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2型糖尿病患者におけるMac-2結合蛋白糖鎖修飾異性体（M2BPGi）の測定意義
2022 年 71 巻 2 号 p. 301-306
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2022 年 71 巻 2 号 p. 301-306
生活習慣病の増加に伴い，非アルコール性脂肪肝疾患（nonalcoholic fatty liver disease; NAFLD），非アルコール性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis; NASH）の患者は増加しており，肝細胞癌や肝硬変の主な原因となりつつある。NAFLD/NASHは肥満，インスリン抵抗性など2型糖尿病と共通リスク因子をもつため，2型糖尿病との合併率が高いとされる。今回，2型糖尿病患者を対象に，M2BPGiの測定データから肝線維化の状況ならびに，その影響因子について検討した。また，既存の肝線維化スコアリングシステムであるFIB-4 indexとの比較も行った。2型糖尿病患者全対象者のM2BPGi値は0.22～4.11 C.O.Iの範囲となり，中央値は0.815 C.O.Iであった。カットオフを1.0とした場合の陽性率は38.2%であった。M2BPGi値に対する影響因子を検証するため，M2BPGi値を目的変数とし，説明変数に生化学検査，血算，HbA1c，年齢，BMIを用い，重回帰分析を行った。結果，AST高値，高齢，アルブミン低値，トリグリセライド高値がM2BPGi高値の因子として有意であった。FIB-4 indexとの相関性は極端値除外処理後の169例で相関係数（r）を求めたころ，r = 0.449であった。M2BPGiとFIB-4 indexの判定一致率は53.5%（陽性53例，陰性38例）となり，不一致例はM2BPGi（−）でFIB-4 index（+）が66例，M2BPGi（+）でFIB-4 index（−）が12例であった。2型糖尿病患者については，FIB-4 index陰性例であってもM2BPGiを測定することで，肝線維化症例の見落としを防ぐことが期待される。
With the recent increase in cases of lifestyle-related diseases, the numbers of patients with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are increasing, which are becoming the main causes of hepatocellular carcinoma and liver cirrhosis. Since NAFLD and NASH have common risk factors with type 2 diabetes, such as obesity and insulin resistance, they appear with high frequency as complications of type 2 diabetes. In this study, we investigated the status of hepatic fibrosis and factors affecting them from the measured M2BPGi levels of type 2 diabetes patients. We also compared them with the FIB-4 index, a currently used hepatic fibrosis scoring system. The M2BPGi levels of all the patients with type 2 diabetes ranged from 0.22 to 4.11 C.O.I. with a median of 0.815 C.O.I. The M2BPGi positivity rate was 38.2% when the cut-off was set at 1.0 C.O.I To verify the factors that affect the M2BPGi level, multiple regression analysis was carried out using the M2BPGi level as the dependent variable and biochemical test results (e.g., blood count and HbA1c level), age, and BMI as explanatory variables. The results showed that high AST level, old age, low albumin level, and high triglyceride levels were the factors significantly associated with high M2BPGi level. The correlation coefficient (r) for the correlation with the FIB-4 index in 169 cases after excluding extreme values was 0.449. The agreement between assessment using M2BPGi level and that using the FIB-4 index was 53.5% (53 M2BPGi-positive cases, 38 M2BPGi-negative cases). There were mismatched cases: 66 cases negative for M2BPGi and positive for the FIB-4 index, and 12 cases positive for M2BPGi and negative for the FIB-4 index. In type 2 diabetes patients, measurement of M2BPGi levels even in FIB-4 index-negative cases is expected to prevent oversight of cases of liver fibrosis.
近年，生活習慣病の増加に伴い，非アルコール性脂肪肝疾患（nonalcoholic fatty liver disease; NAFLD）の患者が増加している。NAFLDは患者の10～20%程度が非アルコール性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis; NASH）に移行し，その一部が肝細胞癌や肝硬変を発症すると報告されている1)。NAFLD/NASHは肝の脂肪化の程度よりも，肝線維化の進展度合いが生命予後に大きくかかわるため2)，肝線維化を評価することが臨床上重要となる。肝線維化評価のgolden standardは肝生検であるが，侵襲を伴うためスクリーニング検査や反復検査には適さない。そこで，簡便に測定できる肝線維化マーカーとして，2015年1月にMac-2結合蛋白糖鎖修飾異性体（Mac-2 binding protein glycosylateion isomer; M2BPGi）が保険収載された。M2BPGiは肝線維化の進行に伴い増加するタンパク質Mac-2結合蛋白（M2BP）上の糖鎖構造変化をとらえる検査である。
NAFLD/NASHと2型糖尿病は肥満，インスリン抵抗性などの共通リスク因子をもつため，合併率が高いとされる3)。そこで今回，2型糖尿病患者を対象に，M2BPGiの測定データから肝線維化の状況ならびに，その影響因子について検討した。また，既存の肝線維化スコアリングシステムであるFIB-4 indexとの比較から，それぞれの検査特性についても検討した。
2019年10月1日～2020年11月30日の間に当院糖尿病・代謝・内分泌内科を受診した2型糖尿病患者のうち，生化学検査，血算，HbA1cを同時測定した170名（男性：108名，女性：62名）とした。全対象者のプロファイルをTable 1に示す。当院のALPおよびLDは2020年4月1日よりIFCC法に変更となっており，それ以前のALP測定値（JSCC法）は0.35を乗じてIFCCに換算した。M2BPGiは生化学検査の残余血清を冷蔵保存し，3日以内に測定した。なお，本研究は川崎医科大学・同附属病院倫理委員会の承認（承認番号：3611-02）を得て実施した。
| 項目 | Median | 2.5 percentile | 97.5 percentile |
|---|---|---|---|
| Age | 70.0 | 40.5 | 88.0 |
| Body mass index (kg/m2) | 24.8 | 17.9 | 39.3 |
| WBC (103/μL) | 6.13 | 3.57 | 10.88 |
| RBC (106/μL) | 4.63 | 3.50 | 5.87 |
| HGB (g/dL) | 14.1 | 10.9 | 17.7 |
| HCT (%) | 42.5 | 33.2 | 51.5 |
| PLT (103/μL) | 213.0 | 120.3 | 378.0 |
| ALB (g/dL) | 4.20 | 3.48 | 4.83 |
| AST (U/L) | 23.0 | 12.0 | 69.5 |
| ALT (U/L) | 20.0 | 9.0 | 87.5 |
| LD (U/L) | 183.5 | 130.8 | 275.5 |
| ALP (U/L) | 76.0 | 41.0 | 135.3 |
| γ-GT (U/L) | 26.0 | 9.0 | 174.8 |
| CRE (mg/dL) | 0.865 | 0.468 | 1.973 |
| UA (mg/dL) | 5.70 | 2.28 | 9.10 |
| UN (mg/dL) | 17.00 | 6.85 | 33.50 |
| TG (mg/dL) | 133.0 | 50.0 | 478.5 |
| T-CHO (mg/dL) | 180.0 | 123.3 | 286.8 |
| HDL-CHO (mg/dL) | 48.0 | 27.8 | 91.0 |
| LDL-CHO (mg/dL) | 99.5 | 54.8 | 179.0 |
| HbA1c-NGSP (%) | 6.90 | 5.68 | 11.75 |
測定機器は化学発光酵素免疫測定装置「HISCLTM-5000」，測定試薬はMac-2結合蛋白（M2BP）糖鎖修飾異性体キット「HISCLTM M2BPGiTM」（いずれもシスメックス株式会社）を使用した。測定原理は2ステップサンドイッチ法を用いた化学発光酵素免疫測定法である。試料中のM2BPGiと試薬中のWisteria floribunda lectin（WFA）固定化磁性粒子が特異的に反応し，さらにALP標識抗M2BPモノクローナル抗体（マウス）が磁性粒子上のM2BPと特異的に反応する。未反応液除去後，発光基質CDP-StarTMを添加すると，CDP-StarTMが磁性粒子上のALPにより分解され，その際に生じた発光の強度を測定する。試料中のM2BPGi量に応じて発光強度は増加する。
3． 方法1） 試薬性能専用管理試料HISCLTM M2BPGiTM Control Level 1，Level 2（シスメックス株式会社）を用いて，20回連続測定による併行精度と，1日2回30日間のうち11日分の測定による室内精度を求めた。
2） 検体の保存安定性患者血清（各5例）を用い，冷蔵保存（2～8℃管理），凍結保存（−20～−30℃管理）ともに9日間までの検体保存安定性を確認した。冷蔵保存は0，1，2，3，7，9日目，凍結保存は0，3，7，9日目に測定した。
3） 2型糖尿病患者におけるM2BPGiの陽性率2型糖尿病患者におけるM2BPGi値の分布を確認し，陽性率を求めた。M2BPGi値の判定区分は1.00 C.O.I未満：（−），1.00～2.99 C.O.I：（+），3.00 C.O.I以上：（2+）とした。
4） M2BPGiの影響因子M2BPGi値に対する影響因子を検証するため，M2BPGi値を目的変数とし，説明変数にはTable 1で示した項目を用いた。目的変数は対数変換を行い正規化し，説明変数は多重共線性の回避のためスピアマン順位相関係数rが |r| > 0.8であった項目は除外した後，ステップワイズ法の変数自動選択（限界p値：0.05）で重回帰分析を行った。なお，統計処理には統計ソフト「Stat Flex」（（株）アーテック）を使用した。
5） 肝線維化スコアリングシステム（FIB-4 index）との比較FIB-4 indexは，年齢，AST値，ALT値，血小板数を用いて算出される肝線維化スコアリングであり，日常的な検査値から求められるため一般診療で用いられている。以下にFIB-4 indexの計算式を示す。
FIB-4 index =［年齢（歳）× AST（U/L）］／［血小板数（×109/L）× √ALT（U/L）］
今回，このFIB-4 indexを用い，M2BPGi値との相関性および判定一致率を求めた。まず，FIB-4 indexとM2BPGiの比（FIB-4 index/M2BPGi）を求め，極端値の除外処理として1回切断（切断係数：3SD）を行い，相関係数を求めた。また，FIB-4 indexとM2BPGi値で散布図を作成し，年齢の中央値である70歳（70歳未満：83例，70歳以上：86例）で識別した後，判定一致率を求めた。判定一致率に用いたカットオフ値はM2BPGi値が1.0，FIB-4 indexは1.3とした。さらに，FIB-4 index陰性症例についてはM2BPGi陰性群と陽性群でTable 1で示した項目を用い，有意差検定（Mann-Whitney検定）を行った。
併行精度は，管理試料Level 1の変動係数（CV）が1.63%（平均値：2.14 C.O.I），Level 2は2.85%（平均：5.38 C.O.I）であった。また室内精度は，Level 1の総合CVが3.72%（日内CV：3.56%，純日間CV：1.08%），Level 2の総合CVは4.37%（日内CV：3.01%，純日間CV：3.17%）であった。
2． 検体の保存安定性患者検体各5例の保存開始前（0日）の測定値は，冷蔵が0.63～5.70 C.O.I，凍結は0.54～5.70 C.O.Iであった。0日の測定値を基準とした場合，冷蔵・凍結保存ともに9日間までの変動率は10%未満であった（Figure 1）。
Storage stability of serum from 5 patients in refrigeration (2~8°C) and in freezing (−20~−30°C) were confirmed for 9 days. The rate of change in refrigeration and in freezing compared with the measured value on day 0 were less than 10% for 9 days.
2型糖尿病患者全対象者のM2BPGi値は0.22～4.11 C.O.Iの範囲となり，中央値は0.815 C.O.Iであった（Figure 2）。方法に示した区分による判定結果は（−）：105名，（+）：63名，（2+）：2名，計65名が陽性であり，陽性率は38.2%であった。陽性例のうち当院肝・胆・膵内科の受診歴がある症例は12例で，診断名はNASH：2例，PBC：1例，肝硬変：1例，HCV：1例などであった。また，全対象症例において対象期間中にM2BPGiの検査依頼が行われた症例が7例，腹部超音波の検査依頼は12例で，そのうち，超音波画像診断装置による肝硬度測定shear wave elastographyを実施した症例はなかった。
The distribution of M2BPGi value in 170 patients (male: 108, female: 62) with type II diabetes mellitus was indicated. The M2BPGi values ranged from 0.22 to 4.11 C.O.I, with a median of 0.815 C.O.I.
スピアマン順位相関係数の値より，赤血球との係数が |r| > 0.8であったヘモグロビンとヘマトクリットを説明変数から除外し，重回帰分析を行った結果をTable 2に示した。変数自動選択の結果残った変数は，AST，年齢，アルブミン，トリグリセライドであり，最もt値が高かったのはASTであった。自由度調整済決定係数は0.28711であった。
| Degree | Variable | β | std (β) | t value | p value |
|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 0.08450 | ||||
| 1 | AST | 0.01030 | 0.3733 | 5.56303 | 0.0000 |
| 2 | Age | 0.01045 | 0.2625 | 3.63168 | 0.0004 |
| 3 | ALB | −0.32270 | −0.2178 | 3.14683 | 0.0020 |
| 4 | TG | 0.00065 | 0.2006 | 2.93300 | 0.0038 |
multiple correlation coefficient R = 0.55135 [F = 18.33223 (df1 = 4 df2 = 169) p = 0.0000] adjusted coefficient of determination = 0.28711
極端値除外処理後の169例で相関係数（r）を求めたころ，r = 0.449であった。M2BPGiとFIB-4 indexの散布図をFigure 3に示す。散布図のプロットは70歳未満と70歳以上で識別している。判定一致率は53.5%（陽性53例，陰性38例）となり，不一致例はM2BPGi（−）でFIB-4 index（+）が66例，M2BPGi（+）でFIB-4 index（−）が12例であった。M2BPGi（−）でFIB-4 index（+）の66例のうち42例（64%）が70歳以上であり，FIB-4 index高値とされる2.67以上の群では9例全てが70歳以上であった。また，M2BPGi（+）でFIB-4 index（−）の12例では，9例（75%）が70歳未満であった。M2BPGi（+）でFIB-4 index（−）群とM2BPGi（−）でFIB-4 index（−）群で有意差（p < 0.05）があった項目は，AST，アルブミン，トリグリセライド，HbA1c，WBCであった。
A scatter plot of the FIB-4 index and M2BPGi values identified at the median age of 70 years (under 70 years old: 83 cases, 70 years or over: 86 cases) in 169 cases after exclusion processing of extreme values was created.
When the cutoff value was 1.0 for M2BPGi and 1.3 for FIB-4 index, the agreement rate was 53.5% (53 positive cases, 38 negative cases). Discrepancies were found in 66 cases of M2BPGi (−) with FIB-4 index (+) and in 12 cases of M2BPGi (+) with FIB-4 index (−).
C型肝炎ウイルス治療薬の進歩によりC型肝炎の制御が可能となった現在，NAFLD/NASHは肝細胞癌や肝硬変の主な原因となりつつある1)。本研究では2型糖尿病患者を対象に，M2BPGiの測定データから肝線維化の状況把握ならびにその影響因子について検討を行った。
まず，M2BPGi測定の基本的性能を確認したところ，精度については，併行精度がCV 3%未満，室内精度はCV 5%未満と良好な結果であった。また，検体の保存安定性は，冷蔵・凍結保存ともに，9日間までは10%以内の変動であることが確認された。
2型糖尿病患者において，M2BPGiが陽性であり肝線維化が疑われる症例は38%と約4割におよんだが，当院肝・胆・膵内科を受診した症例は65例中12例にとどまった。2型糖尿病患者はNAFLD/NASHの発症と関連性が強く，正常血糖例でのNAFLD有病率が27%であるのに対し，糖代謝異常例では43%であるとの報告があり4)，本検討でも同等の結果となった。また，糖代謝異常やインスリン抵抗性は肝線維化進展の強いリスクファクターとされており，糖尿病は肝線維化進展リスクを2.387倍増大させるとの報告もある5)。しかし，本検討の結果では，2型糖尿病において肝線維化マーカーであるM2BPGiの測定や腹部超音波診断を行った症例は少なく，肝線維化進行例の拾い上げが十分とはいえない状態であり，今後の課題であることがうかがわれた。
M2BPGi値における影響因子を解析した結果では，AST高値，高齢，アルブミン低値，トリグリセライド高値がM2BPGi高値の因子として有意であった。これらは以前より報告されている肝線維化進展の影響因子と同様の結果であったが3),6),7)，自由度調整済決定係数が0.28711と適合度が低く，これら影響因子の値からM2BPGi値を予測するのは困難と思われた。
FIB-4 indexとの比較では，判定一致率は約5割であり，M2BPGi陰性でFIB-4 index陽性の不一致例が多く確認された。今回は糖尿病患者を対象としたため，肝生検が行われておらず，どちらが肝線維化を反映しているか明確ではないが，現在のところM2BPGi偽陰性，偽陽性の明らかな要因は報告されていない。FIB-4 indexは高齢者での偽陽性が指摘されており8)，本検討においても，不一致例の64%が70歳以上であり，そのうちFIB-4 index高値とされる2.76以上の群では9例全てが70歳以上であったことから，前述の通りFIB-4 indexが高齢者で偽陽性となる可能性を示唆する結果となった。
また，FIB-4 indexは陰性的中率が高いこと9)，簡便で低コストであることから肝線維化症例の拾い上げ検査として推奨されているが，本検討ではM2BPGi陽性でFIB-4 index陰性の症例は1割程度確認された。M2BPGi陽性，FIB-4 index陰性の12例は平均年齢が53歳，うち50歳未満は5例であった。FIB-4 indexは50歳未満では偽陰性が増加するとの指摘もあり10)，これら12例もFIB-4 indexの偽陰性の可能性が考えられた。M2BPGi陽性，FIB-4 index陰性の症例の患者背景を確認したところ，明らかな共通点は確認されなかったが，M2BPGi陰性，FIB-4 index陰性の症例と比較すると，M2BPGi高値の因子（AST，アルブミン，トリグリセライド）以外にHbA1c，WBCが高い傾向であった。したがって，FIB-4 index陰性症例において年齢が若く，HbA1c，WBCが高い症例については，M2BPGiを併せて測定することで，肝線維化症例の見落としを防ぐことが可能であると考えられた。
2型糖尿病患はNAFLD/NASHのハイリスク群であり，いかに肝線維化進行例を拾い上げるかが重要となっている。当院2型糖尿病患者におけるM2BPGi陽性率は約4割に及んだが，日常的なM2BPGiの検査依頼はほとんどなかった。M2BPGiは肝生検による組織学的線維化分類（F0～F4）との高い相関性が報告されており，その有用性は高いことから11),12)，臨床に対するM2BPGi測定意義の啓発が重要な課題といえる。一般診療で使用されるFIB-4 indexを用いスクリーニング検査を実施し，FIB-4 indexが陰性であっても，疑わしい症例についてはM2BPGi測定を行うことで，肝線維化症例の見落としを防ぎ，画像診断や肝生検へつなげる一助となることが期待される。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
