技術論文
2種のチミジン依存性SCVs-MRSA検出可能培地の検出性能に関する比較検討―クロモアガーMRSAスクリーン培地とニッスイプレートX-MRSA寒天培地の比較―
2021 年 70 巻 4 号 p. 748-753
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2021 年 70 巻 4 号 p. 748-753
今回我々は，チミジン依存性（small-colony variants MRSA；以下SCVs-M）検出可能培地であるクロモアガーMRSAスクリーン培地（関東化学）（A）とニッスイプレートX-MRSA寒天培地（日水製薬）（B）について，SCVs-Mの発育性能ならびに日常検査への有用性を評価した。方法：（1）臨床分離株：SCVs-M 3株，通常のMRSA 1株と，ATCC株：MRSA 1株，MSSA 1株を用い，発育性能確認試験，Miles & Misra法による発育支持能試験を行った。（2）2017年6～7月に提出された臨床検体50件を対象としMRSA検出能を比較検討した。結果：（1）2培地の結果は同等の発育性能であり，発育支持能もほぼ同等であった。SCVs-M 1株はA，Bともに発育に48時間要したが，2株は24時間で通常のMRSAと相違の無い発育を認めた。（2）臨床検体における感度／特異度／陽性的中率／陰性的中率は，24時間判定でA，Bともに100%/100%/100%/100%，48時間判定でA；100%/91.7%/33.3%/100%，B；100%/93.8%/40.0%/100%であった。まとめ：2培地のSCVs-M検出能，日常検査におけるMRSA検出能は，ほぼ同等であった。臨床検体の培養検査にこれらを用いることで，SCVs-Mが容易に検出されることが期待出来る。
Small colony variants (SCVs) constitute a slow-growing subpopulation of bacteria with distinctive phenotypic and pathogenic traits. Phenotypically, SCVs have a typical colony morphology and unusual biochemical characteristics. Therefore, it is difficult to detect and identify SCVs. It is suggested that SCVs are not detected in the conventional screening agar for methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). We compared growth performances of SCVs-MRSA in two culture media: CHROMagaer MRSA (CHROMagaer) and NISSUI plate X-MRSA agar (X-MRSA). We also compared the usefulness of these media with that of the medium used in a routine laboratory test. Method: (1) We examined the growth support ability by the Miles & Misra method. The strains used in the examination were isolates of three SCVs-MRSA strains and one normal MRSA strain and type strains of MRSA and MSSA. (2) For 50 clinical specimens, we compared the MRSA detectability. Result: (1) The growth support abilities of the two culture media were similar. One of the SCVs-MRSA strains required 48 h for growth in both culture media. The two other SCVs-MRSA strains showed the same growth as the normal MRSA in 24 h. (2) After 24 h of incubation, the sensitivity, specificity, positive predictive values (PPV), and negative predictive values (NPV) were all found to be 100% for the two culture media. After 48 h of incubation, the sensitivity, specificity, PPV, and NPV were 100, 91.7, 33.3, and 100 for CHROMagaer and 100, 93.8, 40.0, and 100 for X-MRSA, respectively. Conclusion: With the two culture media, the detectabilities of SCVs-MRSA and MRSA in a routine laboratory test were similar. We conclude that SCVs-MRSA can be easily detected using the two culture media.
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）は重要な院内感染起炎菌のひとつである1),2)。MRSAはときに重篤な感染症を引き起こし，抗菌薬治療が必要となるが，多系統の抗菌薬に耐性を示すため，感染症治療には適切な抗菌薬を迅速に投与する必要がある。MRSAを見落とすことなく，速やかに検出するために，多くの微生物検査室ではMRSA選択培地が頻用されている。
近年，持続性，再発性のS. aureusでは，抗菌薬の長期投与によりコロニーの極小化，発育の遅延などを示すsmall colony variant（SCVs）を形成することが報告されている3),4)。SCVsは，その発育の遅さから検出に時間を要し，生化学的性状もしばしば野生型株と比べ減弱しているため，見落としや誤同定につながりやすい5)。SCVs-MRSAは，MRSA選択培地に発育しないものもあることから6),7)，臨床微生物検査の現場で数多くのSCVs-MRSAが見逃されていることが推測される。
2017年3月よりクロモアガーMRSAスクリーン培地（関東化学）（以下CHROMagaer）は，チミジン依存性（TDs）SCVs-MRSAの発育が可能となるよう培地処方が改良された。我々は，TDs SCVs-MRSA検出におけるCHROMagaerの有用性について2017年9月に報告した7)が，CHROMagaerに続き，2017年4月，SCVs検出可能培地として日水製薬よりニッスイプレートX-MRSA寒天培地（以下X-MRSA）が発売された。これらの2種の選択培地について，TDs SCVs-MRSAの発育性能ならびに日常検査への有用性を比較検討したので報告する。
供試菌株
臨床分離株：TDs SCVs-MRSA 3株，通常のMRSA 1株
標準菌株：MSSA（ATCC29213）1株，MRSA（ATCC43300）1株
臨床分離株は当院微生物検査室にて別患者より分離された株であり，検出された材料の内訳は喀痰2株，耳漏1株である。MALDI Biotyper（ブルカージャパン）にてS. aureusと同定，スライドラテックス凝集反応によるPenicillin-binding protein2’（PBP2’）検出用キットMRSA-LA「生研」（デンカ生研）にてPBP2’陽性が確認された株を用いた。SCVs-MRSA 3株はPCR-based ORF Typing（POT法）（関東化学）にて別クローンであることが確認されている。またSCVs-MRSA 3株は，ミュラーヒントンE寒天培地（ビオメリュー・ジャパン，以下MH培地）全面に塗布し，100 μgチミジン含有ディスク（自家調整）を置いて35℃，好気条件下にて48時間培養後にディスクの周囲にのみ発育を認め，TDs SCVs-MRSAであることが確認された株である（Figure 1）。対象菌を滅菌生理食塩水で濁度計（MicroScanTurbidity Meter，ベックマンコールター）を用いてMcFarland0.5に調整し，CHROMagaer，X-MRSAの2培地に画線塗抹し，35℃好気培養にて24時間，48時間培養後，発育の有無を確認した。
供試菌株
臨床分離株：TDs SCVs-MRSA 3株，通常のMRSA 1株
標準菌株：MRSA（ATCC43300）1株
菌液は，滅菌生理食塩水で濁度計を用いてMcFarland 0.5に調整し，その後10−1から10−7まで段階希釈した。各菌株の菌液希釈系列より20 μLずつをCHROMagaer，X-MRSAの2培地に滴下し，35℃好気培養にて24時間，48時間培養後，発育したコロニー数をカウントした。
2． 臨床検体における検討 1） 対象検体と比較検討培地2017年6～7月に当院微生物検査室にて提出された臨床検体50検体を対象とした。
検体種別の内訳をTable 1に示す。
| Classification of Specimen | ||
|---|---|---|
| Swab | Stool | 23 |
| Throat | 23 | |
| Nasal cavity | 4 | |
| Total | 50 | |
CHROMagaer，X-MRSAの2種の選択培地を用いて臨床材料からのMRSA検出能を比較検討した。
2） 臨床検体の培地接種と培養スワブ採取検体は，CHROMagaerに塗抹後，残余検体を用いてX-MRSAに塗抹を実施し，10 μL白金耳を用いて画線塗抹を行った。塗抹した培地は35℃好気条件下で24時間，48時間培養した。
3） MRSA確認試験培養24時間もしくは48時間後に，CHROMagaerは藤色，X-MRSAは青色を呈するコロニーが発育した場合，MRSAを疑い確認検査を実施した。確認方法は，MALDI BiotyperにてS. aureusであることを確認し，Microscan Walk Away 96Plus（ベックマンコールター）にてPos ComboPanel 3.1Jを用いた薬剤感受性試験を実施することにより，MRSAか否かを同定した（複数の選択培地よりS. aureusが分離された場合は，全ての株でMALDI Biotyperによる菌同定は実施したが，Microscanパネルを用いた薬剤感受性試験はそれらのうち1株を対象に実施した）。菌液調整はプロンプト法により行い，MRSAの判定はCLSIの基準（oxacillin ≥ 4 μg/mL and/or cefoxitin ≥ 8 μg/mL）8)に従った。
4） 検討培地のMRSA検出成績の比較法48時間培養後の判定において検討培地のどちらか一方でもMRSAが検出された検体をMRSA陽性検体，どちらの培地でもMRSAが検出されなかった検体をMRSA陰性検体と定義し，2種の培地における感度，特異度，陽性的中率，陰性的中率を求めた。MRSA様コロニーが発育したがMALDI Biotyperによる同定検査によりMRSA以外であることが判明した場合を該当培地の偽陽性，他のMRSAスクリーニング培地にのみMRSAが発育した場合を該当培地の偽陰性と定義した。
結果をTable 2に示す。
| CHROMagaer | X-MRSA | |||
|---|---|---|---|---|
| 24 h | 48 h | 24 h | 48 h | |
| Clinical Isolate TDs SCVs MRSA 1 | + | + | + | + |
| Clinical Isolate TDs SCVs MRSA 2 | + | + | + | + |
| Clinical Isolate TDs SCVs MRSA 3 | − | + | − | + |
| Clinical Isolate MRSA 1 | + | + | + | + |
| Type strain MRSA | + | + | + | + |
| Type strain MSSA | − | − | − | − |
標準菌株MSSA 1株は，2培地とも発育抑制された。通常のMRSAは，臨床分離株，標準菌株ともに24時間培養の時点で，2培地ともに，MRSAと判別可能なコロニーの発育を認めた。コロニー判別能，コロニーサイズに差は認められなかった。TDs SCVs-MRSA 3株のうち2株は，24時間培養の時点で，2培地ともにMRSAと同等なコロニー形態での発育を示したが，1株は発育に48時間を要した。
2） Miles & Misra法による検討培地のMRSA発育支持能結果供試菌株の24時間，48時間培養結果をTable 3に示す。
| 10−1 | 10−2 | 10−3 | 10−4 | 10−5 | 10−6 | 10−7 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 24 h | CHROMagaer | Type strain MRSA | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 16 | 1 | 0 |
| Clinical Isolate MRSA 1 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 26 | 3 | 0 | ||
| Clinical Isolate SCVs MRSA 1 | > 100 | > 100 | 71 | 3 | 1 | 0 | 0 | ||
| Clinical Isolate SCVs MRSA 2 | > 100 | > 100 | 61 | 6 | 0 | 0 | 0 | ||
| Clinical Isolate SCVs MRSA 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| X-MRSA | Type strain MRSA | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 11 | 0 | 0 | |
| Clinical Isolate MRSA 1 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 36 | 7 | 0 | ||
| Clinical Isolate SCVs MRSA 1 | > 100 | > 100 | > 100 | 4 | 0 | 0 | 0 | ||
| Clinical Isolate SCVs MRSA 2 | > 100 | > 100 | 57 | 5 | 0 | 0 | 0 | ||
| Clinical Isolate SCVs MRSA 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| 48 h | CHROMagaer | Type strain MRSA | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 16 | 1 | 0 |
| Clinical Isolate MRSA 1 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 26 | 3 | 0 | ||
| Clinical Isolate SCVs MRSA 1 | > 100 | > 100 | 71 | 3 | 1 | 0 | 0 | ||
| Clinical Isolate SCVs MRSA 2 | > 100 | > 100 | 61 | 6 | 0 | 0 | 0 | ||
| Clinical Isolate SCVs MRSA 3 | > 100 | 15 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| X-MRSA | Type strain MRSA | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 11 | 0 | 0 | |
| Clinical Isolate MRSA 1 | > 100 | > 100 | > 100 | > 100 | 36 | 7 | 0 | ||
| Clinical Isolate SCVs MRSA 1 | > 100 | > 100 | > 100 | 4 | 0 | 0 | 0 | ||
| Clinical Isolate SCVs MRSA 2 | > 100 | > 100 | 57 | 5 | 0 | 0 | 0 | ||
| Clinical Isolate SCVs MRSA 3 | 35 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
標準菌株のMRSA，臨床分離株で通常のMRSA，TDs SCVs-MRSA 3株のうち2株は，24時間と48時間培養で変化はなかった。TDs SCVs-MRSA 3株のうち1株は，発育に48時間を要した。通常のMRSAに関しては，2培地とも10−5～10−6と，ほぼ同一の希釈倍率まで発育を認め，同等の発育支持能であった。それに対してTDs SCVs-MRSA 3株のうち2株は，10−4～10−5までしか発育を認めず，通常のMRSAに比べて発育抑制された結果となった。発育に48時間を要したTDs SCVs-MRSA 1株は，48時間培養で10−1～10−2にしか発育を認めなかった。
2． 臨床検体における2培地のMRSA検出能の比較成績（Table 4）| Culture medium | MRSA Positive | MRSA Negative | Sensitivity (%) | Specificity (%) | Positive predictive value (%) | Negative predictive value (%) | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 24 h | CHROMagaer | Positive | 2 | 0 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Negative | 0 | 48 | ||||||
| X-MRSA | Positive | 2 | 0 | 100 | 100 | 100 | 100 | |
| Negative | 0 | 48 | ||||||
| 48 h | CHROMagaer | Positive | 2 | 4 | 100 | 91.7 | 33.3 | 100 |
| Negative | 0 | 44 | ||||||
| X-MRSA | Positive | 2 | 3 | 100 | 93.8 | 40 | 100 | |
| Negative | 0 | 45 | ||||||
24時間判定におけるMRSA陽性検体は，CHROMagaer，X-MRSAでそれぞれ2検体あった。SCVs-MRSAの発育は認められなかった。24時間判定では，2培地とも感度，特異度，陽性的中率，陰性的中率が全て100%であった。48時間判定では，CHROMagaer，X-MRSAのMRSA陽性検体数は6検体，5検体であり，それぞれ4検体，3検体増加した。しかし48時間判定で増加したこれらは，コロニー所見はMRSA様であったが，MALDI Biotyperによる同定検査でMRSA以外であることが判明した偽陽性検体であり，これにより特異度，陽性的中率が低下する結果となった。
今回我々は，CHROMagaer，X-MRSAにおけるTDs SCVs-MRSAの発育性能ならびに日常検査への有用性評価を行った。
基礎的検討の結果，MSSA，通常のMRSAにおいては，発育抑制能，発育支持能ともに2培地に差のない結果となった。TDs SCVs-MRSA 3株のうち2株は，2培地とも24時間で発育を認めている。Miles & Misra 法における発育支持能の結果も2培地間で差はなかった。通常のMRSAと24時間で発育を認めたTDs SCVs-MRSA 2株の発育支持能を比較すると，通常のMRSAが10−5～10−6の希釈倍率まで発育を認めたのに対し，TDs SCVs-MRSA 2株は，10−4～10−5までしか発育を認めておらず，TDs SCVs-MRSAは発育抑制がかかっていることが明らかとなった。臨床材料からTDs SCVs-MRSAの発育を認めた際には，培地に発育した菌量は抑制されている可能性があるため，菌量報告の際には，コメントを付記するなど注意喚起をする必要があると考える。また材料中に存在するTDs SCVs-MRSAがごくわずかであった場合，培地に発育し得ない可能性があることも視野に入れるべきである。
TDs SCVs-MRSA 1株では，2培地とも発育に48時間を要した。本株のMiles & Misra法の結果では，X-MRSAが10−1でわずかな発育が得られたのに対し，CHROMagaerでは10−2まで発育しており，2培地間で発育支持能に差が出る結果となった。一部のTDs SCVs-MRSAにおいてはCHROMagaerの方が，発育支持能が高い可能性が示唆された。
培地の添付文書に記載された推奨培養時間は，X-MRSA 24～48時間，CHROMagaer 24時間（一部のMRSAでは48時間培養での確認が必要）であるが，今回の結果より，24時間で発育し得ないTDs SCVs-MRSAの存在が明らかとなっており，見落としを防ぐためにも48時間培養は必須と考える。
基礎的検討の結果，CHROMagaer，X-MRSAの2培地を比較すると，菌株によっては発育支持能に差を認め，また2培地とも通常のMRSAに比べ発育抑制を受けるが，TDs SCVs-MRSAを検出することは可能であると結論付けた。
臨床検体について考察する。2培地とも24時間培養の感度，特異度，陽性的中率，陰性的中率は，全て100%と良好な結果が得られた。しかし両培地ともに48時間培養を行うと，MRSA様のコロニー色調を呈する夾雑菌の発育により特異度，陽性的中率が低下したが，これは発色酵素基質培地の避けがたい特性と思われる。前述の通り，MRSAを見落としなく培養するためには48時間培養は必須と考えるが，48時間培養を行った際の特異度，陽性的中率の低下は常に念頭に置き，留意しながら同定検査を進めていくことが誤判定を避ける上で重要だと考える。
Clinical and Laboratory Standards lnstitute（CLSI）が推奨するMH培地8)は，トリメトプリムやスルフォンアミドとの拮抗作用を回避するためにチミジン濃度を下げた培地であり，そのためTDs SCVs-MRSAはMH培地には発育せず9)，CLSI勧告法に準拠した方法では薬剤感受性検査は実施できない10)ため，薬剤感受性試験結果よりSCVs-MRSAがMRSAか否かを判別することは困難である。CHROMagaerやX-MRSAを利用することにより，これらの培地にMRSA様のS. aureusが発育した場合，MRSAである可能性を疑いmecAやPBP2’を検出するなど，薬剤感受性試験以外の方法でMRSAを特定する糸口となる。
今後SCVs-MRSAの出現は，持続，再発感染者や長期の化学療法患者などの増加に伴い，さらに高まることが予測される。臨床検体の培養検査に，TDs SCVs-MRSA発育可能培地を用いることで，通常のMRSAだけでなく，TDs SCVs-MRSAをも発育させ，従来見落とされてきたTDs SCVs-MRSAが検出されることが期待出来る。
最後に本検討におけるlimitationについて述べる。基礎的検討で使用したTDs SCVs-MRSAの臨床分離株は3株と少なく，様々なタイプの菌株に関する検討が十分に実施できていないと考えられる。また臨床検体を用いた検討においてもn数が50件と少なく，種々の臨床材料を網羅していない。そのため，さらなるデータ検証が必要であると考えている。
本研究は菌株，臨床検体を用いた研究であり，患者情報を含まないため倫理委員会での承認は不要との見解を得て，実施している。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
