特集 短鎖ペプチドを用いた凝集性タンパク質を原因とする神経変性疾患治療薬開発
アミロイドβを分解するJAL-TA9（低分子酵素ペプチド）の発見
2024 年 159 巻 6 号 p. 386-390
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2024 年 159 巻 6 号 p. 386-390
アルツハイマー病（AD）の原因の一つであるアミロイドβ（Aβ）42は，アミロイド前駆体タンパク質（APP）がβセクレターゼまたはγセクレターゼによって切断されることによって産生される．Aβ42オリゴマーは強い神経毒性を示すことから，Aβ42は治療薬開発の効率的な標的となる可能性が予測されている．我々は，所有するペプチドライブラリーを用いてMMP7を活性化するペプチドをスクリーニングし，Tob1タンパク質のBoxA領域に由来する合成ペプチドJAL-TA9（YKGSGFRMI）がタンパク質分解活性を示すことを見出した．一般に，酵素は数千個以上のアミノ酸からなる高分子タンパク質であるとされ，低分子合成ペプチドが酵素活性を持つという報告は今までにない．世界で初めて発見した酵素活性を持つペプチドの総称として我々はCatalytideと名付けた．本研究では，JAL-TA9が可溶性Aβ42だけでなく，固形状態のAβ42に対しても切断活性を持つことを明らかにした．さらに，AD患者の脳切片を用いて切断活性を実証した．JAL-TA9はアルツハイマー病患者の脳に蓄積したAβ42の量を減少させた．以上のことから，JAL-TA9はこれまでにないアルツハイマー病の根本的治療薬の開発にとって魅力的なシーズペプチドである．
Amyloid-β (Aβ) 42, one of the causes of Alzheimer’s disease (AD), is produced by the cleavage of amyloid precursor protein (APP) by β- or γ-secretases. Since Aβ42 oligomers exhibit strong neurotoxicity, Aβ42 is predicted to be a potentially efficient target for drug therapies. Recently, we screened peptides that activate MMP7 using our peptide library and found that the synthetic peptide JAL-TA9 (YKGSGFRMI), which is derived from the BoxA region of Tob1 protein, showed proteolytic activity. It is generally accepted that an enzyme should be a large molecular protein consisting of more than thousands of amino acids. Thus, this is the first finding that a small synthetic peptide has protease activity, and we termed Catalytide as the general name of peptides with protease activity. In this study, we demonstrate the cleavage activity of JAL-TA9 not only against the authentic soluble form of Aβ42 but also against the solid type of Aβ42 in the central region. In addition, we demonstrated the cleavage activity using brain slices of AD patients. JAL-TA9 decreased the amount of accumulated Aβ42 in the brain of Alzheimer’s patients. Taken together, JAL-TA9 is an attractive seed for the development of peptide drugs with a new strategy for Alzheimer’s disease.
所属する研究室では，抗体作成のために合成したがん遺伝産物由来の抗原ペプチドを1,000種類以上保有しており，抗原ペプチドに何か新しい活性がないのか？という発想の基研究を開始した．生合成されたタンパク質は，フォールディングにより，正しく折りたたまれ特定の機能を持つが，折り畳みが正しく機能しないと，ミスフォールディングが起き，凝集体が形成されアルツハイマー病やパーキンソン病などのいわゆるフォールディング病が引き起こされる．そのため，フォールディング病の治療薬開発を目指した抗体やケミカルシャペロンの探索が行われている．このことから，保有する抗原ペプチドの新たな生理活性の一つとしてシャペロンペプチドの存在を仮定し，保有しているペプチドを用いてMMP-7の酵素活性の上昇を指標として，シャペロンペプチドの検索を行った．
活性型MMP-7の調整は，透析によるリフォールディング，トリプシンなどでプロドメインを切断除去することで調整する．そこで透析の代わりにペプチドを添加し，MMP7の活性を測定することでシャペロンペプチドのスクリーニングが行えると考えた．酵素活性の上昇はMMP7の蛍光基質である3163 Vを用いて蛍光強度で評価した．その結果，リフォールディング前の不活性型MMP-7（u-proMMP-7）を活性化するペプチドとしてJAL-AK22（KYEGHWYPEKPYKGSGFRCIHI）を見出した．MMP-7の活性化にはリフォールディングとプロドメインの除去の2つstepがあることから，JAL-AK22の作用点を明らかにするため次に，フォールディング後の不活性型MMP-7（proMMP-7）にトリプシンの代わりにJAL-AK22を添加し検討した．JAL-AK22を添加しない場合に比べ不活性型proMMP-7の酵素活性が上昇していることが明らかとなった．このことから，JAL-AK22はシャペロン活性ではなく，トリプシン同様にproMMP-7のproドメインを酵素活性にて分解除去することで，MMP-7の酵素活性を上昇させていることが示唆された（図1）．
JAL-AK22は自己消化活性を示すことから，自己消化活性を指標に構造活性相関を行なった．PBS中で各ペプチドを37°Cでインキュベーションし，反応開始直後及び24時間後の反応液をHPLCにて分析，反応開始直後のピーク高さを基に24時間後のピーク高さから減少率を算出した．結果，最も強い自己消化活性を示すペプチドとしてJAL-AK22のシステインをメチオニンに置換した9残基ペプチドJAL-TA9（YKGSGFRMI）を同定した（図2）．
（A）クロマトグラムと減少率の計算式．（B）各フラグメントペプチドの反応開始直後のピーク高さを基に反応24時間後の高さから算出した減少率．
次にJAL-TA9の酵素的性質の検討を行った．先ず，プロテアーゼの種類を明らかにするために阻害薬による自己消化活性への影響を検討した．JAL-TA9にはSer残基が含まれていることからセリンプロテアーゼ阻害薬であるAEBSFを用いて自己消化活性が阻害されるか評価を経時的にHPLCで評価した．その結果，反応開始6時間後にはAEBSF存在下でJAL-TA9由来のピークの消失し2種類の新たなピークが認められたが，AEBSF非存在下で認められたJAL-TA9の自己消化由来のピークは認められなかった．そこで，新たに認められた2種類のピークを分取後，MSにて分子量を確認したところ，AEBSFとJAL-TA9の複合体と考えられる分子量が確認でき，MS/MSにより解析した結果，JAL-TA9のセリン残基を介してAEBSFが結合することで，JAL-TA9の自己消化活性を阻害していることが明らかになり，JAL-TA9はセリンプロテアーゼ様の酵素活性を有していると明らかになった．次に，至適条件を検討した結果，JAL-TA9はPBS緩衝液中37°Cで最も強い自己消化活性を示すことが明らかになった．
JAL-TA9は，Tob/BTGファミリーに属するTob1タンパク質の相同性の高い領域であるBoxA領域由来合成ペプチドである1,2)．Tob1タンパク質は細胞周期抑制因子であり，PolyA binding proteinに結合しmRNAの分解を促進することで細胞周期に関与する等の報告がされているが，タンパク質自身に酵素活性を有する等の報告は見当たらず，JAL-TA9が何を基質にするのか見当がつかなかった．
そこで，JAL-TA9はpro-MMP-7のプロドメインを除去することでMMP-7を活性化するJAL-AK22由来フラグメントペプチドであることから，MMP-7の活性発現に必要な切断点を含むプロドメイン由来フラグメントペプチド（MMP-FP）を基質とし，JAL-TA9の切断活性の検討を行った．反応はPBS緩衝液中37°Cで24時間行い，HPLC及びMSを用いて反応液を解析した．その結果，基質由来のピークは消失し新たなピークの出現が確認でき，さらにMSにより出現したピークを解析した結果MMP-FPをJAL-TA9が分解していることが明らかになった（図3）．
（A）反応開始直後と24時間反応後のクロマトグラム．（B）反応24時間後の分取用クロマトグラム（J：JAL-TA9由来，M：MMP18-33由来）．（C）質量分析によるフラグメントペプチドの同定．（D）JAL-TA9によるMMP18-33の切断点．
今までに酵素活性を有するペプチドが存在するという報告はなく本研究が初めての報告である．そこで，我々はこのような酵素活性を有する低分子合成ペプチドの総称としてCatalytide（Catalytic Peptide）と名付けた3,4)．
研究室内では，フラグメントペプチドを用いてプリオンタンパク質，アミロイドベータ42（Aβ），αシヌクレイン等の凝集メカニズムに関する研究を行っていた．そのため，本研究では，神経変性疾患の治療薬シーズになり得ないかと考えアルツハイマー病（AD）をターゲットに治療薬の可能性を探索することを目的として検討を行った．
ADは高齢者の認知症に多く見られる神経変性疾患の一つであるが，未だ根本的な治療方法は確立されておらず，対症療法に留まっている．ADの発症仮説は様々な説が提唱されているが，近年レカネマブが承認されたことより，アミロイド仮説が再注目されている．Aβはアミロイド前駆タンパク質がβ・γセクレターゼにより分解されて産生される．産生されたAβは通常であれば分解や凝集抑制により無毒化されるが，何らかの要因により凝集が起こり，オリゴマーや老人斑が生成される．これらはシナプス毒性を持ち，神経細胞障害を誘発・神経細胞死を引き起こすとされている．このことから，JAL-TA9がAβを分解することができればJAL-TA9が根本的な治療薬になり得るのではないかと考えた．
そこで個体及び可溶性のAβ42に対する切断活性の検討を行った．JAL-TA9の酵素活性の検討はPBS緩衝液中37°Cで反応を行い，反応液をHPLC及びMSにて解析した．
本研究室で保有するペプチド合成機で固相法により合成したAβ42は固体状態（s- Aβ42）となり，緩衝液やDMSOなどに溶解しなかったため，固体のままJAL-TA9と溶液中で反応を行った．固体状態のAβ42のピークはHPLCにて検出が出来ないため，JAL-TA9の自己消化を指標に反応の進行を確認した．その結果，3日目にはJAL-TA9自身のピークが消失し新たなピークの出現が認められ，その後7日目までクロマトグラムの変化が確認できた．7日目に全てのピークを分取して切断点の同定を行った結果，A1-A10がJAL-TA9によって切断されたAβ42由来のフラグメントペプチドであることが確認できた．また反応前のAβの固い個体がこのようにもろい形状になることが確認できた（図4A，C）．
（A）固体のAβ42とJAL-TA9を反応後HPLCにて解析したクロマトグラム及び固体の顕微鏡写真．上段；反応開始直後，下段；反応7日後．（B）可溶性状態のAβ42とJAL-TA9を反応後HPLCにて解析したクロマトグラム．（C）各Aβ42に対するJAL-TA9の切断点．
次に，購入した可溶性のAβ42に対しても同様の検討を行った結果，新たなピークが出現しA1-A5がJAL-TA9により分解されたAβ42由来のフラグメントペプチドであることが明らかとなった（図4B，C）．次にそれぞれのAβ42に対する切断量を計算した．固体の場合は反応前の固体の重さと反応後の固体の重さから算出し，1週間で19％切断していることが明らかとなった．可溶性のAβ42はA3のVGGVVIAを標品として合成し検量線から求め，18.0％切断することが明らかとなった．このことから，JAL-TA9はAβ42を1週間で2割近く分解することが明らかとなった5)．
ここまでで，JAL-TA9がAβ42を分解することが明らかになったが，実際にアルツハイマー病により脳内に沈着したAβ42を分解することができるのか？ これを明らかにするために次にAD患者脳パラフィン包埋ブロックを用いて検討した．脳パラフィン包埋ブロックからグループA及びBと二組のミラー切片を作成しJAL-TA9と一週間反応を行ない，その反応液をHPLC及びMSを用いて解析し，反応後の切片はanti-Aβ42抗体を用いて免疫染色を行った．HPLCの結果ではJAL-TA9添加群でグループA・Bで非添加群と比較して複数の新たなピークが確認でき，これらのピークをMSにより解析した．その結果Aβ42由来のJAL-TA9により分解されたフラグメントペプチドが数種類確認でき，複数の部位でJAL-TA9がAβ42を分解していることが明らかになった（図5A）．これらの結果からJAL-TA9はAD患者脳内に沈着したアミロイドを分解することが明らかになった．反応後の脳組織を免疫染色した結果，anti-Aβ42抗体により染色されたアミロイドがJAL-TA9存在下では減少していることが明らかになり（図5B），JAL-TA9は脳内に沈着したAβ42を分解することで，脳内のAβ42沈着量を減少させていることが明らかになった．
（A）AD患者脳切片に沈着したAβ42に対するJAL-TA9の切断点．（B）抗Aβ42抗体を用いた免疫染色の像．
今までに低分子ペプチドが酵素活性を有するという報告はなく，我々はJAL-TA9のような酵素活性を有する低分子合成ペプチドをCatalytideと命名した．Catalytideの一つであるJAL-TA9はAPPの状態から病原性を持つオリゴマーまで，さらには組織に沈着したAβまで分解することが考えられた．このことから，JAL-TA9は，予防から治療まで幅広く使用できる，アルツハイマー病治療薬のシーズとなることが期待できた．
これまでは，酵素活性は高分子のタンパク質固有の性質であると考えられており，低分子ペプチドが酵素活性を有するという報告はない．そのため，そのため，本研究はシャペロンペプチドの探索からスタートし2009年にシャペロンペプチドに関する論文が認められてから酵素ペプチド（Catalytide）の存在を認めてもらえるまでに10年を要した．中には，データはCatalytideの存在を示しているが「信じたくない」と言われることもあった（新規性が高いと褒めてくれていると思えて頑張れた）．1報目が受理されてからは構造活性相関含む論文が続けて受理された．その後，研究をin vitroからin vivoへ広げ後続の先生方が記載するように研究が発展した．Catalytideは凝集性のタンパク質に対して強い切断活性を示すことが明らかになっていることから，ADに限らず種々の神経変性疾患の原因とされている凝集性タンパク質を分解するCatalytideの同定・開発にも注力していきたい6)．
中村 里菜（O-Force合同会社）．
