技術論文
CLSIガイドラインに準じたEscherichia coliの簡易同定法の検証
2021 年 70 巻 4 号 p. 733-739
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2021 年 70 巻 4 号 p. 733-739
微生物検査における同定検査は質量分析装置を用いた迅速な同定法が普及しつつあるが，導入に至らない施設も多く，同定の迅速化に関する課題は完全に解消されていない。今回，臨床検体から高頻度に検出されるEscherichia coliの同定に関して，Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）が発行するM35-A2に記載された方法（CLSI法）およびこの原法にあたるYorkらの方法（原法）に基づいて各種性状検査を実施し，結果を比較，検証した。本検証には，臨床検体から分離されたオキシダーゼ試験陰性かつスポットインドール試験陽性の腸内細菌目細菌，全543株（E. coli：478株，対照株：65株）を使用した。結果，E. coliはCLSI法および原法ともに全株で同定可能であり，全体の99%が30分以内に結果を判定できた。対照株はCLSI法で6株，原法で1株の誤同定を認めた。これらはβ溶血を示したMorganella morganii 5株によるCLSI法のみでの誤同定と，PYR試験陰性の Klebsiella oxytoca 1株による両方法での誤同定に起因しており，日常検査では原法の使用がより適切と示唆された。本手法は，日常検査の様々な場面で，施設毎の必要に応じた効果的な導入が望ましいと考えられた。
Although rapid identification tests using a mass spectrometer are becoming mainstream, such tests are not applicable in all facilities because some of the facilities do not have a mass spectrometer. M35-A2 published by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) details rapid and simple identification methods for bacteria and yeast. In this study, the identification method for Escherichia coli described in the CLSI guidelines (CLSI method) was verified with the method of York et al. (original method), which is the basis of the CLSI method, using clinical isolates. Of the 543 strains (E. coli strains, 478; non-E. coli strains, 65) of gram-negative bacilli that were oxidase-negative and spot indole-positive, all E. coli strains were correctly identified by both methods and 99% of these strains could be identified within 30 minutes. However, six non-E. coli strains identified using the CLSI method and one non-E. coli strain identified using the original method were misidentified as E. coli. In more detail, one strain of PYR test-negative Klebsiella oxytoca was misidentified by both methods, and five strains of β-hemolytic Morganella morganii were misidentified only by the CLSI method. These results suggest that the original method was more suitable for routine laboratory test. We hope that this identification method is used meaningfully according to the situation of each laboratory.
近年，質量分析装置による同定検査が広く普及しつつある一方で，導入費用や施設規模などの諸事情により質量分析装置の導入に至らない施設も一定数存在している。質量分析装置未導入の施設においては，同定キットを用いた方法や用手的な従来法による検査を実施するため，同定結果報告に時間を要する場合が多い。また，本邦で汎用される薬剤感受性用パネルの一部は，菌種同定ウェルと薬剤感受性ウェルを組み合わせて作製されており，作業効率面で大きなアドバンテージがあるものの，限られたウェル数のため，搭載できる薬剤の種類や濃度設定が少ないことが課題となっている。よって，同定を迅速かつ安価に実施できる手法の導入は，上記のようなパネルの場合も含め，同定に要するキットやウェル，費用などの削減に繋がり，これらの削減分を，より多くの種類や濃度における薬剤感受性試験の実施などによる検査内容の充実化への転換に活用できる可能性がある。すなわち，付加価値のある検査結果の提供への一助となることが推察される。
迅速かつ安価な同定法の1つとしてClinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）が発行しているM35-A2“Abbreviated Identification of Bacteria and Yeast”と題されたガイドラインがあげられる1)。本ガイドラインでは，細菌と酵母様真菌における31の菌種（一部は属名）の信頼性を保証した簡易同定法が詳細に記されており，菌株からの同定を即時から4時間以内に行うことを可能としている。臨床検体から高頻度に検出されるEscherichia coliは，本ガイドライン中に同定法が記載されており，Yorkらの方法2)に基づいて一部改変を加えた方法が採用されているが，わが国での活用状況は不明である。そこで今回は，CLSIガイドラインに記載された方法およびその原法であるYorkらの方法に関して臨床分離株を用いた比較，検証を実施した。
2019年4月から2020年3月の12か月間に当院の臨床検体から分離されたE. coli 478株（同一患者検体および便検体は除く）を使用し，対照株として同時期に分離されたE. coli以外のインドール産生腸内細菌目細菌65株（Morganella morganii 22株，Klebsiella oxytoca 18株，Citrobacter koseri 7株，Raoultella ornithinolytica 6株，Proteus hauseri 3株，Citrobacter fermeri 2株，Proteus vulgaris 2株，Providencia rettgeri 2株，Providencia stuartii 2株，Edwardsiella tarda 1株）を用いた。また使用したすべての菌株はMALDI Biotyper（Bruker Daltonics）により測定，MALDI Biotyper software version 4.1.70（Bruker Daltonics）を用いた解析にてScore Value ≥ 2.0であることを確認した。
2． 簡易同定法 1） 本検討で用いた簡易同定法および評価方法CLSI M35-A2に準じたE. coliの同定法（CLSI法）およびこのガイドラインの原法であるYorkらの方法（原法）に基づいて各種性状検査を用いた同定を実施した。両方法ともに，オキシダーゼ試験陰性，スポットインドール試験陽性のグラム陰性桿菌において，β溶血能の確認，乳糖分解能の確認，Pyrrolidonyl arylamidase（PYR）試験，Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronide（MUG）試験をFigure 1に示すフローチャートに従った対象株に実施し，同定結果の差異を検証した。また，MUG試験においては結果判定までに要した時間も調査した。
A: CLSI method; B: original method. The dashed squares in the flow chart indicate the areas identified as E. coli. This figure was properly edited without affecting the interpretation of the original.
オキシダーゼ試験はチトクローム・オキシダーゼ試験用ろ紙（日水製薬）を用いて添付文書に従って使用，判定した。スポットインドール試験はp-Dimethylaminobenzaldehyde（富士フイルム和光純薬）にて調整したKobacs試薬を試験時に濾紙に浸み込ませ，菌苔を塗布後1分以内に赤色を示したものを陽性とした3)。
β溶血能は羊血液寒天培地（日水製薬）に被検菌を塗布し，好気培養および炭酸ガス培養下，35℃，18～20時間培養後の溶血環形成の有無にて判定した。乳糖分解能はマッコンキー寒天培地（栄研化学）に被検菌を塗布し，好気培養下，35℃，18～20時間培養後のピンク～赤色集落を乳糖分解株として判定した。
PYR試験は，まずL-Pyroglutamic acid 2-naphthylamide（Sigma-Aldrich）の0.2%溶液を作製し，この溶液25 μLを浸漬後に乾燥させたペーパーディスク（ADVANTEC）を用いて使用時にpH 7.2リン酸緩衝液にて湿らせた後に菌苔を塗布，10分後に4-Dimethylaminocinnamaldehyde（東京化成工業）の1%溶液を1滴滴下した後の赤色発色を陽性と判定した4)。MUG試験は，4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide hydrate（Sigma-Aldrich）をpH 7.5 Sorensen’sリン酸緩衝液にて調整したMUG試薬（終濃度：31.25 μg/mL）を作製，この溶液25 μLを浸漬後に乾燥させたペーパーディスク（ADVANTEC）を用いて使用時に滅菌水にて湿らせた後に菌苔を塗布，最大で2時間のインキュベート後の紫外線照射下（365 nm）における青色蛍光を陽性と判定した1)。PYR試験およびMUG試験ともに，未使用の試薬含有ディスクは，−20℃にて1年間を有効期限とした。なお，各調整試薬の作製手順，溶媒，有効期限は引用文献に準じた。
CLSI法に準じた同定のフローチャートおよび結果をFigure 2Aに示した。E. coli 478株中69株（14.4%）は，β溶血のみでE. coliと同定された。β溶血陰性の409株のうち乳糖分解した351株（73.4%）はすべてPYR試験陰性，乳糖非分解の58株（12.1%）はすべてMUG試験陽性で，いずれもE. coliと同定できた。
A: CLSI method; B: original method. The dashed squares in the flow chart indicate the areas identified as E. coli.
一方，対照株をこのフローチャートで検証すると，65株中5株（7.7%）はβ溶血を示しており，E. coliと誤同定された。この5株はいずれもM. morganiiであった。また，β溶血陰性の60株のうち，乳糖分解した25株中1株でPYR試験陰性を認めE. coliと誤同定されたが，乳糖非分解の35株はすべてMUG試験陰性であり，誤同定されなかった。
2． 原法による簡易同定原法に準じた同定のフローチャートおよび結果をFigure 2Bに示した。E. coli 478株中417株（87.2%）で乳糖分解を認め，このうちβ溶血を示した66株（13.8%）がE. coliと同定された。β溶血陰性の351株（73.4%）はすべてPYR試験陰性であり，また，乳糖非分解の61株（12.8%）はすべてMUG試験陽性となり，いずれもE. coliと同定できた。
また，対照株を用いたこのフローチャートにおける検証では，乳糖分解した25株中1株でPYR試験陰性を認めE. coliと誤同定されたが，その他の株では誤同定されなかった。
なお，前項1の検討も含め，本検討に用いたすべての株に関して好気培養および炭酸ガス培養における溶血性状の結果の差異を認めなかった。
3． E. coli以外のインドール産生腸内細菌目細菌の性状対照株として用いたインドール産生腸内細菌目細菌の性状をTable 1に示した。M. morganiiの22株中5株（22.7%）でβ溶血を認め，CLSI法において誤同定の原因となったが，その他の菌種においては全株でβ溶血を認めなかった。
| Species | No. of strains | No. of positive reactions | |||
|---|---|---|---|---|---|
| HEM | LAC | PYR | MUG | ||
| Morganella morganii | 22 | 5 | 0 | 0 | 0 |
| Klebsiella oxytoca | 18 | 0 | 18 | 17 | 0 |
| Citrobacter koseri | 7 | 0 | 1 | 7 | 0 |
| Raoultella ornithinolytica | 6 | 0 | 6 | 6 | 0 |
| Proteus hauseri | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Citrobacter fermeri | 2 | 0 | 0 | 2 | 0 |
| Proteus vulgaris | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Providencia rettgeri | 2 | 0 | 0 | 2 | 0 |
| Providencia stuartii | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Edwardsiella tarda | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
HEM: beta-hemolysis; LAC: fermentation of lactose; PYR: PYR test; MUG: MUG test.
両フローチャートともにPYR試験の実施対象となる乳糖分解株には，K. oxytocaの全18株，R. ornithinolyticaの全6株，C. koseriの1株があり，このうちK. oxytocaの1株がPYR試験陰性のため，誤同定の原因となった。
また，MUG試験の実施対象となる乳糖非分解株をはじめ，検討に用いた全対照株においてMUG試験陰性を示した。
4． MUG試験の結果判定に要した時間MUG試験の実施対象となったE. coliの61株において，陽性判定までに要した時間を調査したところ，61株中47株（77.0%）が20分以内に，56株（91.8%）が30分以内に該当した。また，対照株の65株においては，いずれの経過時間も陰性を示し，非特異的な反応を認めなかった（Table 2）。
| Time | E. coli (n = 61) | Others (n = 65) |
|---|---|---|
| 5 min | 4 | 0 |
| 10 min | 12 | 0 |
| 15 min | 12 | 0 |
| 20 min | 19 | 0 |
| 25 min | 7 | 0 |
| 30 min | 2 | 0 |
| 60 min | 4 | 0 |
| 120 min | 1 | 0 |
| Total | 61 | 0 |
CLSI法および原法の両方法ともに，オキシダーゼ試験陰性・スポットインドール試験陽性の条件を満たしたグラム陰性桿菌を同定の対象とするが，以降のフローチャートに若干の違いがある。CLSI法は血液寒天培地上のβ溶血の有無を確認することから始まり，β溶血を認めた場合はその時点でE. coliと同定される。一方，原法は乳糖分解の可否の確認から始まり，分解株のみβ溶血を認めた場合にE. coliと同定される。本検討では，乳糖非分解かつβ溶血を示すM. morganiiを5株認めており，溶血性状のみでの判定は誤同定を招く可能性が示唆された。一方，原法は乳糖非分解株において原則としてMUG試験の実施を推奨しているため，本事象による誤同定は生じにくいと推測されるが，リスクを考慮したうえで溶血性状の確認にて同定することを便宜的に可としており，この場合のリスクとして，M. morganiiやE. tarda，P. vulgarisの溶血株の存在を明記している。Yorkらは，これら溶血株の存在は地域性による可能性を示唆しており，今回の検討では，20%以上のM. morganiiにて溶血を認めた。よって，両方法の特性を適切に理解したうえでこれらを活用すべきであり，当院では乳糖非分解株における溶血性状のみでの同定を避けることができる原法を用いる方がより適切であると考えられた。
E. coliの各々の性状に着目すると，溶血株は69株（14.4%），乳糖分解株417株（87.2%）であった。この2つの性状をYorkらの検討結果と比較すると，乳糖分解株の割合は同程度であったものの，溶血株はおよそ半分の割合であった。今回の検証結果を誤同定のリスクがより低い原法のフローチャートに準じて同定した場合，乳糖分解および溶血性状にてE. coliと同定できた株は66株（13.8%）のみであり，PYR試験またはMUG試験の実施を必要とするケースが多数を占めることが判明した。両試験は各フローチャートにて必要性が生じた際にのみ実施したため，すべての株に対しては実施していないが，PYR試験は実施した351株のすべてで陰性，MUG試験は実施した61株すべてで陽性を示し，株間の多様性が少なく有用性の高い項目であることが改めて示唆された。また，引用文献に準じた試験開始から判定までの時間は，PYR試験は15分程であるのに対し，MUG試験は最大2時間後と迅速性をやや欠いた記載となっているため，MUG試験において陽性判定に要した時間を検討したところ，対象61株のうち56株（91.8%）が30分以内に陽性判定可能であった。すなわち，総合すると，今回対象としたE. coliの全478株のうち473株（99.0%）は30分以内に同定が完了することが確認され，改めて本法の迅速性が証明された。対照株に関しては，MUG試験は全株で陰性を示し誤同定の原因とならなかったものの，PYR試験では実施対象となる乳糖分解性のK. oxytocaの1株で陰性となり，誤同定の原因となった。日常検査に導入するにあたっては，これら性状検査による誤同定のリスクが多少なりともあることを念頭に置く必要があると考えられた。
本法に要する試薬費に関しては，培地類が日常検査業務で既に使用されていることを考慮すると，PYR試験およびMUG試験に要する費用が大半を占めるが，これらの費用を加味した1株あたりの同定費用は100円以下と試算しており（未公表データ），一般に汎用されている同定キットと比較すると1/10以下であった5),6)。さらに，作業量や試薬調整の手間，施設に応じた運用も踏まえた人件費も念頭に置かなければならない。作業量に関しては，PYR試験およびMUG試験ともに集落をペーパーディスクに塗り，試薬を滴下するのみと簡便であり，試薬調整に関しても，作製後1年間の保存が可能なことから，一度に大量の試薬を作製した場合は日々の業務負担はほとんどない。また，PYR試験においては，調整済み試薬も上市されているため，一部の業務負担を軽減する選択肢もある。以上を勘案すると，本同定法の導入に際した人件費への影響は軽微であると推察された。
今回の検討に用いた菌株は，検討期間中に選別することなく収集しており，実際の業務に採用した際も，検討結果に近い一致状況となるものと推察される。日常検査に導入する際の懸念事項として，今回の検討では，乳糖分解能はマッコンキー寒天培地を，溶血性状は日常検査で採用しているメーカーの血液寒天培地を用いて確認したが，これらは施設毎に採用している培地が異なるため，今回の検証結果と他施設の結果が必ずしも一致するとは限らないことや，培地観察（溶血性状および乳糖分解能の有無）が検査担当者の技量や経験に依存することがあげられる。よって，導入に際した施設毎の事前検討はもちろんのこと，導入後も施設内において性状の異なる複数の株を用いた定期的な検査担当者の精度管理を実施することが望ましい。また，本法が1菌種のための手法であることゆえ，施設の運用状況によっては本同定法の対象株だけを別作業で実施することが非効率となる場合があるため，導入にはワークフローのシミュレーションが必須となる。以上，本法を導入する際の懸念事項を考察したが，それらを加味したうえでも，総合的な観点から日常検査に有益であると推察される。
近年の同定法をとりまく状況の変化は著しく，迅速化の観点では質量分析装置の登場により劇的に改善されつつあるが，未導入施設も多く存在しており，すべての問題解決に至っているわけでは決してない。実際に，未導入の場合における翌日の菌名報告率は菌種ごとの差はあるものの，総じて低いという報告もある7)。また，導入施設においても有事に備えたバックアップ体制の構築は必須であり，バックアップのためだけにやみくもに高額な費用を計上することは経済的に決して望ましくない。よって，既報のエビデンスを活用した簡易同定法の導入はそれらの一助になると考えられる。特に，腸内細菌目細菌においては，多剤耐性株の存在や抗菌薬適正使用の観点から8),9)，より広い濃度範囲における薬剤感受性試験の実施が望ましいため，同定の簡略化によるコスト削減はそれらの実施に際しても間接的な利点となり得る。すなわち，腸内細菌目細菌においてこれらを実践できる環境を整えておくことは有益である。これらに関して，CLSI法ではE. coliおよびProteus speciesのみの記載であるが，その他では発色酵素基質培地を活用した迅速簡易同定法も報告されており10),11)，日常検査における導入の意義は高いと推察される。一方で，これらの簡易同定法が日常のワークフローに適さない施設においては過剰に当てはめる必要は無く，例えば，血液培養液のサブカルチャー後の集落を迅速に同定したい場合や複数回にわたる同一と推定される株の同定の場合にのみに活用するなども有意義な運用案と考えられる。その他，災害や新興感染症の蔓延に伴う社会活動の停止の際は，試薬の供給停止などの予期せぬ事態も十分に想定される。よって，これらの手法をはじめ，様々な視点を鑑みたバックアップ体制を日頃から準備しておくことは，単一の手法のみに極度に依存しない検査室運営を構築するために非常に重要であると同時に，用手的な従来法から離れつつある若手の臨床微生物検査技師の育成の点からも有用であると考えられる。
当院は，薬剤感受性試験の充実化を目的に費用投資をして各薬剤で広範な濃度域の測定を実施しているため，同定検査においては可能な範囲での迅速化および低コスト化に取り組んでいる。今回の検証結果を踏まえ，E. coliの同定においては原法に準じた方法が適切と結論づけ，当院の日常検査への導入を予定している。引き続き，1つでも多くの菌種にて簡易かつ迅速な同定手法を実践できるように他手法を含めて検証を重ねていきたい。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
