技術論文
第2次国際標準品を標準物質とした試薬「ルミパルスプレストHBsAb-III」の性能評価
2021 年 70 巻 4 号 p. 691-696
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2021 年 70 巻 4 号 p. 691-696
HBs抗体はB型肝炎ウイルスhepatitis B virus（HBV）のHBs抗原に対する抗体であり，HBVの感染既往やHBワクチン接種後における抗体獲得の有無を鑑別するための指標として用いられている。今回我々は世界保健機構（World Health Organization; WHO）の第2次国際標準品（NIBSCcode: 07/164）を標準物質として値付けした試薬ルミパルスプレストHBsAb-IIIの性能評価を行った。併行精度の変動係数（CV）は1.6～3.0%（平均値：22.9，5.6，205.8 mIU/mL），日差再現性のCVは1.7～3.8%（平均値：20.7，5.8，205.6 mIU/mL）であり，希釈直線性は1,000.0 mIU/mLまで原点を通る直線性を認めた。また，定量限界は0.9 mIU/mLであり高感度かつ精度も良好であった。第1次国際標準品を標準物質として値付けした試薬ルミパルスプレストHBsAb-Nとの相関は，相関係数がr = 0.997，線形関係式がy = 1.07x − 9.24であった。カットオフ値である10.0 mIU/mLに対する判定は100%一致した。以上の結果より，本試薬は有用性が高く，日常検査に貢献できる試薬と考えられる。
The hepatitis B virus (HBV) surface antibody (HBsAb) is used for the diagnosis of HBV infections and is a marker that appears after vaccination. We evaluated the second-international-standard-based reagent kit for anti-hepatitis B surface antigen (anti-HBs) immunoglobulin (NIBSCcode: 07/164), Lumipulse Presto HBsAb-III (Lumipulse 2nd reagent) and compared it with Lumipulse Presto HBsAb-N (Lumipulse 1st reagent). Within-run and between-run reproducibility precisions were 1.6–3.0% and 1.7–3.8%, respectively. The obtained diluted linearity and lower limit of detection were 1,000.0 and 0.9 mIU/mL, respectively. The correlation coefficient (r) between Lumipulse 2nd reagent and Lumipulse 1st reagent was 0.997. The cutoff value (10.0 mIU/mL) for the concordance rate of the Lumipulse 2nd and 1st reagents was 100%. The basal performance of the Lumipulse 2nd reagent was satisfactory, and it could be used for measurement with high sensitivity.
HBs抗体はB型肝炎ウイルス（hepatitis B virus; HBV）の外殻蛋白であるHBs抗原に対する抗体であり，急性B型肝炎発症後4～6ヵ月を経過して血中に出現する。また，HBVの中和抗体として感染制御に働き，HBVの感染既往やHBワクチン接種後における抗体獲得の有無を鑑別するための指標として用いられている1)。
HBs抗体の測定には，化学発光酵素免疫測定法（chemiluminescence enzyme immunoassay; CLEIA），化学発光免疫測定法（chemiluminescence immunoassay; CLIA），電気化学発光免疫測定法などの測定原理が用いられており2)～4)，各測定法のキャリブレータは世界保健機構（World Health Organization; WHO）の国際標準品（NIBSCcode: 07/164）を用いて値付けすることで，測定値の標準化を行っている。当院では，第1次国際標準品を標準物質として値付けされているルミパルスプレストHBsAb-N（以下ルミパルス1st試薬）を使用していたが，第1次国際標準品の在庫数の枯渇に伴い，第2次国際標準品を標準物質とするルミパルスプレストHBsAb-III（以下ルミパルス2nd試薬）に移行することとなった。今回，このルミパルス2nd試薬への変更を行うにあたり，試薬の性能評価を行ったので報告する。
対象は2020年4月に，当院中央検査部にHBs抗体測定の依頼があった外来および入院患者の血清（54例）を用いた。検体は，採血後に1,880 g，5分間遠心し，血清分離を行った。なお，本研究は川崎医科大学・同附属病院倫理委員会の承認（受付番号：3932）を得て行った。
2． 試薬および機器検討試薬にはルミパルス2nd試薬を，また対照試薬にはルミパルス1st試薬を用いて，全自動化学発光酵素免疫測定システムルミパルスプレストIIで測定した。希釈液はルミパルスプレスト検体希釈液を用いた（試薬，機器ともに富士レビオ）。定性試験はクイックチェイサーHBsAb（ミズホメディー）を用いた。陽性コントロールはACCURUN125anti-HBs陽性コントロール（日立化成ダイアグノスティックス・システムズ）を用いた。
3． 測定原理ルミパルス2nd試薬の測定原理は，1ステップサンドイッチ法に基づいたCLEIAである。検体中のHBs抗体は試薬中のアルカリフォスファターゼ標識HBs抗原（酵素標識抗原）およびHBs抗原結合粒子による免疫複合体を形成する。抗原結合粒子の洗浄後に基質液（AMPPD）を加え，発光量を測定し，2濃度のキャリブレータを用いて作成した検量線より検体中のHBs抗体濃度を求める。
4． カットオフ値カットオフ値はメーカー推奨値10.0 mIU/mL（HBV感染防御の最小HBs抗体濃度を基準に設定）とした。10.0 mIU/mL未満を陰性，10.0 mIU/mL以上を陽性とした。
ACCURUN125anti-HBs陽性コントロールと2種類のプール血清をそれぞれ10回連続測定して併行精度を求めた。さらにカットオフ値である10.0 mIU/mL付近の抗体濃度の患者検体2種類を5回連続測定した。
2． 日差再現性日差再現性は初日にキャリブレーションを実施後，試薬を分析装置に設置した状態でACCURUN125anti-HBs陽性コントロールと2種類のプール血清を1日1回，11日間測定した。
3． 希釈直線性HBs抗体高濃度プール血清（1,449.4 mIU/mL）をルミパルスプレスト検体希釈液で10段階希釈し，各試料を1回測定した。
4． 自動希釈機能の評価10例のHBs抗体高濃度検体（506.0～5,094.0 mIU/mL）を対象に，ルミパルスプレスト検体希釈液を用いて用手法にて希釈した検体と，分析装置にて自動希釈した検体を測定し，それぞれのHBs抗体濃度を比較した。希釈倍数は，いずれも10倍とした。
5． 定量限界HBs抗体低濃度の血清7検体（1.1～4.7 mIU/mL）を2重測定し，測定平均値（mIU/mL）および変動係数（CV）を算出後，その平均値（mIU/mL）を横軸に，CV（%）を縦軸にプロットしてprecision profileを作成した。CV 10%の抗体濃度を定量限界とした。
6． 相関血清54例を対象に，ルミパルス1st試薬とルミパルス2nd試薬との相関性を検討した。
7． 判定の一致率カットオフ値10.0 mIU/mLに対するルミパルス1st試薬とルミパルス2nd試薬の判定一致率を検討した。また，9例の検体を用いてルミパルス2nd試薬とクイックチェイサーHBsAbの判定一致率についても検討を行った。
陽性コントロールおよび2種類のプール血清の併行精度のCVは，1.6～3.0%（平均値：22.9，5.6，205.8 mIU/mL）であった（Table 1A）。また，10.0 mIU/mL付近の抗体濃度の患者検体2種類のCVは2.8，2.7%（平均値：9.3，11.5 mIU/mL）であり，5回測定において判定が異なることはなかった（Table 2）。
| A. Withih-run reproducibility | B. Between-run reproducibility | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Control | Pool serum | Control | Pool serum | ||||
| Low | High | Low | High | ||||
| Mean (mIU/mL) | 22.9 | 5.6 | 205.8 | Mean (mIU/mL) | 20.7 | 5.8 | 205.6 |
| SD (mIU/mL) | 0.7 | 0.1 | 3.3 | SD (mIU/mL) | 0.8 | 0.1 | 5.6 |
| CV (%) | 3.0 | 1.6 | 1.6 | CV (%) | 3.8 | 1.7 | 2.7 |
| Max (mIU/mL) | 23.8 | 5.8 | 210.6 | Max (mIU/mL) | 21.9 | 5.9 | 213.9 |
| Min (mIU/mL) | 21.8 | 5.5 | 198.2 | Min (mIU/mL) | 19.4 | 5.6 | 194.8 |
A: Withih-run reproducibility
B: Between-run reproducibility
| Sample 1 | Sample 2 | |||
|---|---|---|---|---|
| HBsAb titer (mIU/mL) | Judgement | HBsAb titer (mIU/mL) | Judgement | |
| 1 | 9.0 | − | 11.2 | + |
| 2 | 9.2 | − | 11.8 | + |
| 3 | 9.1 | − | 11.7 | + |
| 4 | 9.6 | − | 11.1 | + |
| 5 | 9.5 | − | 11.6 | + |
| Mean (mIU/mL) | 9.3 | 11.5 | ||
| SD (mIU/mL) | 0.3 | 0.3 | ||
| CV (%) | 2.8 | 2.7 | ||
日差再現性のCVは1.7～3.8%（平均値：20.7，5.8，205.6 mIU/mL）であった（Table 1B）。
2． 希釈直線性・自動希釈機能の評価HBs抗体高濃度検体を用いた希釈試験では，1,000.0 mIU/mLまで原点を通る直線性を認め，より抗体高濃度の試料では測定範囲上限である1,000.0 mIU/mL以上と表示された（Figure 1）。また，用手法と自動希釈の測定値に有意な差は認められなかった（Figure 2）。
The upper limit of the measured value was 1,000.0 mIU/mL for Lumipulse Presto HBsAb.
There was a no difference in HBsAb titer between automated and manual dilutions.
HBs抗体低濃度検体を2重測定して求めた定量限界値は，0.9 mIU/mLであった（相対標準偏差CV = 10%）（Figure 3）。
The limits quantification of Lumipulse Presto HBsAb was 0.9 mIU/mL.
ルミパルス1st試薬とルミパルス2nd試薬との相関は，相関係数がr = 0.997，線形関係式がy = 1.07x − 9.24であった（Figure 4A）。また，Bland-Altman解析を行った結果，平均差は−4.0 mIU/mL，誤差の許容範囲は−52.1～44.2 mIU/mLであった。500.0 mIU/mL以上ではルミパルス2nd試薬はルミパルス1st試薬に比べ高値傾向を示した（Figure 4B）。
A: Liner regression analysis Lumipulse 2nd reagent (y) and Lumipulse 1st reagent (x).
B: Bland-Altman plot showing to be a difference between the HBsAb titer of Lumipulse 2nd reagent and Lumipulse 1st reagent.
カットオフ値10.0 mIU/mLに対するルミパルス1st試薬とルミパルス2nd試薬の判定の一致率は100%であった（Table 3）。また，ルミパルス2nd試薬とクイックチェイサーHBsAbの判定も100%一致した（Table 4）。
| Lumipulse 1st reagent (mIU/mL) |
Total | |||
|---|---|---|---|---|
| < 10 | ≥ 10 | |||
| Lumipulse 2nd reagent (mIU/mL) |
< 10 | 11 | 0 | 11 |
| ≥ 10 | 0 | 43 | 43 | |
| Total | 11 | 43 | 54 | |
Concordance rate: 100% (54/54)
| Lumipulse 2nd reagent | Quick chaser HBsAb | ||
|---|---|---|---|
| HBsAb titer (mIU/mL) | Judgement | ||
| No. 1 | 102.0 | + | + |
| No. 2 | 3.7 | − | − |
| No. 3 | 11.6 | + | + |
| No. 4 | 13.1 | + | + |
| No. 5 | 3.1 | − | − |
| No. 6 | 27.9 | + | + |
| No. 7 | 243.0 | + | + |
| No. 8 | 79.1 | + | + |
| No. 9 | 37.1 | + | + |
Concordance rate: 100% (9/9)
今回，第2次国際標準品を標準物質とするルミパルスプレストHBsAb-IIIの性能評価を行った。
カットオフ付近の濃度の検体も含めて併行精度では，CV 3.0%以下であり，従来試薬と同等な結果であった5)。また，11日間の日差再現性のCVは3.8%以内であり，トレンド・シフトも認めなかったことより，精度および安定性の高い試薬と考える。また，定量限界は0.9 mIU/mLであり，カットオフ値である10.0 mIU/mLに対する判定を正確に行うことができると考える。
希釈直線性に関しては測定範囲上限である1,000.0 mIU/mLまで原点を通る直線性を認めた。ルミパルス1st試薬は検体中のHBs抗体濃度が1,000.0 mIU/mLを超えた場合の希釈再検は不可能であったが，ルミパルス2nd試薬は希釈再検が可能となった。今回，HBs抗体高濃度検体を対象にルミパルスプレスト検体希釈液を用いた用手法（×10），自動希釈（×10）によるHBs抗体濃度の比較を行ったところ，用手法と自動希釈の測定値に有意な差は認めず，定量法として問題なく使用できることが確認できた。さらに，ルミパルス2nd試薬の測定上限値である1,000.0 mIU/mLを超える検体においても装置の自動希釈機能を用いることにより，正確かつ迅速な結果報告が可能となった。
HBs抗体の測定試薬は各体外診断薬医薬品メーカー（以下診断薬メーカー）から様々なキットが発売されており，測定値の乖離が問題となっている2)～4)。百瀬ら6)は，第2次国際標準品を診断薬メーカー9社，13種類のキットにより測定し，第2次国際標準品の期待値と各試薬測定値の比（［測定値/期待値（%）］）を算出したところ，72.3～151.7%とキット間で測定値に乖離があることを確認したと報告している。また，我々も以前，ルミパルス1st試薬と第1次国際標準品を基準としたアーキテクト オーサブ（アボットジャパン）の相関がr = 0.844，y = 1.19x + 23.6であり，両試薬の判定不一致率が10%であったことを報告した5)。今回の検討で，ルミパルス1st試薬とルミパルス2nd試薬はr = 0.997，傾き1.07と良好な相関性を示し，両試薬の判定一致率も100%であった。しかし，Bland-Altman解析において500.0 mIU/mL以上ではルミパルス2nd試薬はルミパルス1st試薬に比べ高値傾向を示した。我々は，ルミパルス1st試薬を用いてWHO標準品（2nd）を測定したところ，表示値500.0 mIU/mLに対して測定値432.3 mIU/mL（対表示値86.5%）と報告しており5)，詳細な要因は不明だが，キャリブレーターの値付けが起因していると推測した。また，当院では休日，夜間勤務時間帯に針刺し事故が発生した際，HBs抗体の測定をクイックチェイサーHBsAbにて行っているが，ルミパルス2nd試薬とクイックチェイサーHBsAbの判定一致率が100%であることが確認されたことから，休日，夜間に使用している試薬とルーチン使用の試薬の判定を同一視できると考える。
2016年より日本においてもB型肝炎ワクチンの定期接種が実施されている。日本国内の多くの施設で使用されているビームゲンの遺伝子型はC由来（血清型adr）であり7)，国内に多い遺伝子型CのHBVによる感染を予防している。このような背景から，ルミパルス1st試薬とルミパルス2nd試薬の試薬中には血清型adrの抗原を使用し，検出感度を高めている8)。今回，HBワクチンのビームゲン接種後の患者検体1例をルミパルス2nd試薬にて測定し，ワクチン接種によるHBs抗体獲得の有無を確認した。その結果，接種後約4ヵ月後のHBs抗体濃度が493.3 mIU/mLと抗体濃度が上昇しており，ルミパルス2nd試薬がビームゲン接種によって産生されたHBs抗体をとらえることが確認できた。
近年のグローバル化に伴い，国内においても遺伝子型A（血清型adw）のHBVが増加している9)。小方ら10)は，ルミパルス1st試薬を用いて，遺伝子型A由来のHBワクチンであるペプタバックスII（血清型adw）接種者のHBs抗体を検出できたと報告している。ルミパルス1st試薬とルミパルス2nd試薬は同一の抗原を用いていることから，ルミパルス2nd試薬も遺伝子型AのHBV感染により獲得したHBs抗体の評価が可能であると推測する。今後，本試薬については，多検体を対象にワクチン接種後の抗体獲得評価の有用性を確認するとともに，遺伝子型AのHBV感染により獲得されたHBs抗体検出の是非についても検討を行う予定である。
第2次国際標準品を標準物質とするルミパルスプレストHBsAb-III試薬は，従来試薬と同様の基本性能を持つことが確認できた。さらに，高抗体濃度検体に対して希釈再検が可能で，従来試薬より有用性が高い。HBs抗体は，B型肝炎治療ガイドラインにおいてHBVの再活性化評価のためのスクリーニング検査の1つとして記載されており11)，本試薬はHBVの再活性化の評価に貢献できる試薬であると考える。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
