原著
抗リン脂質抗体スクリーニングELISAの開発
2021 年 70 巻 4 号 p. 647-653
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2021 年 70 巻 4 号 p. 647-653
抗リン脂質抗体症候群（APS）の第一選択スクリーニング検査としてより多くの種類の抗リン脂質抗体を検出できるELISAの開発を目的とした。抗リン脂質抗体のエピトープ提供蛋白であるβ2グリコプロテインI（β2-glycoprotein I; β2GPI）とプロトロンビン（prothrombin; PT）を含有する成牛血漿（adult bovine plasma; ABP）と成牛血清（adult bovine serum; ABS）を固相化リン脂質（cardiolipin; CL）に結合させたaCL/ABP-ELISA，aCL/ABS-ELISAを開発し，その臨床的有用性を市販ELISAキットと比較した。2種のHome-made-ELISA間でAPS 63症例を対象に陽性率を比較した結果，aCL/ABS-ELISAに比較してaCL/ABP-ELISAが高い陽性率を示した。また，市販キット中で高い陽性率を示したIL-Japan aβ2GPI-IgG（61.9%）に比較して，aCL/ABP-ELISAの陽性率は85.7%と明らかに高かった。合併症別にみても動脈血栓症例（n = 41）で80.5%，静脈血栓症例（n = 12）で91.7%，血栓症合併例を含む妊娠合併症例（n = 8）で100%と明らかに高い陽性率を示した。これらの結果より，aCL/ABP-ELISAはAPSの第一選択スクリーニング検査として有用であると考えられる。
Anti-phospholipid antibodies (aPLs) do not bind directly to the negatively charged phospholipid itself but rather to complexes of the phospholipid and phospholipid-binding proteins, and their most common antigenic targets are β2-glycoprotein I (β2GPI) and prothrombin (PT). Therefore, multiple aPLs to β2GPI and PT must be measured by ELISA to accurately diagnose antiphospholipid syndrome (APS). In this study, we developed a new ELISA kit that can detect more aPLs for the first screening test for APS diagnosis. Two laboratory-made ELISA kits were developed by combining immobilized cardiolipin (CL) with two epitope-providing proteins, ABP and ABS. We measured the level of each aPL in 140 plasma samples from APS patients (n = 63) and healthy subjects (n = 77) using our two ELISA kits and 10 commercial ELISA kits. We performed the receiver operating characteristic (ROC) curve analysis on the absorbance level in mOD detected by aCL/ABP and aCL/ABS ELISA using the 140 plasma samples, and we set the cut-off values for our two ELISA kits. The positivity rate for aPLs in the APS patient group was higher for the two laboratory-made ELISA kits than for the commercially available ELISA kits. ROC curve analysis showed that the accuracy of APS prediction based on aCL/ABS-ELISA results was 0.73 in terms of the area under the ROC curve (AUC), whereas that based on aCL/ABP-ELISA results was 0.91. These results suggest that aCL/ABP-ELISA is useful as the first screening test for APS diagnosis.
抗リン脂質抗体症候群（APS）は，種々のリン脂質およびリン脂質結合タンパクを標的抗原とする抗リン脂質抗体群の出現に伴い，動・静脈血栓症や妊娠合併症などを発症する自己免疫疾患である1)～3)。本症候群は，明らかな基礎疾患を持たずに抗リン脂質抗体が出現することで発症する原発性APSと，膠原病などに併発する続発性APSがあり，基礎疾患としては全身性エリテマトーデス（SLE）が最も代表的である。APSの診断には抗リン脂質抗体の検出が必須であるが4)，APS患者血中に出現する抗リン脂質抗体は認識するエピトープの違いにより，抗カルジオリピン抗体（aCL），抗β2グリコプロテインI抗体（aβ2GPI），抗カルジオリピン／β2GPI複合体抗体（aCL/β2GPI），抗ホスファチジルセリン／プロトロンビン抗体（aPS/PT）など様々な種類があり，診断のためにはそれぞれの抗体を高価なELISAキットを用いて測定しなければならない5)。
そこで，本研究ではAPS診断における第一選択スクリーニング検査として，より多くの種類の抗リン脂質抗体を検出できるELISAの開発を目的に，抗リン脂質抗体のエピトープ提供蛋白であるβ2GPIとPTの両方を含有する成牛血漿（adult bovine plasma; ABP），成牛血清（adult bovine serum; ABS）を固相化リン脂質に結合させた2種類のHome-made-ELISAを作成した。そしてHome-made-ELISAの臨床的有用性を現在日本で市販されているELISAキットと比較検討した。
APS患者63症例（男性：10例，女性：53例；平均年齢：49.78歳［16～82歳］）。
合併症の内訳は，動脈血栓症41例（静脈血栓症合併例を含む），静脈血栓症12例，妊娠合併症8例（血栓症合併例を含む），APS合併疑い7症例（臨床所見は見られないがaPL陽性例），健常人77例。
本研究は，山口大学大学院医学系研究科保健学専攻医学系研究倫理審査委員会承認（296）を得て実施した。
2． Home-made-ELISAのプロトコル 1） aCL/ABP-ELISAエタノールで50 μg/mLに調整したカルジオリピン（cardiolipin; CL）（Sigma Aldrich社）を96wellプレート（Thermo Fisher Scientific社）に30 μL/well添加し，ドライヤーの冷風による急速ドライアップ法にて固相化した。その後ブロッキングバッファー（20 mM Tris-HCl，0.1 M NaCl，10% ABP，pH 7.4）を200 μL/well添加し，室温にて2時間静置した。各wellを洗浄バッファー（20 mM Tris-HCl，0.1 M NaCl，0.05% Tween20，pH 7.4）にて4回洗浄後（以降の洗浄操作はすべて同じ），希釈バッファー（20 mM Tris-HCl，0.1 M NaCl，10% ABP，0.05% Tween20，pH 7.4）で101倍希釈したサンプル血漿を100 μL/well添加し，室温にて1時間反応させた。洗浄後，希釈バッファーで20,000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体（American Qualex社）を100 μL/well添加し，1時間反応させた。洗浄後，発色基質であるテトラメチルベンジジン（tetramethyl benzidine; TMB）（Thermo Fisher Scientific社）を100 μL/well加え，10分間発色させた後，1 NHClを100 μL/well加えて反応を停止し，マイクロプレートリーダーにて波長450 nmの吸光度を測定した。吸光度に1,000を乗じた値を結合活性（単位：mOD）とした（Figure 1）。
開発したHome-made-ELISAの反応ステップを示す。エタノールによって50 μg/mLに調整したカルジオリピンを96wellプレートに固相化し，ABPもしくはABSを含むブロッキングバッファーにてブロッキングした。洗浄後，希釈バッファーにて101倍希釈したサンプル血漿を添加し，1時間静置反応させた。その後希釈バッファーにて20,000倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体を添加し，1時間静置反応させたのちTMBを加えて10分間発色させた。1NHClを添加することで反応停止し，450 nmの吸光度を測定した。
aCL/ABP-ELISAのプロトコルで用いたブロッキングバッファー，希釈バッファーに含まれるABPをABSに変更し，同様の操作で行った（Figure 1）。
aCL/ABP-ELISA，aCL/ABS-ELISAにおいて結合活性の異なる3つのサンプルを用いて20重測定を行い，同時再現性を検討した。
3． 市販ELISAキットを用いた抗体価測定APS患者63症例を対象に10種類の市販ELISAキット（Table 1）を用いて各種抗体価を測定した。
| 会社名 | キット名 |
|---|---|
| ヤマサ醤油株式会社 | 抗CL・β2GPIキット「ヤマサ」EIA |
| MBL | MESACUPTMカルジオリピンテスト MESACUPTMカルジオリピンIgM PS/PT ELISA Kit |
| IL Japan | QUANTA Lite® ACA IgG III QUANTA Lite® ACA IgM III QUANTA Lite® β2GPI IgG QUANTA Lite® β2GPI IgM QUANTA Lite® aPS/PT IgG QUANTA Lite® aPS/PT IgM |
結合活性の異なる3つのサンプルを用いた同時再現性検討の結果，変動係数（coefficient variation; CV）はaCL/ABP-ELISAで2.7%，2.5%，3.1%，aCL/ABS-ELISAで2.2%，2.1%，2.4%であった（Table 2）。
| aCL/ABP-ELISA | aCL/ABS-ELISA | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Sample | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 |
| Mean (mOD) | 1,458.9 | 2,277.5 | 521.4 | 1,629.9 | 2,782.1 | 747.8 |
| SD (mOD) | 40.1 | 55.9 | 16.1 | 36.4 | 58.3 | 18.1 |
| CV (%) | 2.7 | 2.5 | 3.1 | 2.2 | 2.1 | 2.4 |
Home-made-ELISAにおけるAPS患者（n = 63）と健常人（n = 77）の測定結果よりROC解析（Figure 2）を行い，「感度＝特異度」となる点をカットオフ値とした。その結果aCL/ABP-ELISAは93m OD，aCL/ABS-ELISAは96m ODをカットオフ値として設定した。また，aCL/ABP-ELISAの感度（＝特異度）は0.84，aCL/ABS-ELISAでは0.71であった。
ROC解析を行い，「感度＝特異度」となる点をカットオフ値とした。その結果aCL/ABP-ELISAは93m OD，aCL/ABS-ELISAは96m ODをカットオフ値として設定した。ROC曲線下面積（AUC）はaCL/ABP-ELISAが0.91（95%信頼区間：0.83–0.95），aCL/ABS-ELISAが0.73（95%信頼区間：0.64–0.81）であった。感度（＝特異度）はaCL/ABP-ELISAが0.84，aCL/ABS-ELISAが0.71であった。
APS患者（n = 63）における陽性率は市販ELISAキットで23.8～61.9%だったのに対して，aCL/ABP-ELISAで85.7%，aCL/ABS-ELISAでは71.4%だった（Figure 3A）。また，X2独立性検定にてp < 0.05を有意差ありとしてHome-made-ELISAと市販ELISAキットの陽性率を比較した。その結果aCL/ABP-ELISAでは全ての市販キットとの間に有意な差が認められた（p < 0.05）。aCL/ABS-ELISAにおいては全てのaPS/PT関連ELISAキット，MBL aCL-IgM，IL Japan aCL-IgG，IgM，aβ2GPI-IgMと比較して有意な差が認められ（p < 0.05），「ヤマサ」aCL/β2GPI，MBL aCL-IgG，IL Japan aβ2GPI-IgGとの間には有意な差は認められなかった。合併症別に見ると動脈血栓症群（n = 41）における市販ELISAキットの陽性率は19.5～65.9%であり，aCL/ABS-ELISAでは65.9%，aCL/ABP-ELISAでは80.5%の陽性率を示した（Figure 3B）。一方，静脈血栓症群（n = 12）では，市販ELISAキットにおいて33.3～75.0%の陽性率を示し，aCL/ABP-ELISAでは91.7%，aCL/ABS-ELISAで83.3%の陽性率を示した（Figure 3C）。また，血栓症合併例を含む妊娠合併症群（n = 8）においては，市販ELISAキットでは0～87.5%の陽性率を示し，aCL/ABP-ELISA，aCL/ABS-ELISAともに100%の陽性率を示した（Figure 3D）。ROC解析により，縦軸を感度，横軸を1－特異度としてROC曲線下面積（area under the curb; AUC）にてAPS患者におけるaCL/ABP-ELISAとaCL/ABS-ELISAの診断能力を比較した結果，aCL/ABP-ELISAがAUC = 0.91（95%信頼区間：0.83～0.95），aCL/ABS-ELISAがAUC = 0.73（95%信頼区間：0.64～0.81）であった。なお，統計解析には市販の統計解析ソフト（StatFlex ver. 6）を用いて行った。
A：市販ELISAキットでは23.8～61.9%であり，aCL/ABP-ELISAが85.7%，aCL/ABS-ELISAが71.4%であった。
B：市販ELISAキットでは19.5～65.9%であり，aCL/ABP-ELISAが80.5%，aCL/ABS-ELISAは65.9%であった。
C：市販ELISAキットでは33.3～75.0%であり，aCL/ABP-ELISAが91.7%，aCL/ABS-ELISAが83.3%であった。
D：市販ELISAキットでは0～87.5%であり，aCL/ABP-ELISA，aCL/ABS-ELISAともに100%であった。
| aCL/ABP vs | ヤマサaCL/β2GPI | MBL aCL-IgG | IL Japan aβ2GPI-IgG | IL Japan aPS/PT-IgG | IL Japan aPS/PT-IgM | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 判定一致率（%） | 74.6 | 69.8 | 76.2 | 54.0 | 50.8 | |
| 判定一致（例） | 47 | 44 | 48 | 34 | 35 | |
| 判定不一致（例） | 16 | 19 | 15 | 29 | 28 | |
| Home-made-ELISAのみ陽性 | 16 | 19 | 15 | 27 | 25 | |
| 内訳 | 動脈血栓症 | 7 | 11 | 6 | 16 | 19 |
| 静脈血栓症 | 5 | 3 | 5 | 5 | 3 | |
| 妊娠合併症 | 3 | 2 | 1 | 4 | 3 | |
| 合併症なし | 3 | 4 | 4 | 4 | 2 | |
| 市販キットのみ陽性 | 0 | 0 | 0 | 2 | 3 | |
| 内訳 | 動脈血栓症 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| 静脈血栓症 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | |
| 妊娠合併症 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 合併症なし | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
2種のHome-made-ELISAのうちROC解析結果からより高い診断能能力を有するaCL/ABP-ELISAとAPS疑い含む63症例におけるaCL及びβ2GPI関連抗体測定キットの陽性率上位3種類「ヤマサ」aCL/β2GPI，MBL aCL-IgG，IL Japan aβ2GPI-IgG，そしてaPS/PT測定キットの陽性率上位2種類IL Japan aPS/PT-IgG，IL Japan aPS/PT-IgMの5つの市販キットを用いて陽性，陰性判定一致率を比較した（Table 2）。aCL/ABP-ELISAとaCL及びβ2GPI関連抗体を測定する3つの市販ELISAキットの判定結果を比較すると，判定一致率は69.8～76.2%であり，判定不一致例は全てaCL/ABP-ELISAのみ陽性となった。次にaCL/ABP-ELISAとIL Japan aPS/PT-IgG，IgMの2つの市販ELISAキットの結果を比較すると，判定一致率は54.0%，50.8%であった。また，判定不一致例の中で市販ELISAキットのみ陽性の検体がIL Japan aPS/PT-IgGで2例，IgMで3例であったのに対してaCL/ABP-ELISAのみ陽性の検体はaPS/PT-IgGで27例，IgMで25例であった。
同時再現性は，aCL/ABP-ELISAでCV = 2.5～3.1%，aCL/ABS-ELISAでCV = 2.1～2.4%と良好な結果であった。
APS疑いを含む症例において市販ELISAキットで最も高い陽性率を示したのは，IL-Japan aβ2GPI-IgGの61.9%であったが，aCL/ABP-ELISAでは85.7%と有意に高い陽性率を得られた。また，合併症別に見ても動脈血栓症・静脈血栓症・妊娠合併症の全ての症例でaCL/ABP-ELISAの陽性率は市販ELISAキットと比較して高い傾向が見られ，APS診断の第一スクリーニング検査としての高い有用性が示唆された。しかし，静脈血栓症例や妊娠合併症例に関してはサンプル数が少ないためこれらの症例数を増やし，aCL/ABP-ELISAのAPSスクリーニング検査における合併症別の有用性を検討していく必要がある。
ROC解析を用いて2種類のHome-made-ELISAの診断能力を比較するとaCL/ABP-ELISAがaCL/ABS-ELISAと比較して高い診断能力を有することが示唆された。その理由として血漿には血清と比較して多くの凝固蛋白が含まれており，診断基準に含まれるaCL/β2GPIに加えてその有用性が報告されている6)プロトロンビンに関連する自己抗体の検出が可能であることが考えられる。
aCL/ABP-ELISAと5つの市販ELISAキットの判定結果を比較すると，判定一致率は50.8～76.2%と幅広く，特にaPS/PT関連ELISAキットとの判定一致率はIL-Japan aPS/PT-IgGは54.0%，IgMは50.8%と低い結果となった。判定不一致例を見ると，aCL/ABP-ELISAのみ陽性検体はIgGで27検体，IgMで25検体であり動脈血栓症をはじめとして多くの症例を見逃していることが分かる。また，複数種のaPL測定キットを組み合わせることでAPS検出率が向上することが報告されており7)，今回比較した2種類のaPS/PT関連ELISAキットの判定結果を組み合わせると陽性率は69.8%まで上昇し，判定一致率は71.4%となった。しかし，aPS/PT単独陽性となる検体に関してはaCL/ABP-ELISAで検出することができなかった。今回開発したHome-made-ELISAは固相化リン脂質としてカルジオリピンを用いており，ホスファチジルセリンに関連するaPLは検出できないためであると考えられる。
一方で，aCL/ABP-ELISAとaCL及びβ2GPI関連抗体を測定する3つの市販ELISAキットの判定結果を比較すると，判定一致率は69.8～76.2%であった。市販ELISAキットとaCL/ABP-ELISAとの判定不一致例をみると市販ELISAキットのみ陽性の検体は無く，1種類の市販ELISAキットで検出できない検体もaCL/ABP-ELISAを用いることで検出可能であることが示唆された。また，今回比較した3種類の市販ELISAキット判定結果を組み合わせると陽性率は73.0%まで上昇したが，それでもaCL/ABP-ELISAの陽性率が高く，判定一致率は84.7%となった。市販ELISAキットの測定では1キットにつき1種類のaPLの測定しか行うことができないため，1キットのみの使用ではAPSの見逃し率が高く，診断の際には複数種のキットを同時に測定する必要性がある。しかし，aCL/ABP-ELISAは複数種の市販ELISAキットを組み合わせた判定結果と良好な一致率を示し，一度の測定でAPS症例をより多く検出可能であることが考えられる。
また，aPLにはIgGとIgMのアイソタイプが存在し，今回開発したHome-made-ELISAではaPLのIgGのみ測定しているため，IgM陽性症例では検出できないものも見られた。両方のアイソタイプを測定することでより見落としが少なくなりスクリーニング検査の精度を高めることができると考えられる。本検討では対象症例としてAPS症例のみを用いたがAPS以外の自己免疫疾患に関しても測定を行い，Home-made-ELISAのAPSスクリーニングELISAとしての臨床的有用性を検証する必要があると考える。
APS患者血中には多種多様な抗リン脂質抗体が混在しており，それぞれの抗体が持つ血栓形成作用が複雑に絡み合って多彩な合併症が引き起こされると推測される。従ってAPSを迅速かつ適切に診断するためには，混在する複数種の抗リン脂質抗体を幅広く検出できるスクリーニング検査が必須であると考える。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
