メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）感染症の治療においてlinezolid（LZD）は重要な抗MRSA薬の1つである。当院ではWalkAway 96 Plus（ベックマン・コールター）によるプロンプト法を用いた薬剤感受性測定を実施しているが，MRSAでLZDのMIC値がブレイクポイントの感性の上限である4 μg/mLを示す株が散見されるようになった。そこで，LZDのMIC値が4 μg/mLを示したMRSAを対象として分離率の年次推移を調査したところ，2010年の1.4%（8/568株）から2014年には24.4%（75/307株），以降10～15%程度で推移していた。また，他法との比較のため，対象株のうち103株を基準濁度法および寒天平板希釈法で再測定した結果，全ての株が ≤ 2 μg/mLであった。そのうち40株を，DPS192iX（栄研化学），BDフェニックスM50（日本BD），VITEK2（ビオメリュー・ジャパン）で再測定した結果，DPS192iX，BDフェニックスM50は40株全て，VITEK2は39株が ≤ 2 μg/mLであった。これらの結果から，プロンプト法による薬剤感受性測定では，MRSAに対するLZDのMIC値が他法・他機器より1管程度高値となることが明らかとなった。±1管差は許容範囲内とされるが，他の要因が加わることで2管差以上となり得るリスクがあり，臨床に与える影響も考慮する必要がある。また，自施設の薬剤感受性測定法・測定機器の特徴を把握するために検証を行うことは重要である。
At Teikyo University Hospital, antimicrobial susceptibility testing was conducted by the prompt inoculation method using the WalkAway 96 Plus system. In recent years, the frequency of the isolation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains with a minimum inhibitory concentration (MIC) of 4 μg/mL for linezolid (LZD) has seemed to be increasing. This MIC of LZD indicates the upper limit of sensitivity. Therefore, we investigated the transition in the isolation rate of MRSA strains that showed a MIC of 4 μg/mL for LZD. The isolation frequency of these strains increased from 1.4% (8/568 strains) in 2010 to 24.4% (75/307 strains) in 2014 and was later maintained at 10–15%. In addition, the MIC for 103 strains was reevaluated using both the turbidity inoculation method and the agar plate dilution method. The MIC for all the strains was 2 μg/mL or lower in both methods. We also reevaluated the MIC of LZD for 40 selected strains using three types of antimicrobial susceptibility testing equipment. The MIC for all the strains was 2 μg/mL or lower when remeasured using the DPS192iX and BD Phoenix M50 systems; however, that for 39 strains was 2 μg/mL or lower when remeasured using the VITEK2 system. These results indicate that the MIC of LZD for MRSA strains measured by the prompt inoculation method using the WalkAway 96 Plus system is approximately 1 doubling dilution higher than that of the other methods and equipment. In most cases, a difference of ±1 doubling dilution is considered acceptable. However, the difference would increase to over 2 doubling dilutions when other confounding factors are involved. In conclusion, it is important to perform various evaluations to understand the characteristics of various antimicrobial susceptibility testing methods and equipment.
本邦において2001年にvancomycin resistant enterococci（VRE）感染症治療薬として承認されたオキサゾリジノン系の抗菌薬であるlinezolid（LZD）は，2006年にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）感染症にも適応が認められた。LZDは，既存の抗MRSA薬に対し耐性である菌にも交差耐性を示さず，耐性獲得も稀とされているが1)，LZD耐性MRSAが海外のみならず本邦でも報告されている2),3)。また，アウトブレイク事例の報告4)もあることから注意が必要である。このような背景もあり，多くの学会からLZDの適正使用について注意喚起が出されており，注目されている薬剤の1つである。
当院ではLZD耐性MRSAは検出されていないが，2010年頃からLZDの最小発育阻止濃度（minimum inhibitory concentration; MIC）値がClinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）標準法5)におけるブレイクポイントの感性の上限である4 μg/mLを示すMRSAが散見され始めた。
そこで，当院で検出されたLZDのMIC値が4 μg/mLを示したMRSAの分離率の年次推移を調査した。また，LZDのMIC値を再評価するため，凍結保存菌株を用いて複数の薬剤感受性測定法や測定機器でMIC値を測定し結果を比較した。
2010年1月～2018年12月の期間に，当院で分離され，WalkAway 96 Plus（ベックマン・コールター；W/A）で薬剤感受性測定が行われたMRSA 3,377株を対象とした。また，各年毎のMRSA株数に占めるLZDのMIC値が4 μg/mLを示したMRSA株数および分離率を求めた。対象菌株の集計方法は，各年毎で1患者につき初回分離された株を1株とした。なお，薬剤感受性測定には，2010年はPos Combo 6.1J，2011年～2015年3月まではPos Combo 3.1J，2015年4月以降はPos MIC 3.3Jのマイクロスキャンパネルを使用した。
2． 薬剤感受性測定法の違いによるLZDのMIC値比較2010年1月～2018年6月の期間に当院で分離され，LZDのMIC値が4 μg/mLを示したMRSAのうち−80℃でスキムミルクに凍結保存されていた103株を対象とした。また，精度管理としてStaphylococcus aureus ATCC 29213株を用いた。方法は，対象菌株を5%ヒツジ血液寒天培地（ベクトン・ディッキンソン）に，35℃，24時間培養で3回継代培養した。プロンプト法との比較は，基準濁度法および寒天平板希釈法の2法によりLZDの薬剤感受性を再測定した。以下に各種薬剤感受性測定法の手順を示す。
1） プロンプト法および基準濁度法プロンプト法では，付属のワンズで1コロニー釣菌し，30 mLプロンプトボトルに挿入後，混和し調整菌液とした。基準濁度法では，生理食塩水を用いてMcFarland No. 0.5となるよう濁度計MicroScan Turbidity Meter（ベックマン・コールター）で調整後，その菌液100 μLを25 mLプロンプトボトルに添加し，調整菌液とした。以降の手順は，プロンプト法および基準濁度法ともに，調整菌液をイノキュレーターにてマイクロスキャンパネルに接種し，W/Aに装填，35℃，18時間培養後，薬剤感受性を自動判定した。
2） 寒天平板希釈法臨床微生物検査ハンドブック6)に準じ，LZD濃度0.12～8 μg/mLのLZD含有Mueller-Hinton（MH）寒天培地を作製した。菌液はMcFarland No. 0.5となるよう濁度計で調整後，各濃度のLZD含有MH寒天培地に接種し，35℃，20時間培養後に菌の発育を目視判定した。
3． 薬剤感受性測定法および薬剤感受性測定機器別のLZDのMIC値比較対象および方法2の薬剤感受性測定法の違いによるLZDのMIC値比較において，LZDのMIC値が1 μg/mLの9株，2 μg/mLの94株からランダムに選んだ31株，合計40株を対象とした。なお，精度管理にはS. aureus ATCC 29213株を用いた。方法は，対象菌株をTable 1に示したW/A以外の薬剤感受性測定機器によりLZDのMIC値を再測定した。
| Equipment | Company | MIC Panel (Period of use) | Range of MIC for LZD |
|---|---|---|---|
| WalkAway 96 Plus | Beckman Coulter | Pos Combo 6.1J (2010.1～12) | ≤ 2～> 4 |
| Pos Combo 3.1J (2011.1～2015.3) | ≤ 2～> 4 | ||
| Pos MIC 3.3J (2015.4～) | ≤ 0.5～> 4 | ||
| DPS192iX | Eiken chemical | Dry Plate ‘Eiken’ EP22 | ≤ 0.12～> 4 |
| BD Phoenix M50 | BD Japan | PMIC-85 | ≤ 0.5～> 8 |
| VITEK2 | Biomerieux Japan | AST-P625 | ≤ 0.5～> 8 |
対象および方法3の薬剤感受性測定法および薬剤感受性測定機器別にvancomycin（VCM），teicoplanin（TEIC），arbekacin（ABK）のMIC値を比較した。
当院で検出されたMRSA株数は，2010年から2011年にかけて約20%減少し，それ以降は2015年まで毎年約10%ずつ減少していた。その一方で，LZDのMIC値が4 μg/mLを示すMRSA株数は，2010年の8株から2014年には75株まで増加が認められた。その結果，MRSA株数に占めるLZDのMIC値が4 μg/mLを示すMRSAの分離率は，2010年の1.4%から2014年には最も高い24.4%にまで上昇し，2015年以降は9.9%～16.3%の範囲で推移していた（Figure 1）。
The period from 2010 to 2018 was shown. The isolation rate of MRSA strains that showed a MIC of 4 μg/mL for LZD increased from 1.4% in 2010 to 24.4% in 2014.
プロンプト法でLZDのMIC値が4 μg/mLを示したMRSA 103株について，基準濁度法，寒天平板希釈法で再測定を実施したところ，両法ともに全ての株でLZDのMIC値は ≤ 2 μg/mLとなった。また，基準濁度法では7株，寒天平板希釈法では基準濁度法とは異なる2株が1 μg/mLとなり，プロンプト法より2管低い結果であった（Table 2）。精度管理として用いたS. aureus ATCC 29213株については，プロンプト法が4 μg/mL，基準濁度法および寒天平板希釈法が2 μg/mLを示し，いずれも精度管理範囲内であった。
| Methods | MIC (μg/mL) | ||
|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 4 | |
| *W/A Prompt inoculation | 0 | 0 | 103 |
| *W/A Turbidity inoculation | 7 | 96 | 0 |
| Agar plate dilution | 2 | 101 | 0 |
*W/A: WalkAway 96 Plus
前述の薬剤感受性測定法の違いによるLZDのMIC値比較において，LZDのMIC値が1 μg/mLの9株，2 μg/mLの94株からランダムに選んだ31株，合計40株について，3種の薬剤感受性測定機器でLZDのMIC値を再測定した。その結果，VITEK2で1株が4 μg/mLを示したが，他の薬剤感受性測定機器では全て ≤ 2 μg/mLとなった（Table 3）。精度管理として用いたS. aureus ATCC 29213株のMIC値は，VITEK2が2 μg/mL，DPS192iXとBDフェニックスM50が1 μg/mLを示した。
| Equipment/Methods | MIC (μg/mL) | |||
|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 4 | ||
| *W/A | Prompt inoculation | 0 | 0 | 40 |
| Turbidity inoculation | 7 | 33 | 0 | |
| DPS192iX | 0 | 40 | 0 | |
| BD Phoenix M50 | 29 | 11 | 0 | |
| VITEK2 | 8 | 31 | 1 | |
| Agar plate dilution | 2 | 38 | 0 | |
*W/A: WalkAway 96 Plus
寒天平板希釈法を基準とし比較した結果をTable 4に示した。プロンプト法は同じMIC値であったのが0株，+1管差が38株，+2管差が2株であった。基準濁度法と3種の薬剤感受性測定機器は40株すべてが ±1管差レンジ内であった。そのうち，基準濁度法で31株，DPS192iXで38株，VITEK2で31株が同じMIC値であったのに対し，BDフェニックスM50は13株で，−1管差が27株であった。
| Equipment/Methods | Number of strains with different MIC from agar plate dilution | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| −2 | −1 | same | +1 | +2 | ||
| *W/A | Prompt inoculation | 0 | 0 | 0 | 38 | 2 |
| Turbidity inoculation | 0 | 7 | 31 | 2 | 0 | |
| DPS192iX | 0 | 0 | 38 | 2 | 0 | |
| BD Phoenix M50 | 0 | 27 | 13 | 0 | 0 | |
| VITEK2 | 0 | 7 | 31 | 2 | 0 | |
*W/A: WalkAway 96 Plus
LZD以外の抗MRSA薬のMIC値について薬剤感受性測定機器別の結果をTable 5に示した。
| Equipment/Methods | MIC (μg/mL) | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| VCM | TEIC | ABK | ||||||||||
| ≤ 0.5 | 1 | 2 | ≤ 2 | 4 | 8 | ≤ 1 | 2 | 4 | 8 | > 8 | ||
| *W/A | Prompt inoculation | 0 | 17 | 23 | 36 | 3 | 1 | 23 | 9 | 5 | 1 | 2 |
| Turbidity inoculation | 1 | 39 | 0 | 39 | 1 | 0 | 24 | 11 | 4 | 0 | 1 | |
| DPS192iX | 28 | 10 | 2 | 36 | 1 | 3 | 37 | 2 | 1 | 0 | 0 | |
| BD Phoenix M50 | 2 | 38 | 0 | 39 | 1 | 0 | 35 | 2 | 1 | 1 | 1 | |
| VITEK2 | 16 | 23 | 1 | 40 | 0 | 0 | 39 | 0 | 0 | 1 | 0 | |
*W/A: WalkAway 96 Plus
VCMは，プロンプト法ではMIC値が2 μg/mLを示した株は23株に対し，基準濁度法では39株が1 μg/mLであった。BDフェニックスM50も1 μg/mL を示した株が38株であったが，DPS192iXとVITEK2では ≤ 0.5 μg/mLを示す株がそれぞれ28株，16株認められた。
TEICは，4種類の測定機器でも多くの株が ≤ 2 μg/mLであったが，プロンプト法とDPS192iXでは4～8 μg/mLを示した株が4株認められた。特にDPS192iXでは，3株が8 μg/mLを示した。
ABKは，W/Aではプロンプト法，基準濁度法に関わらず，≥ 2 μg/mL を示す株が16～17株であったのに対し，他の測定機器では5株以下であり，多くの株が ≤ 1 μg/mLを示した。
MRSAにおいて，本邦でもLZD耐性株は少ないながらも報告されている2),3)。今回，当院で検出されたMRSAの中にLZD耐性株は存在しなかった。しかし，CLSIのブレイクポイントで感性の上限であるMIC値が4 μg/mLを示すMRSAの分離率は，2010年の1.4%から，2014年には24.4%にまで増加が認められた。その一方で，薬剤感受性測定法の違いによるLZDのMIC値比較において，プロンプト法で4 μg/mLを示した103株の基準濁度法による再測定の結果，全ての株が2 μg/mL以下であった。そして，この結果は，同時に実施した薬剤感受性測定の標準法といわれている寒天平板希釈法の再測定の結果と同等であった。このことから，プロンプト法で薬剤感受性測定を実施した場合，LZDのMIC値は他法より高値を示すことが示唆され，結果としてLZDのMIC値が4 μg/mLを示すMRSAの分離率の増加が認められたと考えられた。
プロンプト法によるLZDのMIC値が他法より高値であった要因として，本研究では検討していないが，菌液調整方法の違いによる影響が考えられる。
プロンプト法は簡便かつ必要となるコロニー量も少ないという点から，検査数が多い当院もこの方法で薬剤感受性測定を実施している。しかし，他法に比べ，MRSAにおいては特にVCMのMIC値が高くなりやすいとの報告が知られている7),8)。これらの報告によると，プロンプト法の菌液調整の場合，菌液濃度が高くなることがあり，その結果MIC値が高値を示す可能性があると述べられている。LZDにおいても同様の影響を受けたとも推測される。
また，LZDのMIC値が4 μg/mLを示すMRSAの分離率が2010年から2014年にかけて増加したことや，2015年に10.8%まで大幅に減少したことについては，使用するマイクロスキャンパネルの種類変更が関係していることが考えられる。仲田ら9)によると，薬剤は異なるものの，使用したマイクロスキャンパネルの種類により，S. aureusのVCMのMIC値に乖離が認められたという報告がある。当院の状況（Figure 1）においても，2011年1月，2015年4月にマイクロスキャンパネルの種類を変更しており，このことがLZDのMIC値に影響を与えた可能性もある。
さらに，各種薬剤感受性測定機器によるLZDのMIC値比較でも，プロンプト法では他機器に比べ高値を示すことがわかった。加えて，他機器でLZDのMIC値が2 μg/mLを示す株が多数であったのに対し，BDフェニックスM50は1 μg/mLを示した株が多く，他機器より低値を示す傾向にあった。これは，寒天平板希釈法を基準とし比較した場合も同様であり，薬剤感受性測定機器によっては，±1管差レンジ内で得られるMIC値に傾向があることがわかった。
薬剤感受性測定機器ごとに得られるMIC値は，LZD以外の抗MRSA薬のMIC値比較の結果からも傾向がみられた。すなわち，プロンプト法は，VCMのMIC値が2 μg/mLを示した株が半数以上認められ，LZD同様，他法・他機器に比べ高値を示した。その一方で，DPS192iXとVITEK2では，≤ 0.5 μg/mLを示した株が多数認められ，他機器より低値を示した。また，ABKでは他機器で多くの株が ≤ 1 μg/mLを示したが，プロンプト法だけでなく基準濁度法でも高値を示す株が多く認められた。したがって，薬剤感受性測定法の違いがMIC値に与える影響は，薬剤により異なることが示唆された。
今回行った検討から，MRSAに対するLZDのMIC値は，薬剤感受性測定法および薬剤感受性測定機器により，±1管差レンジ内でばらつきが認められた。特にプロンプト法は他法・他機器との比較において，MIC値は1管程度高値を示すことがわかった。薬剤感受性測定でのMIC値 ±1管差は許容範囲内とみなされ，大きな問題であると認識することは難しいかもしれない。しかし，MIC値が1管高値を示すことは，様々な要因により2管差以上となり得るリスクがあり，それにより臨床に与える影響も考慮する必要がある。本検討による複数の薬剤感受性測定機器でのMIC値比較により，この問題点がクローズアップされたと考えている。
今回，LZDのMIC値が4 μg/mLを示すMRSAについて，各種薬剤感受性測定法や測定機器ごとの薬剤感受性測定を実施する機会を得た。その結果，プロンプト法で測定したMIC値は他法・他機器より1管程度高値であることが明らかとなった。当院におけるLZDのMIC値が4 μg/mLを示すMRSAの増加は，このプロンプト法の特性やマイクロスキャンパネルの種類変更により，見かけ上の増加であったことが考えられた。薬剤感受性測定に際して，真の臨床データを得るためには，外部精度管理にも重点をおき，測定法および測定機器の特徴を理解した上で実施することが望ましい。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
