原著
当院におけるMRSAのPVL及びTSST-1遺伝子保有率の経年的変化とPOT値との関係
キーワード:
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）,
白血球特異的溶解毒素（PVL）,
毒素性ショック症候群毒素（TSST-1）,
PCR-based open reading frame typing（POT）
2021 年 70 巻 4 号 p. 631-638
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2021 年 70 巻 4 号 p. 631-638
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA）のクローンやPanton-Valentine leukocidin（PVL）産生株の動向を把握するため，2001，2009，2017年に当院で分離されたMRSAのPVL遺伝子（gene encoding Panton-Valentine leukocidin; lukF-PV）・毒素性ショック症候群毒素遺伝子（toxic shock syndrome toxin-1gene; tst）保有率，PCR-based open reading frame typing（POT）値及び薬剤感受性を調査した。各年においてlukF-PV保有株は0%，5.2%（3/58株），16.9%（12/71株）と増加し，tst保有株は70.3%（52/74株），36.2%（21/58株），16.9%（12/71株）と減少した。luk-F-PV保有15株中12株，106-77-113の全9株がUSA300と推定された。tst保有株の主なPOT1値は93から106に変遷した。各毒素遺伝子保有群は非保有群に比べ有意にクリンダマイシン，ミノサイクリンに感受性であった。クローンシフトに伴うと推定される毒素遺伝子保有率の変化が確認できた。POT法はUSA300の簡易な推定に有用である。
To clarify the clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the trends of Panton-Valentine leukocidin (PVL)-producing strains, we investigated the chronological changes in the percentages of strains carrying a gene encoding PVL (lukF-PV) and the toxic shock syndrome toxin-1 gene (tst), the PCR-based open reading frame typing (POT) score of these toxin-producing strains, and the antimicrobial susceptibility of MRSA isolated at our hospital. In 2001, 2009, and 2017, the percentages of strains carrying lukF-PV were 0%, 5.2% (3/58 strains), and 16.9% (12/71 strains), and the percentages of strains carrying tst were 70.3% (52/74 strains), 36.2% (21/58 strains), and 16.9% (12/71 strains), respectively. The percentage of strains carrying lukF-PV increased, whereas that of strains carrying tst decreased. Twelve of 15 strains carrying lukF-PV and all strains with a POT score of 106-77-119 were considered to be USA300. The dominant POT1 score of strains carrying tst changed from 93 (94.2%, 49/52 strains) to 106 (75.0%, 9/12 strains) between 2001 and 2017. For both toxin genes, the susceptibility rates to clindamycin and minocycline were significantly higher in the group of strains carrying the genes than in the group not carrying them. Changes in the percentages of MRSA strains carrying genes encoding toxins, which were considered to be associated with a clonal shift, were confirmed. The POT method may be useful for the simple prediction of USA300.
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA）は1980年代より医療施設関連型MRSA（healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus; HA-MRSA）として注目されてきた1)。1990年代半ば以降になると海外，とくに米国ではUSA300をはじめとする市中感染型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus; CA-MRSA）の報告が相次ぐようになる1)。CA-MRSAの多くは白血球特異的溶解毒素（Panton-Valentine leukocidin; PVL）を産生し，若年者や小児の感染症，主に皮膚・軟部組織感染症（skin and soft tissue infection; SSTI）に関連すると考えられている1)。
近年国内においてMRSA流行株のクローンシフトが報告され2)，CA-MRSAが主流となるなかで，従来日本では稀とされていたUSA300を中心とするPVL産生株も増加傾向にあるとされる3)。
HA-MRSAとCA-MRSAは，細菌学的にはStaphylococcal cassette chromosome mec（SCCmec）の遺伝子型によって，主にI，II，III型がHA-MRSA，IV，V型がCA-MRSAと定義されることが多い4)。またMRSAのクローンは黄色ブドウ球菌としてのゲノムの系統を示すST型とmecA遺伝子を運び込んだSCCmec型の組み合わせで決定される5)。
MRSAのクローンシフトに伴って保有する病原因子や病態が変化する可能性が考えられるため，これらを早期に把握する手段が今後重要となる。しかしながらST型を決定するmultilocus sequence typing（MLST）などの分子疫学的解析を一般的な検査室で行うことは困難である5)。それに対し，近年主に院内感染対策を目的として検査室で用いられるようになったPCR-based open reading frame typing（POT）法は2組のmultiplex PCRによって得た増幅産物のパターンを数値化して菌株を比較するタイピング法であるが5)，簡易的なクローンの推定も可能となっている6)～8)。また，特に最近増加傾向にあるPVL産生株については，その疫学や臨床像との関連など不明な点が多い。そこで今回，我々は当院で分離されたMRSA株を対象に，主な病原因子であるPVL遺伝子（gene encoding Panton-Valentine leukocidin; lukF-PV）及び毒素性ショック症候群毒素（toxic shock syndrome toxin-1; TSST-1）遺伝子（toxic shock syndrome toxin-1 gene; tst）保有率の経年変化とPOT値との関連，さらに日常検査法としてのPOT法の有用性について調査，検討したので報告する。
当院外来及び入院患者の皮膚軟部組織検体より検出され−80℃で保存されていたMRSA初回分離株（2001年74株，2009年58株，2017年71株の計203株）を毒素遺伝子，POT型，USA300推定の解析対象とした。また，このうち2017年の71株を薬剤感受性検査に用いた。なお，入院48時間以降に採取された株は入院株，当院入院歴のない患者からの株及び入院48時間以内に採取された株は外来株とした。本検討で得られた情報はそれ以外の目的に使用しない，また患者個人情報と連結しないように付番，匿名化された状態で解析を実施することなどに配慮した。
2． DNA抽出血液寒天培地に一晩純培養した集落よりシカジーニアス®DNA抽出試薬（関東化学）を用いて，添付文書に従って抽出を行い，毒素遺伝子及びアルギニン代謝系可動性遺伝子構造（arginine catabolic mobile element; ACME）遺伝子（arcA）の検出とPOT型の解析に使用した。
3． 毒素遺伝子及びACME遺伝子の検出Multipex PCRでlukF-PV及びtstの検出を行った。さらにlukF-PV保有株に対してはarcAの保有をPCRで確認した。既報に従ったプライマーとMultiplex PCR Assay Kit（TAKARA）を使用した9)～11)。
4． POT型の解析毒素遺伝子保有株に関してはPOT型の解析を行った。シカジーニアス®分子疫学解析POTキット（黄色ブドウ球菌用）（関東化学）を用いて，添付文書に従ってPOT型を算出した。
5． USA300推定株の基準USA300はST8-SCCmecIV型，PVL産生，ACME保有を特徴とする1)。本検討では lukF-PVおよびarcAを保有し，POT1値がSCCmecIV型，clonal complex（CC）8を反映する106を示した株をUSA300と推定（以下，推定USA300株）した。
6． 薬剤感受性2017年の株について，エリスロマイシン（EM），クリンダマイシン（CLDM），ミノサイクリン（MINO），ゲンタマイシン（GM），シプロフロキサシン（CPFX），スルファメトキサゾール・トリメトプリム（ST），計6薬剤の感受性検査を実施した。ドライプレート“栄研”（栄研化学）を使用した微量液体希釈法で測定し，判定基準にはclinical and laboratory standards institute（CLSI）のブレイクポイント（M100-S31）を用いた12)。CLDMに関しては微量液体希釈法で誘導耐性を確認し13)，誘導が認められた場合は耐性とした。統計解析ソフトにはEZR（埼玉医療センター，自治医科大学）を使用し，Fisher’s extract testで有意差を求めた。P < 0.05を有意差ありとした。
lukF-PV保有株は2001年には検出されなかったが，2009年に5.2%（3/58株），2017年には16.9%（12/71株）検出され，増加していた。これに対しtst保有株は2001年に70.3%（52/74株）であったが，2009年は36.2%（21/58株），2017年は16.9%（12/71株）と経年的な減少を認めた。
特に外来株でlukF-PV保有株増加，tst保有株減少の傾向は顕著であり，2001年から2017年にかけてlukF-PV保有株は0%から7.1%（2/28株），17.5%（11/63株）と増加し，tst保有株は58.6%（17/29株）から35.7%（10/28株），12.7%（8/63株）と減少していた（Figure 1）。
The percentages of MRSA strains carrying gene encoding toxin isolated from inpatients and outpatients in 2001, 2009, and 2017 are shown. The rate of strains carrying lukF-PV increased, whereas that of strains carrying tst decreased.
lukF-PV保有株の80%（12/15株）がPOT1：106を示した（Table 1）。それらはすべてACME保有株であり，USA300と推定された。lukF-PV保有株に最も多く認められたPOT型は106-77-113であり，60%を占めた。さらに推定USA300株の75%である9株が106-77-113を示した。なお104-25-49はlukF-PV及びtstを保有していた（Table 2）。また106-125-121，106-127-113を除いて全てが外来株であった。
| POT score | No. of strains in the following years | Total (%) (n = 15) |
arcA | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 2001 (n = 0) |
2009 (n = 3) |
2017 (n = 12) |
|||
| 106-77-113 | 2 | 7 | 9（60） | + | |
| 106-125-121 | 1 | 1（6.7） | + | ||
| 106-127-113 | 1 | 1（6.7） | + | ||
| 106-93-113 | 1 | 1（6.7） | + | ||
| 110-4-37 | 1 | 1（6.7） | − | ||
| 108-94-101 | 1 | 1（6.7） | − | ||
| 104-25-49 | 1 | 1（6.7） | − | ||
| No. | tst | lukF-PV | arcA | POT score | EM | CLDM | MINO | GM | CPFX | ST |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | + | − | NT | 106-9-80 | R | R | S | R | S | S |
| 2 | + | − | NT | 106-9-80 | S | S | S | R | S | S |
| 3 | + | − | NT | 106-9-80 | S | S | S | R | S | S |
| 4 | + | − | NT | 106-9-2 | S | S | S | R | S | S |
| 5 | + | − | NT | 106-9-2 | R | R | S | S | S | S |
| 6 | + | − | NT | 106-11-120 | S | S | S | R | S | S |
| 7 | + | − | NT | 106-11-120 | S | S | S | R | S | S |
| 8 | + | − | NT | 106-57-122 | S | S | S | S | S | S |
| 9 | + | − | NT | 106-25-6 | I | S | S | R | S | S |
| 10 | + | − | NT | 93-190-113 | R | R | S | S | R | S |
| 11 | + | − | NT | 64-1-81 | S | S | S | R | R | R |
| 12 | + | + | − | 104-25-49 | R | R | S | I | R | S |
| 13 | − | + | − | 110-4-37 | S | S | S | S | S | S |
| 14 | − | + | − | 108-94-101 | S | S | S | S | S | R |
| 15 | − | + | + | 106-77-113 | R | S | S | S | R | S |
| 16 | − | + | + | 106-77-113 | R | S | S | S | R | S |
| 17 | − | + | + | 106-77-113 | R | S | S | S | R | S |
| 18 | − | + | + | 106-77-113 | R | R | S | S | R | S |
| 19 | − | + | + | 106-77-113 | R | S | S | S | R | S |
| 20 | − | + | + | 106-77-113 | R | S | S | S | R | S |
| 21 | − | + | + | 106-77-113 | R | S | S | S | R | S |
| 22 | − | + | + | 106-127-113 | R | S | S | S | R | S |
| 23 | − | + | + | 106-93-113 | R | S | S | S | R | S |
NT, not tested; S, susceptible; I, intermediate; R, resistant; EM, erythromycin; CLDM, clindamycin; MINO, minocycline; GM, gentamycin; CPFX, ciprofloxacin; ST, trimethoprim-sulfamethoxazole.
tst保有株のPOT値は多様であった。各年に共通して検出されたのは106-9-80のみであり，2001年は1.9%（1/52株），2009年は23.8%（5/21株），2017年は25%（3/12株）検出され，2009年以降でもっとも多いPOT値であった。
POT1の値で集計すると，2001年から2017年にかけてPOT1：93の株は94.2%（49/52株），71.4%（15/21株），8.3%（1/12株）と減少し，POT1：106の株は3.8%（2/52株），28.6%（6/21株），75.0%（9/12株）と増加していた（Figure 2）。これら以外のPOT1値としては，2001年に85，2017年に64及び104を示す株が各々1株ずつ認められた。
The dominant POT1 score of strains carrying tst changed from 93 (94.2%, 49/52 strains) to 106 (75.0%, 9/12 strains) between 2001 and 2017.
lukF-PV保有群ではCLDM，MINO，GMが，tst保有群ではEM，CLDM，MINO，CPFX が陰性群と比較して有意に感性であった（Table 3）。
| Antimicrobial agent | lukF-PV | p-value | tst | p-value | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| − (n = 59) |
+ (n = 12) |
− (n = 59) |
+ (n = 12) |
|||
| EM | 20.3 | 16.7 | 1 | 11.9 | 58.3 | 0.001 |
| CLDM | 22.0 | 83.3 | < 0.001 | 25.4 | 66.7 | 0.014 |
| MINO | 64.4 | 100.0 | 0.014 | 64.4 | 100.0 | 0.014 |
| GM | 33.9 | 91.7 | < 0.001 | 47.5 | 25.0 | 0.208 |
| CPFX | 27.1 | 16.7 | 0.718 | 15.3 | 75.0 | < 0.001 |
| ST | 98.3 | 91.7 | 0.311 | 98.3 | 91.7 | 0.311 |
The numbers in the table are the percentages of susceptibility to antimicrobial agents.
EM, erythromycin; CLDM, clindamycin; MINO, minocycline; GM, gentamycin; CPFX, ciprofloxacin; ST, trimethoprim-sulfamethoxazole.
推定USA300株は全てがEM，CPFX に耐性，MINO，GM，STに感受性であり，1株のみがCLDMに耐性を示した（Table 2）。
2001年から2017年の16年間において，tst保有株の減少とlukF-PV保有株の増加が確認できた。
まずPVL産生株については，国内の検出率は年代や母集団によって異なるが，2010年以降のSSTIを対象とした調査では0～13.2%であり14),15)，年々増加傾向にあるとされ3),14)，本検討におけるlukF-PV保有率も概ね一致する結果となった。近年PVL産生株に関しては様々なクローンの報告が寄せられており3)，当院でも2017年にはPOT1が104，106，108，110のlukF-PV保有株が検出された。このうち104，108の株は輸入感染が疑われる症例であったが，グローバル化が進んでいる現代においては海外由来クローンも含めて，多様なクローンがPVLを産生しているものと考えられる。
今回の検討ではlukF-PV保有株の80%（12/15株）がUSA300と推定された。USA300は2007年に初めて国内で確認されて以来16)，散発的な報告はあるものの日本では稀であると考えられてきた17)。しかし近年増加しており，2015年にはPVL産生株の88.2%がUSA300であったとの報告もある3)。今回の結果からもUSA300は現在では国内で優勢なクローンの一つとなりつつあることが推察される。USA300のゲノムに見られる特徴的な遺伝子構造であるACMEはアルギニン代謝系酵素（アルギニンデイミナーゼ）をコードするarc遺伝子群（arginin deiminase gene cluster）とクオラムセンシングに関与するopp3遺伝子群（oligopeptide permease operon gene cluster）を持つ4)。L-アルギニンの代謝により生成されたアンモニアによって弱酸性条件下の健康な皮膚での定着能が高められ，さらにL-アルギニンの減少は免疫反応に関与する一酸化窒素の生成阻害に繋がることで，膿瘍内や食細胞内での生存に寄与すると考えられている4)。現時点で詳細は不明であるが，これらの因子が国内での本クローンの伝播にも関与している可能性が推測される。
このようにUSA300の検索には種々の遺伝子解析が必要であるが，日常検査としての実施は困難である。一方，POT法に関しては，USA300の可能性も含むPVL産生株の多くが「106-77-113」を示すことが報告されている18)。本検討で認められた106-77-113株は全てUSA300と推定され，また推定USA300株の75%が106-77-113を示し，高い相関が認められた。
これらはすべて外来株であり，患者背景からも同一株が院内で伝播した可能性は低いと推定される。
さらに追加で検証したところ当院で2014年以降に検出された106-77-113は全てlukF-PV保有株であり，その91%（21/23株）がarcAも保有していた（データ非公表）。
なおPVL産生株にはPOT1が64，110の株も多いとされているが5)，今回は64の株は認められなかった。
POT法は菌株識別に有用なプロファージ内のopen reading frame（ORF）に加えて，各クローンに特徴的な保有パターンを示すgenomic island領域のORFやSCCmec関連遺伝子をPCRの標的としたことで簡易的なクローンの推定を可能としているが5)，検出部位がファージという脱落や獲得が起こる可動性領域であることから，USA300と106-77-113は必ずしも一致しないと考えられる。しかし既報でもPOT法のCC及びSCCmec型の推定能は認められており6)～8)，本検討でも一定の相関性が認められたことから，POT法はPVL産生株及びUSA300の簡易な推定方法として有用であると考えられた。近年，POT法はMRSAの感染制御のツールとして多くの施設で活用されているが，今回得られた知見より，病原因子のリスク情報を加味することで，今後より効果的な感染制御が実施できる可能性が示唆された。
次にtst保有株については2001年にはNewYork/Japanクローンと推定されるPOT1：93が94.2%を占めていたが5)，本クローンの減少に伴いtst保有株も減少したと考えられる。POT1：93の株に代わって2017年にはtst保有株の91.7%（11/12株）がSCCmecIVもしくはV型と推定されるPOT1値を示した5)。
近年HA-MRSAのSCCmec上にのみ存在するphenol-soluble moduline-mec（psm-mec）という遺伝子が発見された19)。psm-mecの働きによって黄色ブドウ球菌が本来もつ移動能力や毒素産生能は抑制され，その代わりにバイオフィルム形成能が上昇したものがHA-MRSAと考えられる19)。そして近年増加しているCA-MRSAはpsm-mecを保持しないため，従来のNewYork/Japanクローンと比べ毒素の産生が亢進し，病原性が高くなっていると推測され，同じTSST-1産生株でも2001年の株とは性質が異なる可能性があり，今後の臨床像の変化について検証が必要である。
またPOT1：106のtst保有株に関しては全MRSAに占める割合としても2001年の2.7%（2/74株）から，2017年には12.7%（9/71株）へと増加していた。これは近年増加が報告されているST8-SCCmecIVlクローンであるCA-MRSA/Jの動向を反映している可能性がある14)。
CA-MRSA/Jは2012年に同定された日本固有のクローンであり，CC8クローンでありながらNY/Japanクローンより獲得したスーパー抗原遺伝子群（tst-sec-sel）をpathogenicity islandに保有している20)。またSCCmecIVlのJ1領域に，宿主への定着，免疫回避に寄与すると推測される細胞表面タンパクをコードするspjを保持する20)。さらにゲンタマイシン耐性も獲得した日本の環境に適応したクローンであると言え20)，膿痂疹からの分離は3割を超えるとの報告がある14)。CA-MRSA/Jは皮膚軟部組織感染症のみならず，全身播種性侵襲性感染症や死亡例の報告もあり21),22)，USA300と共に今後の動向を注視していく必要がある。
毒素遺伝子保有群は非保有群に比べて薬剤感受性は全体的に良好であり，特にMINOは100%が感受性であった。また推定USA300株は1株がCLDMに耐性であった以外は感受性パターンが全て一致し，EM，CPFXに耐性，MINO，GM，ST，CLDMに感受性であった。しかし既報では東京の複数の施設で収集されたUSA300の多くがLVFX，GM，CAMに耐性であったとされ3)，国内においても耐性を獲得したUSA300が存在し，地域差がある可能性が示唆された。
PVLは好中球，単球，マクロファージに対する膜孔形成毒素であり，PVL自体が組織に直接作用するのではなく，好中球の溶解で放出された炎症性メディエーターや活性酸素などによって壊死がおこるとされる4)。またPVLが低濃度の場合はミトコンドリアを介した経路で好中球をアポトーシスに導くと考えられている4)。詳細は現時点では不明であり，病原性について疑問を呈する意見もあるが1)，免疫異常の無い若年者に重篤な侵襲性感染症を起こした例も散見される4)。またUSA300に関しては毒素遺伝子の発現量が多いある種のサブクローンの存在や23)，宿主側の何らかの因子が影響する可能性も指摘されており23)，PVL産生性は留意すべき一つのポイントであると考えられる。したがって臨床像やPOT値からPVL産生が強く疑われる場合は，毒素産生を抑制するCLDMやLZDの使用を考慮しても良いかもしれない4)。
また国内におけるUSA300のアウトブレイクの報告も散見されていることから24)，院内での伝播にも一層の注意を要する。
今回の調査の限界点は1大学病院における皮膚軟部組織検体からの分離株に限定されたものであること，POT法は簡易的な推定でありクローンの確定に至っていない点が挙げられる。今後は臨床像の解析を含めた，より広範な地域・施設における大規模な検証が必要である。
本検討ではMRSAのクローンシフトに伴うと推定される毒素産生性の変化が確認できた。特に検出率が着実に上昇しているUSA300を中心とするPVL産生株に対しては，POT法でリスク評価が可能であると考えられた。今後もMRSAの病態や薬剤感受性は変遷する可能性があり，様々な方法で動向を注視していく必要があるが，POT法は日常検査におけるクローンの動向把握にも有用なツールであると思われる。
本論文の要旨は，第31回日本臨床微生物学会学術講演会で発表した。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
