Real-time PCRを用いたHTLV-1遺伝子定量法の確立

Abstract

臓器移植では，レシピエントがドナーから持ち込まれたウイルスによって移植後に重大な感染症による合併症を引き起こすことが知られている。そのため，移植禁忌とされているヒトT細胞白血病ウイルスI型（human T-cell leukemia virus type 1; HTLV-1）などの感染症は，移植前検査を行い感染の有無を確認することが重要である。ただし，生体腎移植では，移植前からHTLV-1に感染していたレシピエントにHTLV-1感染ドナーからの臓器提供は禁忌とされてはいない。そのため，HTLV-1の定量は感染リスクを評価する上で必要であると筆者らは考えている。本研究では，HTLV-1のラインブロット法（line blotting assay; LIA）法において判定保留となった場合を想定し，レシピエントおよびドナーの迅速診断に対応するため最終の確定診断となる遺伝子増幅法（real-time polymerase chain reaction; real-time PCR）を用いてHTLV-1遺伝子定量法（quantitative PCR）の確立を目指し検討を行った。Quantitative PCRに必要なstandard curveは，HTLV-1の配列より作成した合成オリゴヌクレオチドDNA fragmentsを使用しthreshold cycle（Ct）値からHTLV-1 DNA量（copies/μL）を算出するようにした。本研究において確立したquantitative PCRは，人工的に作成したDNA fragmentsを使用しているため，安定したHTLV-1の定量化が可能になると筆者らは考えている。

Translated Abstract

In organ transplantation, recipients are known to experience serious complications from infections after transplantation from viruses brought by organ donors. Therefore, it is important for donors to confirm the presence of infection in pre-transplantation testing for infectious diseases that are contraindicated for transplantation, such as human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1). However,in living donor renal transplantation, there is no contraindication to organ donation from an HTLV-1-infected donor for recipients who were infected with HTLV-1 prior to transplantation. Therefore,authors believe that quantification of HTLV-1 is necessary to assess the risk of infection. In this study, we aimed to establish a quantitative real-time polymerase chain reaction (quantitative PCR) method that can be used as a definitive method for rapid recipients and donors diagnosis, assuming cases in which the decision was withheld by the line blotting assay (LIA) method. The standard curve required for quantitative PCR was calculated as HTLV-1 DNA copies/μL from threshold cycle (Ct) values using DNA fragments generated from HTLV-1 sequences. The quantitative PCR established in this study uses artificially created DNA fragments, which should enable stable quantification of HTLV-1.

I　 はじめに

臓器移植では，移植を受ける患者（レシピエント）が臓器提供される健常者（ドナー）から持ち込まれたウイルスによって，移植後に重大な感染症による合併症を引き起こすことがある。また，拒絶反応を抑えるために必要な免疫抑制薬によって，本来発症しにくい感染症でも重症化しやすくなる危険性もある。そのため，代表的な感染症については，移植前からドナー検査を行い感染の有無を確認することが重要である。

臓器提供ドナーは，感染症の種類により本邦では移植する臓器によって禁忌とされている。代表的なのがヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus; HIV）やヒトT細胞白血病ウイルスI型（human T-cell leukemia virus type 1; HTLV-1）などである。特に，日本臓器移植ネットワーク（Japan Organ Transplant Network; JOT）の脳死下または心停止下臓器提供ドナーに関してはすべての臓器移植が適応外である¹⁾。

ただし，生体腎移植では，移植前からHTLV-1に感染していたレシピエントにHTLV-1感染ドナーからの腎移植は禁忌とされてはいない。そのため，HTLV-1の定量化は感染リスクを評価する上で必要であると筆者らは考えている。

HTLV-1は，1980年にヒトで発見された最初の病原性レトロウイルスである²⁾。

1990年の疫学調査では，全国で約120万人が感染していると報告されており，海外と比べても日本の感染者数が多いウイルスである³⁾。

HTLV-1を原因ウイルスとして発症する疾患には，1977年にUchiyamaら⁴⁾により提唱された成人T細胞白血病（adult T cell leukemia; ATL）が代表的である。また，1986年にはOsameら⁵⁾はHTLV-1関連脊髄症（HTLV-1-associated myelopathy; HAM）という新しい疾患概念を報告している。

臓器移植では，レシピエントがHTLV-1陰性でHTLV-1陽性ドナーから持ち込み感染するとウインドウピリオドを経て，その後ATLまたはHAMを発症した症例が複数報告されている^6),7)。

現在，国内におけるHTLV-1検出には，抗体スクリーニング検査法，抗原抗体反応を用いたタンパク質検査法およびHTLV-1の核酸検査法の3種類がある。

抗体スクリーニング検査法には，粒子凝集反応（particle agglutination test；PA法），化学発光酵素免疫測定法（chemiluminescence enzyme immunoassay；CLEIA法），化学発光免疫測定法（chemiluminescent immunoassay；CLIA法），または電気化学発光免疫測定法（electro chemiluminescence immunoassay；ECLIA法）などがある⁸⁾。タンパク質検査法の確認検査には，ウエスタンブロｯティング法（Western blotting assay；WB法）が採用されていたが，10～20%が判定保留となり確定診断まで困難なケースが多かった。そのため，判定保留に対してHTLV-1の核酸検査法であるreal-time polymerase chain reaction（real-time PCR）を実施することになり，2016年に保険収載されるようになった。

2017年には，WB法の判定保留軽減策としてラインブロット法（line blotting assay；LIA法）を測定原理とする検査法が開発され，新たな確認検査として保険収載されるようになり現在の診療アルゴリズムの流れが確立された^9),10)。

筆者らの施設で採用している抗体スクリーニング検査法としてCLEIA法，確認検査にはLIA法を臨床診断に採用している。

本研究では，生体腎移植を目的とするレシピエントおよびドナーのHTLV-1感染の迅速診断に対応するため，最終の確定診断となる末梢血液中のHTLV-1を核酸検査法であるreal-time PCRを用いてHTLV-1を数値化できる遺伝子定量法（quantitative PCR）の確立を目指し基礎的検討を行ったので報告する。

II　 対象

東京女子医科大学移植管理科において，2012年1月から2023年7月の間に臓器移植目的で来院され，CLEIA法にてHTLV-1抗体陽性であった19症例を対象とした。

内訳は，レシピエント9症例（男性5例，女性4例），ドナー10症例（男性6例，女性4例）である。

III　 方法

1． HTLV-1抗体スクリーニング検査

被検血清を使用してCLEIA法にて分析機器HISCL-5000（Sysmex Inc., Kobe, Japan），測定試薬HISCL HTLV-1Ab試薬（Sysmex Inc.）で測定を行った。

結果判定は，cut off index（COI）が1.0以上を陽性とした。

2． HTLV-1抗体確認検査

被検血清を使用してLIA法のイノリアHTLV（Fujirebio Inc., Tokyo, Japan）で測定を行った。

結果判定は，Gag p19，p24およびgp46のうち一つだけ陽性反応を示す場合には陰性とした。また，gp21のみ陽性反応を示す場合には判定保留とした。

3． HTLV-1遺伝子確認検査

被検血液10 mL中のbuffy coatよりHTLV-1デオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid; DNA）を抽出しquantitative PCR法で測定を行った。

1） HTLV-1 DNA抽出法

核酸抽出装置QIAcube Connect（Qiagen Inc., Hilden, Germany）を使用し，DNA blood mini kit（Qiagen Inc.）試薬でDNA抽出を行った。

抽出したDNAは，微量分光光度計NanoDrop One（Thermo Fisher Scientific Inc, Wilmington, DE, USA）にて濃度測定を行い，溶出量100 μLでおよそ100 ng/μL以上であることを確認した。

2） Quantitative PCR法

本研究では，Watanabeら¹¹⁾の文献を基にプライマー設定をHTLV-1 pX領域（pX2）とした。pX2-Sense-forward primer（pX2-S-forward primer）はCGGATACCCAGTCTACGTGTT（range 6,985 – 7,005 bp），pX2-antisense-reverse primer（pX2-AS-reverse primer）はCAGTAGGGCGTGACGATGTA（range 7,084 – 7,065 bp）とした（Figure 1）。

Figure 1　 HTLV-1のprimerおよびDNA fragments合成領域の位置関係

Taq Man probeは，CTGTGTACAAGGCGACTGG TGCC（range 7,012 – 7,034 bp）5'末端のReporterをFAMとし3'末端のQuencherをTAMRAとした。

マスターミックスは，TaqMan Fast Advanced Master Mix（2X）（Applied Biosystems Inc.）を用い，RT-PCR Grade Water（Invitrogen, CA, USA）を使用した。

内部標準遺伝子は，内部コントロールとしてTaqMan^TM Copy Number Reference Assay, human, RNase P（Applied Biosystems Inc.）を用いReporterをVIC，QuencherをTAMRAとした。

Quantitative PCRは，1 testあたりTaqMan Fast Advanced Master Mix（2X）を10 μL，pX2-S-forward primer（18 μM）とpX2-AS-reverse primer（18 μM）およびTaq Man probe（5 μM）のmixtureを1 μL，TaqMan^TM Copy Number Reference Assay, human, RNase Pを1 μL，RT-PCR Grade Waterを3 μL，sample DNAを5 μL（およそ500 ng/5 μL以上）合計20 μLとした。

3） Quantitative PCR反応条件

反応液20 μLを使用してHold StageのStep 1 UNG incubation（50℃，2分），Step 2 Polymerase Activation（95℃，20秒）反応後，PCR StageのStep 1 Denature（95℃，1分），Step 2 Annealing-Extension（60℃，20秒）の反応を40回繰り返し増幅し，HTLV-1遺伝子検出と定量解析を行った。

遺伝子増幅装置QuantStudio3の解析は，QuantStudio Design & Analysis Software v1.5.2（Applied Biosystems Inc.）で行った。

4） HTLV-1のDNA Fragments作成方法

DNA fragments合成領域の位置関係（Figure 1）

HTLV-1のreference sequenceは，National Library of MedicineよりHuman T-lymphotropic virus 1, complete genome（accession NC_001436）を確認しNCBIのPrimer-BLASTからHTLV-1の増幅領域を特定した¹²⁾。そしてSnapGene Viewer v7.0.2（SnapGene Inc, Boston, MA, USA）¹³⁾を使用してDNA Fragmentsを200 bp（range 6,935 – 7,134 bp）とし，直鎖状一重鎖DNA fragmentsをβ-Cyanoethyl Phoshoramidite法によりカスタムDNA（Thermo Fisher Scientific Inc.）を作成した。そして，DNA fragmentsの溶液濃度をRT-PCR Grade Waterを使用し1.0E + 10 copies/μLに調整した。

5） HTLV-1のDNA fragmentsによるstandard curve の作成方法

DNA fragmentsの1.0E + 10 copies/μL溶液は，RT-PCR Grade Waterを使用し1.0E + 08 copies/μL，2.5E + 06 copies/μL，2.5E + 05 copies/μL，2.5E + 04 copies/μL，2.5E + 03 copies/μL，2.5E + 02 copies/μL，2.5E + 01 copies/μLの溶液濃度をそれぞれ調整した。また，Microsoft Excel 2016を使用して指数近似曲線を作成した。

Standard curveは，threshold lineと交差する時点のサイクル数threshold cycle（Ct値）を使用した。そして，それぞれ7濃度のDNA fragments溶液のCt値から併行精度試験，検出限界試験，中間精度試験を確認した。また，standard curveの7濃度について理論値と実測値を比較しPCR増幅効率を確認した。

6） 統計解析

統計解析は，すべて小数点以下1桁数で表示し，JMP Pro 16.0 software（SAS Institute, Cary, NC, USA）を使用した。

IV　 結果

1． 併行精度試験および検出限界試験（Table 1）

Table 1　併行精度試験および検出限界試験

測定回数	1.0E + 08	2.5E + 06	2.5E + 05	2.5E + 04	2.5E + 03	2.5E + 02	2.5E + 01
1	9.4	16.4	20.3	24.5	28.8	32.2	36.1
2	9.4	16.4	20.4	24.5	28.8	32.2	34.5
3	9.8	16.2	20.3	24.5	28.9	32.4	35.3
4	9.4	16.4	20.4	24.7	29.9	32.6	35.7
5	9.7	16.6	20.6	25.0	29.0	32.7	35.5
6	10.0	16.5	21.2	25.2	29.0	33.3	36.2
mean	9.6	16.4	20.5	24.7	29.1	32.6	35.6
SD	0.2	0.1	0.3	0.3	0.4	0.4	0.6
CV（%）	2.5	0.7	1.6	1.1	1.3	1.1	1.6
Max	10.0	16.6	21.2	25.2	29.9	33.3	36.2
Min	9.4	16.2	20.3	24.5	28.8	32.2	34.5
Range	0.6	0.4	0.9	0.7	1.1	1.1	1.7
mean + 2.6 SD	10.2	16.7	21.4	25.4	30.1	33.5	37.0
mean − 2.6 SD	9.0	16.1	19.7	24.0	28.1	31.6	34.1

それぞれ希釈した7濃度の6重測定においてDNA fragments平均Ct値mean ± 2.6標準偏差standard deviationおよび変動係数Coefficient of Variation%は，1.0E + 08 copies/μL（mean 9.6 ± 0.2 SD, CV 2.5%），2.5E + 06 copies/μL（mean 16.4 ± 0.1 SD, CV 0.7%），2.5E + 05 copies/μL（mean 20.5 ± 0.3 SD, CV 1.6%），2.5E + 04 copies/μL（mean 24.7 ± 0.3 SD, CV 1.1%），2.5E + 03 copies/μL（mean 29.1 ± 0.4 SD, CV 1.3%），2.5E + 02 copies/μL（mean 32.6 ± 0.4 SD, CV 1.1%），2.5E + 01 copies/μL（mean35.6 ± 0.6 SD, CV 1.6%）であり，検出限界試験では34.1 Ct値であった。

2． Standard curveの中間精度試験

DNA fragmentsによるstandard curveの7濃度について5日間連続測定した結果では，理論値1.0E + 08 copies/μLはCV 3.0%，理論値2.5E + 06 copies/μLはCV 0.9%，理論値2.5E + 05 copies/μLはCV 0.8%，理論値2.5E + 04 copies/μLはCV 0.6%，理論値2.5E + 03 copies/μLはCV 0.8%，理論値2.5E + 02 copies/μLはCV 0.7%，理論値2.5E + 01 copies/μLはCV 1.2%であった。

3． Standard curveの理論値と実測値を比較

Standard curveは，指数近似曲線から算出しy = 3E + 10e^−0.575xであった（Figure 2，3）。

Figure 2　 DNA fragmentsから算出したmean値によるstandard curve

Figure 3　 DNA fragmentsから算出したstandard curveの増幅曲線

Standard curveの7濃度について理論値と実測値を比較した結果，（理論値1.0E + 08 copies/μL，実測値1.2E + 08 copies/μL），（理論値2.5E + 06 copies/μL，実測値2.4E + 06 copies/μL），（理論値2.5E + 05 copies/μL，実測値2.2E + 05 copies/μL），（理論値2.5E + 04 copies/μL，実測値2.0E + 04 copies/μL），理論値2.5E + 03 copies/μL，実測値1.6E + 03 copies/μL），（理論値2.5E + 02 copies/μL，実測値2.2E + 02 copies/μL），（理論値2.5E + 01 copies/μL，実測値4.0E + 01 copies/μL）であった。PCR増幅効率Efficiency（Eff%）は77.6%であった。

4． レシピエントおよびドナーのHTLV-1（Table 2）

Table 2　レシピエントおよびドナーのHTLV-1

No.		性別	抽出DNA （ng/μL）	CLEIA法	LIA法	HTLV-1 DNA （copy/μL）
1	レシピエント	男性	216.1	1.2	未検査	検出限界以下
2	レシピエント	男性	174.2	3.5	未検査	検出限界以下
3	レシピエント	女性	151.7	59.0	未検査	2.9E + 03
4	レシピエント	男性	150.0	2.1	未検査	検出限界以下
5	レシピエント	女性	126.5	4.1	未検査	検出限界以下
6	レシピエント	男性	101.9	1.8	未検査	検出限界以下
7	レシピエント	女性	258.8	7.9	未検査	1.9E + 03
8	レシピエント	男性	98.7	1.4	未検査	検出限界以下
9	レシピエント	女性	160.9	> 100.0	未検査	1.3E + 03
10	ドナー	男性	187.0	2.0	p19（+）p24（−）gp46（−）gp21（−）	検出限界以下
11	ドナー	男性	165.5	1.8	未検査	検出限界以下
12	ドナー	男性	165.0	1.2	p19（+）p24（−）gp46（−）gp21（−）	検出限界以下
13	ドナー	女性	129.6	4.6	p19（+）p24（−）gp46（−）gp21（+）	検出限界以下
14	ドナー	女性	136.9	1.7	未検査	検出限界以下
15	ドナー	男性	201.3	1.5	p19（+）p24（−）gp46（−）gp21（−）	検出限界以下
16	ドナー	男性	145.6	3.0	未検査	検出限界以下
17	ドナー	女性	132.1	2.2	未検査	検出限界以下
18	ドナー	男性	115.5	1.7	p19（−）p24（−）gp46（±）gp21（−）	検出限界以下
19	ドナー	女性	171.4	1.6	p19（+）p24（−）gp46（−）gp21（−）	検出限界以下

No. 1からNo. 9までがレシピエントでNo. 10からNo. 19がドナーである。

CLEIA法において陽性であったレシピエントの症例を対象とした結果では，LIA法はすべて未検査であった。しかし，quantitative PCRで3症例が陽性であり，症例No. 3はCLEIA法が59.0 COI，2.9E + 03 copies/μL，症例No. 7はCLEIA法が7.9 COI，1.9E + 03 copies/μL，症例No. 9はCLEIA法が > 100.0 COI，1.3E + 03 copies/μLであった。また，症例No. 3，7，9について抽出DNAを10倍希釈と100倍希釈をそれぞれ作成しquantitative PCRを測定した結果，症例No. 3の10倍希釈6.2E + 02 copies/μL，100倍希釈9.2E + 01 copies/μL，症例No. 7の10倍希釈2.8E + 02 copies/μL，100倍希釈4.6E + 01 copies/μL，症例No. 9の10倍希釈4.0E + 02 copies/μL，100倍希釈2.5E + 01 copies/μLであった。

CLEIA法において陽性であったドナー10症例を対象とした結果では，LIA法は4症例が未検査であり，6症例中症例No. 13のみp19（+）p24（−）gp46（−）gp21（+）で陽性判定であったが，quantitative PCRは全例が検出限界以下であった。

V　 考察

わが国では，生体腎移植において移植前からHTLV-1に感染していたレシピエントにHTLV-1感染ドナーからの臓器移植は禁忌とされていない。Yamauchiら¹⁴⁾の文献では，移植前からHTLV-1に感染しているレシピエントとドナーによる生体腎移植症例においてHAMやATLの発症を認めていないことを報告している。また，筆者らの施設においても同様で発症しないメカニズムは解明されていない（data not shown）。

本研究では，末梢血液中のHTLV-1を核酸検査法であるreal-time PCRを用いて数値化できるquantitative PCRの確立を目指し基礎的検討を行った。

HTLV-1は，約8,507 base（bp）¹⁵⁾のRNAをゲノムとして有するRNAウイルスであり，細胞内に取り込まれた後，RNAが逆転写酵素によりDNAに変換される。そして，DNAプロウイルスの形でヒト染色体に取り込まれるため，感染すると体内から排除されないと考えられている¹⁶⁾。感染経路は，母乳から子に感染する垂直感染，性交渉，輸血および臓器移植による水平感染を介した感染ルートに限られている。

HTLV-1の粒子構造は，正十二面体結晶性構造のp24 Capsid protein（nt 840–1484, accession NP_955618）とCapsid proteinを取り囲むGag p19 Matrix protein（nt 453–842, accession NP_955617），そして核様体を取り囲むウイルス表面の脂質二重膜（envelope）には，gp46 surface protein（nt 4829–6292, accession NP_057865）とgp21 transmembrane protein（nt 5765–6292, accession NP_955621）がスパイク構造を形成している（Figure 4）。

Figure 4　 HTLV-1の粒子構造

筆者らの施設で採用しているCLEIA法は，合成ペプチドであるHTLV-I/II p19抗原とgp46抗原を用いて，ALP標識抗ヒトIgGモノクローナル抗体（マウス）で検出する方法である。

LIA法は，遺伝子組み換えおよび合成ペプチドであるGag p24抗原，Gag p19抗原，gp46抗原，gp21抗原を検出ターゲットとして判定している¹⁷⁾。ただし，結果判定においてGag p19，p24およびgp46のうち一つだけ（+）反応を示す場合には陰性とし，特徴的なのがgp21のみ（+）反応を示す場合には判定保留とすることである。Kennethら¹⁸⁾の報告では，HTLV-1陽性症例においてgp21が広く免疫反応性を示すことを示唆しており，LIA法においてもgp21を中心に測定系および判定基準が組み立てられていることに一致すると筆者らは推察している。

本研究においてquantitative PCRは，Watanabeら¹¹⁾の文献を基にHTLV-1のpX2をターゲット領域とし，測定系を組み立てHTLV-1の配列より人工的に作成したDNA fragmentsもpX2領域付近に設定した。

DNA fragmentsを使用したquantitative PCRの基礎的検討では，併行精度試験において評価基準CV 10%以下としそれぞれ希釈した7濃度の6重測定で良好な結果が得られていた。検出限界試験では，平均Ct値mean ± 2.6 SD法でstandard curveから演算を行い4.0.E + 01 copies/μLまで検出可能であった。また，中間精度試験では低濃度領域の理論値2.5E + 01 copies/μLにおいてもCV 10%以下でとても良好な結果が得られていた。

7濃度のDNA fragmentsからstandard curveを算出して理論値と実測値を比較した結果では，相関係数R = 0.999で良好な解析結果が得られていた。また，PCR増幅効率Eff%は77.6%であったが臨床において十分定量検査法として検出精度が担保された結果が得られていたと筆者らは考えている。

レシピエントおよびドナーの被検検体による基礎的検討では，CLEIA法にてHTLV-1抗体陽性のレシピエントでは，LIA法がすべて未検査であった。本来臓器移植においてレシピエントは，HTLV-1陽性でも移植禁忌ではない。そのため，臨床としては確定診断まで実施していなかった。しかし，本研究においてquantitative PCRを行った3症例が陽性であり，CLEIA法のCOIとquantitative PCR のcopies/μLを比較すると現時点では症例数が少なく詳細な結論には至らなかった。ただし，3症例の抽出DNAを希釈確認した結果においてはコピー数の減少が確認できた。

CLEIA法にてHTLV-1抗体陽性のドナーでは，10症例中4症例がLIA法未検査であったが，測定済みの6症例中5症例が陰性判定であった。CLEIA法とLIA法の結果が乖離を生じる原因としては，血清中の各種自己抗体，不溶物（特にフィブリン）および自然抗体などにより，HTLV-1ではない偽陽性を呈する場合があるとCLEIA法の添付文書には記載があった¹⁹⁾。そこで，LIA法を実施した6症例についてそれぞれのターゲット抗原との反応性を確認すると，やはりLIA法においてもHTLV-1ではない反応性を示しているターゲット抗原があり，4症例がGag p19（+），1症例がgp46のみ（±）を生じていた。

特にLIA法のGag p19は，p24，gp46よりもHTLV-1ではない抗体と共通エピトープを有する交差反応性を示すターゲット抗原である可能性が高いことを筆者らは推察した。また，LIA法の1症例において陽性判定であったp19（+）p24（−）gp46（−）gp21（+）は，quantitative PCRでは検出限界以下であった。この症例においてとても興味深いのは，末梢血液中にHTLV-1抗体が存在するが細胞レベルではDNAプロウイルスは検出限界以下であったことである。先行文献では，豊田ら¹⁶⁾の報告ではDNAプロウイルスの形でヒト染色体に取り込まれるため，感染すると体内から排除されないと考えられている。また，Sagaraら²⁰⁾は，本症例に類似した症例を報告されており，今後このような乖離が生じる症例について臨床研究を進めていくことは，現在有効な治療薬や発症予防法が確立されていない現状を回避する一助になる可能性があると筆者らは示唆している。

現在の確認検査であるLIA法は，検査結果判定までにおよそ20時間を必要とする検査法である。

2023年に新たに承認された酵素免疫測定法enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA法）を原理としたイムノクロマトグラフィー法immunochromatography assay（ICA法）²¹⁾は，およそ15分で検査結果判定が可能な検査法であり，今後，診療アルゴリズムも改定されていくと考えられる。

筆者らが本研究で考案したHTLV-1の配列より人工的に作成したDNA fragments によるstandard curve（copies/μL）とは異なる視点からKuramitsuら²²⁾は，ATL由来のHTLV-1感染細胞株であるTL-Om1を使用して標準物質を開発し，9施設間での共同研究において補正値を使用したcopies/cells単位のプロウイルス量とし定量化を報告している。

本研究で確立したHTLV-I DNA copies/μLは，copies/cellsと単位としては異なるが定量化することに関しては同じである。copies/μLを単位にする定量法の利点としては，HTLV-1の感染細胞株から1細胞1コピーの非感染細胞gDNAを作成する操作が不要で簡便であること。そして，本研究でのDNA fragmentsによる室内中間精度試験の検討結果において保存による安定性が優れていたことである。

本研究における限界は，単一施設での後方視的研究であり，対象症例を生体腎移植目的としているためHTLV-1感染症例数が少ないことである。

VI　 結語

HTLV-1遺伝子定量法quantitative PCRは，およそ3時間で検査結果判定が可能であり生体腎移植を目的とするレシピエントおよびドナーの感染リスクを評価する上で有用な迅速診断法に成り得ると示唆される。

対象症例の検体使用に関しては，観察研究とし患者情報を匿名化して管理を行い，東京女子医科大学の倫理審査委員会承認（承認番号：2023-0092）のもとに実施した。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献

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