main causes of antimicrobial resistance in Gram-negative bacteria. It has been more than twenty years since we first determined the structure of E. coli AcrB, and in 2023, we solved the crystal structure of its homolog, BpeB from Burkholderia pseudomallei. Does the impact of our work diminish as we continue to analyze the homologous proteins over and over again? No. We can gain deeper insights into the molecular mechanism of the RND transporter by gathering the knowledge accumulated so far. Even if it is not the first structure in the world, we can still find some significance in the work if we analyze it properly.
著者らは主にグラム陰性細菌の持つ多剤排出トランスポーターの構造および機能解析に四半世紀にわたり携わってきた．この研究の目的は，薬剤耐性（Antimicrobial Resistance: AMR）の主因のひとつである多剤排出トランスポーターによる多基質認識とその輸送機構を明らかにすることである．これは，細胞膜を介した物質輸送という基礎的な生命現象の本質的理解へと繋がる興味ある課題であるとともに，多剤耐性化克服へ向け門戸を拓く期待もある．2002年著者らは多剤排出トランスポーターとしてだけでなく，膜を介したイオンの濃度勾配を駆動力とする二次性トランスポーターとしても世界初の高分解能構造解析例となった大腸菌AcrBの結晶構造解析に成功し，それはネイチャー誌の表紙を飾る業績となった1)．さらにその4年後，同じく大腸菌AcrBと抗菌薬および抗がん剤との複合体結晶構造を再びネイチャー誌に発表し，多基質認識とその輸送機構の基礎について説くことができた2)．その後，当該研究分野では構造生物学のほか構造に基づく生化学，分子遺伝学，さらには分子動力学を中心とした計算機科学など多様なアプローチで研究が進み，詳細な作動機構が議論されるような研究分野へと成熟してきた．一方その過程において，新たなホモログの構造解析などを行っても当然のことながら構造は概ね似ており，そういう意味では新奇性が徐々に失われ，それに伴い一般的関心やインパクトは遺憾ながら先細りするためかネイチャー誌には掲載されなくなっていった．腰が抜けるような新奇性のある知見でも得られない限りホモログの構造解析ではネイチャー誌掲載とはいかなくなる．ネイチャー誌に論文が掲載されることは素晴らしい研究の十分条件ではあろうが必要十分ではないので気に病むことはない．しかし，科学の本質，ここでは多剤排出トランスポーターの構造と機能の本質的理解に近づけば近づくほど詳細で専門的な議論となり，蒙昧な門外漢からは「いつまで重箱の隅を」と蔑まれるきらいもあるかもしれない．しかし，この四半世紀を振り返ると，随分と本質に迫りつつある自負はある．また，仮に我々の研究グループや
RND輸送体には新生鎖の膜透過など薬剤排出に関わるもの以外にも幾らかのファミリーが知られるが，本稿では，薬剤排出に関わるhydrophobe/amphiphile efflux-1 (HAE1) familyに留める．これまで明らかとなった典型的なHAE1-RND輸送体の構造と働きについての知見についてここで簡単にまとめておく．HAE1-RND輸送体は膜蛋白質である（図1）．膜貫通部分は12本のαヘリックス構造から成り，プロトン透過に関わる重要な荷電性アミノ酸対（BpeBの場合D407，D408，K939）が存在し塩橋を形成している（図1C）．これらの残基のプロトン化／脱プロトン化により，このドメインの構造変化が誘起され分子全体の構造変化へと伝搬してゆく．細胞質側にはわずかなループ部分を持つ一方，ペリプラズム側には大きな水溶性ドメインを有する．このドメインは大きく2層に分かれ，細胞膜に近い部分をポータードメイン，遠い部分をドッキングドメインという．前者は4つのサブドメイン（PN1, PN2, PC1, PC2）から成り，これらの隙間に基質結合サイトを含む基質輸送経路が形成される（図1B）．基質輸送経路中の基質結合部位は2カ所に大別され，膜に近い側のものを近位結合部位，遠いものを遠位結合部位と呼ぶ．これらの結合部位はサブドメインの相対位置の変化により拡張することで基質を結合するための高親和性状態をとり，収縮し隙間がなくなることで低親和性状態となる．またこの結合部位の拡張・収縮と共役したサブドメインの相対位置の変化は，透過経路のアクセシビリティも変化させる．当に交互アクセス機構がペリプラズムドメイン中にあるが如く，細胞内側へと開いた構造（inward-conformation）と外向けに開いた構造（outward-conformation）へと構造の蠕動運動のような動きを伴って能動的な基質輸送を行う3)．なお，この構造変化は前述の膜貫通部分の構造変化が伝搬することで起こる．
バークホルデリア菌由来BpeBの機能単位である三量体の結晶構造（リボン図）．A：細胞膜に対して側方から見たところ．基質取込口，基質結合部位を示し，結合している基質である界面活性剤（UDM）を空間充填図で描いた．B：ポータードメインの輪切り図．4つのサブドメインを明記し，A同様結合している界面活性剤を描いた．C：膜貫通ドメインの輪切り図．膜貫通ヘリックスを番号付けし，プロトン輸送に重要なアミノ酸側鎖のみボール＆スティック図で描いた．B，Cはそれぞれ細胞外側から垂直に見下ろす方向より描いた．文献7より改変して転載．
AcrBと共役するAcrAおよびTolCとの複合体形成の場であるドッキングドメインには特徴的なループ構造が存在する．典型的なHAE1-RND輸送体は三量体として存在するが，このループ構造を三量体間でお互いに挿入することでプロトマー間で二次構造を形成し三量体を強固にしている（図1A）．
三量体中の各単量体はそれぞれ構造が異なり，それぞれの構造は基質輸送サイクルにおける特定の機能状態に対応していると理解されている（図1）．それは，①：基質取込口と，近位結合部位あたりまでが開いている「取込型」（図1緑のプロトマー）．②：次に遠位結合部位が大きく開き，取込んだ基質をそこに結合させている「結合型」（図1青のプロトマー）．③：最後に基質取込口も基質結合部位も閉じ，代わりに基質透過経路の排出口にあたる部分が開き，経路外へと基質を排出する「排出型」（図1赤のプロトマー）である．三量体には常にこの3状態が含まれており，それぞれが1/3ずつ位相をずらしながら順に3拍子でこのシーケンスをたどる．このような機構はATPaseによる回転触媒機構と類似しているが，ここでは物理的な回転を伴わず構造機能状態の回帰的変化であるため「機能的回転機構」としてこれを提唱し，現在広く認知されるに至っている2),4)．
著者らはこのような動きを伴う分子機構を結晶構造に基づき提唱している．しかし，「結晶構造は静的な構造しか与えない」と考えられている．間違ってはいないが，もう少し正確に述べるなら，結晶構造は結晶中の分子のアンサンブルの時間平均をとらえていると言える．結晶構造は結晶中に含まれる夥しい数の分子の平均構造なのでその精度は申し分ないが，あくまでも平均構造であり分子構造のダイナミックな情報は含まれない．では精度の高い結晶構造で分子のダイナミックな様相はどのようにして得ればよいのか？ そのひとつの好例は筋小胞体由来カルシウムATPaseの一連の結晶構造解析であろう．ATPアナログや各種阻害剤によって反応中間体を固定し，それらの結晶構造を求めることで，反応サイクルの全容を具に現す美しいパラパラ漫画が示されている5)．我々もこれを理想としたが，残念ながらHAE1-RND輸送体には中間体を固定するような阻害剤は存在しない．そこで晶系の異なるものや相同蛋白質の構造解析をたくさん行うことで何らかの情報が得られるかもしれないと考えた．それは，2002年に解析した最初の構造が結晶学的三回対称性を持ち，機能的回転機構における「取込型」のみにより構成されるものであった事実に基づく1)．2006年に非対称的な構造を得て，三量体は上述のとおり「取込型」「結合型」「排出型」の3種により構成されるのが生理活性を持つ機能状態の構造を反映していると解釈したものの2)，2010年に発表した分子動力学計算による考察では，分子中から基質を取り除いた休止状態において，「取込型」による三量体構造もまたあり得べき構造状態であることが分かった6)．つまり，同じ蛋白質の結晶解析であっても晶系が異なるだけでもこのような機能的な様相を得ることができるのなら，相同蛋白質の構造解析を精力的に行い比較することで，何かしらの情報が得られる可能性があると考えたのである．機能的回転機構に含まれる3状態のそれぞれの間の構造は如何に遷移して行くのか？ など，遷移状態の構造をはじめ取得せねばならない情報はまだ残されていると感じていた．
Burkholderia pseudomalleiは人獣共通感染症である類鼻疽の原因菌である．類鼻疽は予後が悪く，また慢性化した際の致死率も高い．またそれ故か米CDC（疾病対策予防センター）はバイオテロが危ぶまれる病原体としてこれを挙げている．最近ではその多剤耐性株も知られており，公衆衛生上特別な対策が必要な病原菌として懸念が高まっている．B. pseudomalleiもグラム陰性細菌でありHAE1-RND輸送体による薬剤排出が多剤耐性化のひとつの大きな要因となることが知られている．大腸菌AcrBの類縁蛋白質であるBpeBは同菌の主要な排出因子として知られている．そこでこの蛋白質の結晶構造解析に取り組んだ7)．
3.0 Å分解能で解いた結晶構造は全体的にAcrB2)や緑膿菌MexB8)のような典型的なHAE1-RND輸送体の構造と基本的に似た構造をしていた（図1）7)．予測構造ではなく実験的に求めた真正なBpeBの構造情報として利用価値は期待されるものの，既知構造との類似点についての議論そのものの価値は少ないと思われた．しかし，AcrBをはじめ類縁蛋白質の立体構造と丁寧に比較することでHAE1-RND輸送体の分子機構に迫る新しい知見を得ることができた．
先ず，得られたBpeBの結晶構造を典型的なHAE1-RND輸送体であるAcrB2)とMexB8)に対して構造比較を行った（図2）．その結果，「結合型」および「排出型」モノマー，それぞれとの構造重ね合わせでは非常に高い一致をみせた（図2）．主鎖CαのRMSDはAcrBではそれぞれ1.1 Åと1.3 Å，MexBではそれぞれ1.3 Åと1.2 Åであった．一方，残るモノマーは「取込型」のはずだが，他の「取込型」モノマーとの構造重ね合わせにおいては上記2つのようには一致せず，AcrBの「取込型」との主鎖CαのRMSDは2.6 ÅでPC2サブドメインの位置に違いがあることが判った（図2A左図）．ポータードメインに含まれる4つのサブドメインそれぞれは剛体として振る舞い，それぞれの機能状態においてサブドメインの相対位置が異なる．BpeBの「取込類似型」のPC2は，AcrBの「取込型」と比較すると，よりPC1に近接していた．この部分は，本来の「取込型」では大きく開いており基質取込口となるところだが，BpeBの「取込類似型」モノマーに観られるそこは開いておらず，「排出型」の様相を残すものであった．しかし，「排出型」に観られる開いた出口は既に観られずPN1とPN2は十分近接していた．
BpeBとAcrBの構造比較．それぞれの三量体に含まれる各モノマーどうしの構造重ね合わせを行い，ズレに相当するRMSD値（Å）をスケールバーに示したように色付けした．赤いところほど構造のズレが大きい．それぞれ左から「取込型」，「結合型」，「排出型」を示す．文献7より改変して転載．
つまり，AcrBで観察された「排出型」の基質取込口と「取込型」の基質出口の両方の構造的特徴を併せ持つものであったため，これらの状態間の遷移状態を観ていると考えた（図3）．さらに，BpeBの「取込類似型」は膜貫通部分の荷電性アミノ酸対の構造についてもAcrBの「取込型」のそれとは異なっており，明らかにAcrBの「排出型」が呈する，リジン残基が2つのアスパラギン酸側鎖から外れTM11にあるトレオニンと相互作用する配座をとっていた（図3）．つまりBpeBの「取込類似型」膜貫通部分は未だ「排出型」のままだったのである．ちなみにBpeBの「排出型」の膜貫通部分は「排出型」である．これらの構造的特徴を総合することで，BpeBの「取込型」に相当するはずの構造は，実は完全には「取込型」になっておらず，基質排出口が閉じただけの「排出型」から「取込型」への遷移状態にある中間体であると解釈できた（図3，排出→取込中間体1）7)．
HAE1-RND輸送体の作動機構アップデート．これまで「取込型」，「結合型」，「排出型」の3拍子で回帰してゆくと説明されてきたが，新たに「排出型」から「取込型」へと遷移する過程において2つの中間状態「排出→取込中間体1」と「排出→取込中間体2」を加えた．各状態の模式図はそれぞれの横に示したポータードメインの構造のカット図に基づいて画いた．また各状態の膜貫通部分の荷電性アミノ酸の配座の模式図も併せて画いた．文献7より改変して転載．
加えてMexBとの比較も行った．2009年に報告されたMexBの構造解析では，AcrBとの比較において，その「取込型」における基質取込口が十分開いていない構造は観察されていたが，分子のフレキシビリティの範囲内だろうと十分な議論がなされていなかった8)．しかし，BpeBとMexBとの構造比較を行い，さらにBpeBに観られた構造の遷移と合わせて再考することで，MexBの「取込型」に相当する状態もまた「排出型」と「取込型」との間の遷移状態であると解釈することができた．MexBのPC2はBpeBとAcrBの中間ほどの位置であることが判った．つまり，MexBの基質取込口はBpeBほどは閉じていないもののAcrBのように十分に開いていない．一方，MexBの膜貫通部分の荷電性アミノ酸対の構造は，BpeBのそれとは違い，既にAcrBにも観られる「取込型」の典型的な構造となっていたため，BpeBよりさらに「取込型」へと近づいた中間体であると解釈できた．即ち，BpeBもMexBもAcrBに観られる「排出型」から「取込型」へと遷移している中間体であるが，MexBはBpeBよりAcrBの「取込型」に近い構造であると解釈できた．
以上をまとめると，「排出型」は次のように構造変化して「取込型」へとなる．①：PN1とPN2が近づく（排出口の閉鎖）．このとき膜貫通部分は未だ「排出型」であり，基質取込口も「排出型」に観られる閉状態（BpeBの「取込類似型」）．②：膜貫通部分に存在するプロトン透過に関わる重要な荷電性アミノ酸のプロトン化状態が，膜を介したプロトン濃度勾配に従い「取込型」に変化（図3）．それに伴って③：PC2とPC1が離れてゆく（MexBの「取込型」）．その後さらにPC2とPC1が離れてゆき，④：AcrBに観られる典型的な「取込型」構造となる．このような解釈がBpeBの構造解析からなされた．そこでBpeBにおける「取込類似型」に相当する状態①を，「排出→取込中間体1」と定義し，MexBの「取込型」とされていた状態③を「排出→取込中間体2」と再定義した．構造と状態の変化における遷移状態をとらえたものとして分子機構がより深く理解できた．
相同蛋白質の似た構造を解析したとて単なる二番煎じになるとは限らない9)．ユニークな新奇構造を最初に世に顕すことは誇らしいことだろう．しかし，相同蛋白質の構造として2例目，3例目の構造解析であれば逆にこれまでの構造と比較することが可能であり，より深い考察ができるようになるのである．
結晶構造解析において，その素データとなるラウエ反射を与えている分子の数は少なく見積もっても10の10乗個ともなる．結晶構造はその平均構造であり精度が高い．また，回折という物理現象そのものにおいては人為的なエラーが入る余地がない．その信頼性が結晶屋として著者らが結晶解析に多くを期待する理由のひとつである．一方，昨今のクライオ電子顕微鏡解析の技術的発達は驚異的であり，大いに称賛するとともに我々もその恩恵に与っている10),11)．とりわけ，複数種の構造の分類およびそれぞれの平均化による構造の動的解析については特に期待があつまるところである．しかし，より信頼できる構造解析のために技術的に越えなければならない課題としては，部分変性や一部がアンフォールドしたような蛋白分子由来の画像をシステマティックに排除する手法の開発だろう．結晶解析には結晶化という骨の折れる実験過程があるが，この過程はこのような部分変性した分子の排除を伴う．結晶状態をとっている蛋白分子には不揃いな部分変性体のようなものは含まれず，或いは極少量そのようなものが格子中に含まれたとしてもそれらはラウエ反射を与えない．その結果得られる結晶構造は分子としてきちんとしたものによるものだと保証付きのものとなる．その点についても著者らが結晶解析に未だにこだわる理由のひとつでもある．しかし，結晶化はしんどい．一方，クライオ電顕解析はその苦労がなく，昨今得られる構造の解像度についても結晶解析に匹敵する．そういうわけで電顕屋の人口は増加傾向にあり電顕解析によるPDB座標はうなぎ登りではあるが，我々は本稿で述べたような結晶解析のメリットに期待してそれを続けている．今後とも結晶解析による精緻な構造に基づく生体分子の機能解析において新たなサイエンスが拓けることを示していきたい．
村上 聡（むらかみ さとし）
東京工業大学生命理工学院教授
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岡田有意（おかだ うい）
東京工業大学生命理工学院助教
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山下栄樹（やました えいき）
大阪大学蛋白質研究所准教授
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