2013年にASCO/CAPガイドラインが改訂され，乳癌のHER2検査におけるimmunohistochemistry（IHC），in situ hybridization（ISH）の判定基準が変更された。今回は，改訂前後のHER2-FISH判定の変化を検討した。当院にて2014年4月から2016年3月の間にHER2-FISH検査が行われた浸潤性乳癌症例226例を対象とした。ガイドライン改訂後の判定基準により再評価し，以前の結果と比較した。判定結果が変化した症例は，ER，PgR，HER2-IHCの結果との関連についても検討した。226例中，改訂後の判定基準によるPositive症例は37例であった。37例中2例は，HER2/CEP17比2.0未満だが平均HER2遺伝子コピー数6.0以上の症例であった。Equivocal症例は24例で，以前の基準での判定結果と比較して有意に増加した（p < 0.01）。再評価により判定結果の変化した症例25例（Positive 2例，Equivocal 23例）は全て，以前の基準ではNegativeと判定された症例であった。これらのうち4例（Positive 1例，Equivocal 3例）は，Triple negative乳癌であった。今回の結果から，2013ASCO/CAPガイドラインを適応することで，抗HER2薬対象患者がひろがることが示唆された。
浸潤性乳癌の15～25%に，human epidermal growth factor receptor type 2（以下HER2）の遺伝子増幅とタンパクの過剰発現が認められる。HER2検査はトラスツズマブなどの抗HER2治療薬適応の判定に必要不可欠である1),2)。HER2の遺伝子増幅およびタンパク過剰発現が確認された転移性乳癌に対するトラスツズマブの効果は，単剤3),4)および化学療法との併用5)での奏効率，無増悪期間（time to progression; TTP），生存期間などの指標において有意な改善をもたらすことが証明されている。現在では，HER2遺伝子増幅とタンパクの過剰発現を認める転移性乳癌だけでなく術後の補助療法6)および早期乳癌における術前療法7)も適応対象となり，HER2検査の重要性がますます高まってきている。現在，HER2タンパク過剰発現の確認方法はimmunohistochemistry（以下IHC）を用いている。HER2遺伝子の増幅の確認には様々な方法が存在するが，fluorescence in situ hybridization（以下FISH）法を用いるのが一般的である。
HER2検査の判定基準は，1998年にアメリカFood and Drug Administration（FDA）がトラスツズマブを承認して以降，幾度かの変遷を重ねている。2007年にAmerican Society of Clinical Oncology（ASCO）/College of American Pathologists（CAP）は，dual-probe ISHによるHER2シグナル総数／CEP17シグナル総数比（以下HER2/CEP17比）2.2以上をPositive，1.8～2.2をEquivocal，1.8未満をNegativeとしたガイドラインを作成し8)，最近まで世界的な判定基準として使用されてきた。その後，2013年にASCO/CAPガイドラインが改訂9)され，IHCおよびISHによる検査の判定基準に変更が加えられた（Table 1）。新しいdual-probe ISHの基準では，HER2/CEP17比2.0以上，及び，2.0未満でも平均HER2遺伝子コピー数6.0以上をPositive，HER2/CEP17比2.0未満かつ，平均HER2遺伝子コピー数4.0～6.0未満をEquivocal，4.0未満をNegativeと判定される（Figure 1）。この判定基準の変更により，HER2-FISH判定結果に変化が生じ，乳癌患者の治療選択に大きな影響を与えることが推測される。しかし，多くの施設では未だに新しいガイドラインに移行できていないのが現状である。今回我々は，HER2-FISHの判定を目視ではなく，画像解析装置を用いて自動的にシグナル数をカウントし判定した。この方法により客観的および再現性のある判定結果を基に，改訂後のガイドラインにより再評価し，判定結果に与える影響について若干の知見を得たので報告する。また，再評価により新たにPositive，Equivocalに分類された症例に対する治療選択の変化についても考察する。
| 2007 | 2013 | |
|---|---|---|
| Positive | R ≥ 2.2 | R ≥ 2.0 or 2.0 > R and HER2 N ≥ 6.0 |
| Equivocal | 2.2 > R ≥ 1.8*1 | 2.0 > R and 6.0 > HER2 N ≥ 4.0*2 |
| Negative | 1.8 > R | 2.0 > R and 4.0 > HER2 N |
R: HER2/CEP17 ratio, HER2 N: Average HER2 gene copy number
*1: Count additional cells for ISH or retest, or test with HER2 IHC.
*2: Must order a reflex test (same specimen using IHC), test with alternative ISH chromosome 17 probe or order a new test (new specimen if available, ISH or IHC).
Representative HER2 status and FISH signal patterns (red signals = HER2 gene, green signals = CEP17)
A) The case that was diagnosed as positive (HER2/CEP17 ratio = 5.5, Average HER2 gene copy number = 13.0). B) The case that was diagnosed as positive by the 2013 ASCO/CAP guideline (HER2/CEP17 ratio = 1.1, Average HER2 gene copy number = 6.5). This case was diagnosed as negative by the previous criteria. C) The case that was diagnosed as equivocal by the 2013 ASCO/CAP guideline (HER2/CEP17 ratio = 1.1, Average HER2 gene copy number = 4.3). This case was diagnosed as negative by the previous criteria. D) The case that was diagnosed as negative (HER2/CEP17 ratio = 1.1, Average HER2 gene copy number = 2.3).
当院にて2014年4月から2016年3月の間にHER2-FISH検査が行われた浸潤性乳癌症例226例を対象とした。材料は，10%中性ホルマリンで6～72時間固定した。今回再評価した症例はすべて浸潤性乳癌の原発巣の針生検検体である。
2． FISH法材料は4～5 μmの厚さに薄切した組織切片を使用した。プローブはPathVysion HER2 DNAプローブキット（Abbott社）を用いて行った。FISH法の前処理は自動前処理機VP2000（Abbott社）を用い，添付文書10)に従って実施した。
3． FISH法の判定方法IHCにてHER2タンパクの染色分布と強度を確認した後，FISH標本をスクリーニングし，HER2タンパク発現の高い部分の細胞を選択した。シグナル計測は，画像解析装置Metafer（Carl Zeiss社）を用いて自動カウントを行った。同時に細胞同定能力を有する病理検査担当技師が目視でダブルチェックを行った。判定結果が不一致の場合は，複数の技師で計測・判定した。乳癌細胞少数などの理由により画像解析装置による自動カウントが困難な場合は技師が目視で行い，判定結果が明らかでない場合は複数の技師で計測・判定した。それぞれの症例について中間値171個（最大細胞数913個，最小細胞数20個）の乳癌細胞のシグナル数をカウントし，平均HER2遺伝子コピー数，平均CEP17コピー数，HER2/CEP17比を算出した。
4． IHC法材料は3～4 μmの厚さに薄切した組織切片を使用し，ベンタナXTシステムベンチマーク（Roche Diagnostics社）を用いてIHCを行った。Estrogen receptor（ER），Progesterone receptor（PgR），HER2は，それぞれベンタナ I-VIEWコンファームER（SP1），ベンタナI-VIEWコンファームPGR（IE2），ベンタナI-VIEWパスウェーHER2（4B5）のキットを用いて実施した。ER，PgR，HER2-IHCの判定は，日本病理学会認定病理専門医が行った。ER，PgRについては，同一標本上の正常乳管上皮細胞を内部陽性コントロールとして評価を行った。
5． 検討項目全ての症例について2013 ASCO/CAPガイドラインの判定基準で再評価し，以前の基準での判定結果と比較した。新たにPositive およびEquivocalに判定された症例については，ER，PgR，およびHER2タンパクの結果との関連を調査した。また，HER2-FISH結果と平均CEP17コピー数についての関連も比較検討した。
6． 統計解析統計解析は，JMP11（SAS社，米国）を用いて行った。ガイドライン改訂前後のPositive症例，Equivocal症例，Negative症例数の割合の比較にはFisherの正確確率検定を使用した。改訂後のガイドラインによって新たにPositive，Equivocalと判定された症例と，従来のPositive，Negative症例との平均CEP17コピー数の差の比較は，Mann–Whitney U検定を用いて行った。p値が0.05未満の場合を統計学的に有意であるとした。
7． 研究の倫理審査承認本研究は，名古屋第二赤十字病院治験・臨床研究審査委員会の承認（整理番号No. 1156）を得て行った。
2013 ASCO/CAPガイドラインにより再評価したHER2-FISHの判定結果をTable 2に示した。画像解析装置により全症例の89.8%（203/226）で自動カウントが可能であり，Positive症例，Equivocal症例，Negative症例の自動カウント率は，それぞれ91.9%（34/37），91.7%（22/24），89.0%（147/165）であった。
| 2007 | 2013 | p-value | |
|---|---|---|---|
| Positive | 35 (15.5%) | 37 (16.4%) | 0.797 |
| Equivocal | 1 (0.4%) | 24 (10.6%) | < 0.001 |
| Negative | 190 (84.1%) | 165 (73.0%) | 0.011 |
*Fisher’s exact test ; Significant, p < 0.05
226例中，ガイドライン改訂後の判定基準によるPositive症例は37例（16.4%）であった（Table 3）。Positive 37例中2例は，HER2/CEP17比2.0未満だが平均HER2遺伝子コピー数6.0以上の症例であった。これらは以前の判定基準ではNegativeに分類されていた症例であった。また，Equivocal症例は24例（10.6%）で，以前の基準での判定結果と比較して有意に増加した（p < 0.05, Table 4）。Equivocal症例24例中1例は，以前の判定基準でもEquivocalと判定された症例で，残りの23例はNegativeと判定された症例であった。一方でNegative症例は165例（73.0%）で，ガイドライン改訂前後で有意に減少した（p < 0.05）。
| Cases | IHC | FISH | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| HER2 | ER | PgR | HER2N | CEP17N | R | Change in the HER2-FISH results | |
| 1 | 1 | (−) | (−) | 6.5 | 5.9 | 1.1 | Negative to positive |
| 2 | 2 | (−) | (−) | 7.4 | 6.4 | 1.3 | Negative to positive |
| 3 | 2 | (+) | (−) | 15.1 | 2.9 | 5.1 | Positive to positive |
| 4 | 2 | (+) | (−) | 19.2 | 4.7 | 4.1 | Positive to positive |
| 5 | 2 | (+) | (+) | 5.9 | 2.4 | 2.4 | Positive to positive |
| 6 | 2 | (+) | (+) | 29.8 | 3.0 | 9.9 | Positive to positive |
| 7 | 3 | (−) | (−) | 9.2 | 2.4 | 3.1 | Positive to positive |
| 8 | 3 | (−) | (−) | 11.6 | 2.8 | 4.1 | Positive to positive |
| 9 | 3 | (−) | (−) | 13.0 | 2.4 | 5.5 | Positive to positive |
| 10 | 3 | (−) | (−) | 18.7 | 4.3 | 4.3 | Positive to positive |
| 11 | 3 | (−) | (−) | 12.3 | 3.4 | 3.6 | Positive to positive |
| 12 | 3 | (−) | (−) | 11.1 | 2.3 | 4.9 | Positive to positive |
| 13 | 3 | (−) | (−) | 14.0 | 2.0 | 6.9 | Positive to positive |
| 14 | 3 | (−) | (−) | 15.8 | 2.3 | 7.0 | Positive to positive |
| 15 | 3 | (−) | (−) | 18.2 | 3.9 | 4.6 | Positive to positive |
| 16 | 3 | (−) | (−) | 13.0 | 3.5 | 3.7 | Positive to positive |
| 17 | 3 | (−) | (−) | 18.8 | 2.9 | 6.4 | Positive to positive |
| 18 | 3 | (−) | (−) | 15.8 | 3.6 | 4.4 | Positive to positive |
| 19 | 3 | (−) | (−) | 15.0 | 2.1 | 7.1 | Positive to positive |
| 20 | 3 | (−) | (−) | 12.8 | 2.4 | 5.3 | Positive to positive |
| 21 | 3 | (−) | (−) | 13.8 | 2.2 | 6.4 | Positive to positive |
| 22 | 3 | (−) | (−) | 10.7 | 2.6 | 4.1 | Positive to positive |
| 23 | 3 | (+) | (−) | 19.6 | 3.3 | 5.9 | Positive to positive |
| 24 | 3 | (+) | (−) | 14.6 | 2.0 | 7.2 | Positive to positive |
| 25 | 3 | (+) | (−) | 15.3 | 2.3 | 6.5 | Positive to positive |
| 26 | 3 | (+) | (−) | 14.3 | 2.4 | 6.0 | Positive to positive |
| 27 | 3 | (+) | (−) | 9.5 | 2.4 | 4.0 | Positive to positive |
| 28 | 3 | (+) | (−) | 6.1 | 1.7 | 2.8 | Positive to positive |
| 29 | 3 | (+) | (−) | 11.1 | 3.8 | 2.9 | Positive to positive |
| 30 | 3 | (+) | (−) | 10.0 | 2.0 | 5.0 | Positive to positive |
| 31 | 3 | (+) | (−) | 15.1 | 2.8 | 5.4 | Positive to positive |
| 32 | 3 | (+) | (+) | 10.5 | 3.3 | 3.2 | Positive to positive |
| 33 | 3 | (+) | (+) | 12.0 | 2.0 | 5.9 | Positive to positive |
| 34 | 3 | (+) | (+) | 19.2 | 3.2 | 6.1 | Positive to positive |
| 35 | 3 | (+) | (+) | 15.5 | 3.7 | 4.2 | Positive to positive |
| 36 | 3 | (+) | (+) | 20.4 | 3.0 | 6.7 | Positive to positive |
| 37 | 3 | (+) | (+) | 24.1 | 3.2 | 7.6 | Positive to positive |
HER2N: Average HER2 gene copy number
CEP17N: Average CEP17 copy number, R: HER2/CEP17 ratio
| Cases | IHC | FISH | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| HER2 | ER | PgR | HER2N | CEP17N | R | Change in the HER2-FISH results | |
| 1 | 1 | (+) | (+) | 4.0 | 2.2 | 1.8 | Equivocal to equivocal |
| 2 | 0 | (−) | (−) | 4.6 | 4.0 | 1.1 | Negative to equivocal |
| 3 | 0 | (−) | (−) | 4.0 | 2.6 | 1.5 | Negative to equivocal |
| 4 | 0 | (+) | (+) | 4.2 | 4.1 | 1.0 | Negative to equivocal |
| 5 | 0 | (+) | (+) | 4.1 | 3.7 | 1.1 | Negative to equivocal |
| 6 | 0 | (+) | (+) | 5.1 | 4.5 | 1.1 | Negative to equivocal |
| 7 | 0 | (+) | (+) | 4.6 | 4.1 | 1.1 | Negative to equivocal |
| 8 | 1 | (−) | (−) | 4.6 | 3.6 | 1.3 | Negative to equivocal |
| 9 | 1 | (+) | (−) | 4.1 | 3.0 | 1.3 | Negative to equivocal |
| 10 | 1 | (+) | (−) | 4.0 | 3.8 | 1.1 | Negative to equivocal |
| 11 | 1 | (+) | (+) | 4.0 | 3.0 | 1.4 | Negative to equivocal |
| 12 | 1 | (+) | (+) | 4.0 | 3.6 | 1.1 | Negative to equivocal |
| 13 | 1 | (+) | (+) | 5.7 | 4.1 | 1.4 | Negative to equivocal |
| 14 | 1 | (+) | (+) | 5.2 | 4.3 | 1.2 | Negative to equivocal |
| 15 | 1 | (+) | (+) | 4.3 | 3.1 | 1.4 | Negative to equivocal |
| 16 | 1 | (+) | (+) | 4.1 | 3.9 | 1.1 | Negative to equivocal |
| 17 | 1 | (+) | (+) | 4.0 | 3.3 | 1.2 | Negative to equivocal |
| 18 | 1 | (+) | (+) | 4.6 | 4.1 | 1.1 | Negative to equivocal |
| 19 | 1 | (+) | (+) | 5.8 | 5.8 | 1.0 | Negative to equivocal |
| 20 | 1 | (+) | (+) | 4.2 | 3.9 | 1.1 | Negative to equivocal |
| 21 | 1 | (+) | (+) | 5.4 | 4.9 | 1.1 | Negative to equivocal |
| 22 | 2 | (+) | (+) | 4.8 | 4.5 | 1.1 | Negative to equivocal |
| 23 | 2 | (+) | (+) | 4.0 | 4.2 | 1.0 | Negative to equivocal |
| 24 | 2 | (+) | (+) | 4.5 | 3.5 | 1.3 | Negative to equivocal |
HER2N: Average HER 2 gene copy number
CEP17N: Average CEP17 copy number, R: HER2/CEP17 ratio
ガイドライン改訂により判定結果が変化した症例とER，PgR，HER2-IHCとの関係をTable 5に示した。新たにPositiveと判定された 2例中1例（50%）および，Equivocalと判定された24例中3例（12.5%）は，以前の判定基準でER（−），PgR（−），HER2-IHC（−）のTriple negative乳癌であった。
| Cases with change in the HER2-FISH results | ||
|---|---|---|
| Negative to positive (n = 2) |
Negative to equivocal (n = 23) |
|
| ER (+), PgR (+), HER2-IHC (−) | 0 (0.0%) | 15 (65.3%) |
| ER (+), PgR (+), HER2-IHC (±) | 0 (0.0%) | 3 (13.0%) |
| ER (+), PgR (−), HER2-IHC (−) | 0 (0.0%) | 2 (8.7%) |
| ER (−), PgR (−), HER2-IHC (±) | 1 (50.0%) | 0 (0.0%) |
| ER (−), PgR (−), HER2-IHC (−) | 1 (50.0%) | 3 (13.0%) |
また，2013 ASCO/CAPガイドラインにより新たにPositive，Equivocalと判定された症例の平均CEP17コピー数は，中間値がそれぞれ6.2（N = 2，最小値：5.9，最大値：6.4），3.9（N = 24，最小値：2.2，最大値：5.8）であり，Negative症例だけでなく，従来のPositive症例と比較してもそれぞれ有意に高かった（p < 0.05, Table 6）。さらに，HER2-IHCとの関連では，HER2-FISHにより新たにPositiveと判定された2例中1例は Equivocal（2+），1例はNegative（1+）であった（Table 7）。Equivocalと判定された 24例中，3例はEquivocal（2+），21例はNegative（1+：15例，0：6例）であった。
| HER2-FISH | ||||
|---|---|---|---|---|
| Positive (n = 37) |
Equivocal (n = 24) |
Negative (n = 165) |
||
| R ≥ 2.0 (n = 35) |
HER2 N ≥ 6.0 (n = 2) |
|||
| Average CEP17 copy number | 2.8 (1.7–4.7) | 6.2 (5.9–6.4) | 3.9 (2.2–5.8) | 2.6 (1.3–4.7) |
 |
||||
R: HER2/CEP17 ratio, HER2 N : Average HER2 gene copy number median (Minimum–Maximum)
*Mann–Whitney U test; Significant, p < 0.05
| HER2-IHC | HER2-FISH | |||
|---|---|---|---|---|
| Positive (n = 37) |
Equivocal (n = 24) |
Negative (n = 165) |
||
| R ≥ 2.0 (n = 35) |
HER2 N ≥ 6.0 (n = 2) |
|||
| Positive, 3+ | 31 (88.6%) | 0 (0.0%) | 0 (0.0%) | 0 (0.0%) |
| Equivocal, 2+ | 4 (11.4%) | 1 (50.0%) | 3 (12.5%) | 13 (7.9%) |
| Negative, 0/1+ | 0 (0.0%) | 1 (50.0%) | 21 (87.5%) | 152 (92.1%) |
R: HER2/CEP17 ratio, HER2 N: Average HER2 gene copy number
浸潤性乳癌では，局所療法に加え，全身療法としての化学療法・ホルモン療法・分子標的治療が組み合わされて行われる11)。その治療法選択は，癌細胞の広がりによる病期分類と，癌細胞の遺伝子発現によるサブタイプ分類に基づき決定される。そのため，HER2検査の結果は患者の治療法選択に大きく影響を与えている。トラスツズマブが浸潤性乳癌の術前療法においても承認された後は，特に生検検体でのHER2検査が重要となっている。
2013 ASCO/CAPガイドライン改訂により，dual-probe ISHの基準に，平均HER2遺伝子コピー数による検討項目が追加された。以前の基準では，HER2/CEP17比のみによる判定であったため，特にシグナルが密集している場合，平均HER2遺伝子コピー数，平均CEP17コピー数は目視による概数値でも判定結果に影響を与える可能性は低かったと思われる。しかし，改訂後のガイドラインでは，HER2/CEP17比が同じでも平均HER2遺伝子コピー数が変わると判定結果に影響を及ぼすことから，より厳密にシグナルのカウントを行う必要がある。今回の検討では，画像解析装置により，多くの症例についてシグナルを自動カウントで計測しており，客観的かつ再現性のある判定を行うことが可能であった。現在までに，自動カウントによる方法を用いてガイドライン改訂前後での判定結果を比較した報告はない。CEP17は，17番染色体のセントロメア領域に対するプローブであり，CEP17のシグナル数増加は17番染色体のpolysomyを意味する。2013 ASCO/CAPガイドライン改訂によりNegativeからEquivocalに変更された症例のほとんどはpolysomyを示す症例であった。このことから，従来以上にCEP17の正確な評価が重要となった。目視によるカウントには限界が少なからず存在し，観察者間の相違も少なくないのが現状である。自動カウントの導入により，客観性を担保した，精度の高い診断が期待される。
今回我々は，改訂後のガイドラインの判定基準によりHER2-FISH結果を再評価した。その結果，以前の基準の場合と比較して，Positive，Equivocal症例がそれぞれ増加した。これは，過去の報告と同様の結果であった12)～15)。我々の検討では，Equivocal症例の増加が特に顕著であった。2013 ASCO/CAPガイドラインには，Equivocalと判定された場合，リフレックステスト（IHC法を用いて同じ検体で），代替Ch17プローブを用いたISH法，または新たな検査（IHCまたはISH法を用いて可能なら新たな検体で）の実施が推奨されている9)。過去の報告では，Equivocal症例に対して代替Ch17プローブを用いたFISH法による再検査を行い，約半数がPositive判定へ再分類された症例もある16)。しかし，生検検体の場合，癌細胞や視野数が限られており，リフレックステストの意義は少ないことが報告されている17)。また，新たな検体を採取することによる患者への負担や，追加検査によるコストの高騰も危惧されている18)。一方で2013 ASCO/CAPガイドラインには，リフレックステストによりHER2過剰発現が確定できない症例では，抗HER2薬による最終的な治療決定は，病理医と臨床医および患者との話し合いが推奨されている9)。この推奨基準を当てはめると，今回の検討では新たにPositiveと判定された2例及び以前の基準でTriple negative乳癌と診断されていたEquivocal 3例が，抗HER2薬治療適応可能となる。今回の結果から，2013 ASCO/CAPガイドラインは，抗HER2薬対象患者の拡充へ寄与することが示唆された。
さらに我々は，再評価により判定結果が変化した症例について平均CEP17コピー数に着目して検討を行った。新たにPositive，Equivocalと判定された症例の平均CEP17コピー数は，Negative症例および以前のガイドラインに基づくPositive症例と比較してそれぞれ有意に高かった。これらの症例には17番染色体のpolysomyが結果判定の変化に影響を与える大きな要因であると思われる。乳癌における17番染色体のpolysomyは，13～46%と報告されており18)，今回再評価された症例の割合と類似していた。
しかし，17番染色体のpolysomy症例において，トラスツズマブの治療効果に対する統一した見解は現在得られていない19),20)。17番染色体のpolysomyは，HER2タンパクの過剰発現には関連しないとの報告もある21)。今回，再評価により判定されたEquivocal症例の87.5%（21/24）がHER2タンパク発現0もしくは1+であった。トラスツズマブなどの抗HER2治療薬は腫瘍細胞膜におけるHER2タンパクを標的としているため22)，HER2タンパク発現の低いEquivocal症例に対して治療効果があるかは疑問が残る。今回の結果から，2013 ASCO/CAPガイドライン改訂により，17番染色体のpolysomyによるEquivocal症例の増加が予想される。このようなHER2-FISH Equivocal症例に対する抗HER2治療効果の研究が今後の課題と思われる。
今回のガイドライン改訂により，HER2-FISH検査においてPositive，Equivocal症例が増加する結果となった。特にEquivocal症例の増加は顕著であった。また，以前の基準ではTriple negative乳癌と診断され，改訂基準ではPositive，Equivocalと判定された症例も認められた。今回の結果から，2013 ASCO/CAPガイドラインは，抗HER2薬対象患者の拡充へ寄与することが示唆された。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
