技術論文
血液透析患者におけるアルカリフォスファターゼ測定のIFCC法とJSCC法の基礎性能及びABO型，糖尿病を含めた比較検討
2025 年 74 巻 2 号 p. 317-324
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2025 年 74 巻 2 号 p. 317-324
【目的】血液透析患者血清を検体としたアルカリフォスファターゼ（ALP）測定において，IFCC標準化対応法（IFCC法）と旧JSCC標準化対応法（JSCC法）による試薬基礎性能試験を行い，さらに血液型や糖尿病の有無での活性値の特徴をみた。【方法】対象検体は2023年8月の血液透析患者の残余血清，試薬はIFCC法のLタイプワコーALP・IFCCとJSCC法のLタイプワコーALP・J2を使用した。検討内容は試薬性能試験として，併行精度，室内再現精度，正確さ，希釈直線性，定量限界，共存物質の影響，相関性試験を行い，血液型がA/AB型群，B/O型群との活性値の差や糖尿病の有無での活性値の差をみるために，ALPアイソザイム検査を行った。【結果】基礎性能試験において，IFCC法は全て試験で良好な結果であったが，JSCC法は共存物質の影響試験の溶血ヘモグロビンにのみ，高ヘモグロビン濃度で負誤差があった。血液型での特徴として，IFCC法ではA/AB型群とB/O型群とに活性値差はなかったが，JSCC法ではA/AB型群に比べB/O型群の活性値が高値傾向であった（p = 0.022）。また，アイソザイムでは，A/AB型群に比べB/O型群は小腸型の割合が高値傾向であった（p < 0.001）。糖尿病有無での特徴として，IFCC法，JSCC法ともDM群と非DM群に活性値に差がなく，アイソザイムに差がなかった。【結語】血液透析患者血清でのLタイプワコーALP・IFCCは良好な試薬性能を有し，A/AB型とB/O型とのALP値の差はJSCC法に比べると小さくなることが示唆された。
This study aimed to examine the basic performance of reagents for alkaline phosphatase (ALP) measurement using serum samples from patients undergoing hemodialysis using the IFCC standardization method (IFCC method) and former JSCC standardization method (JSCC method) and characteristics of activity values according to blood type and presence or absence of diabetes mellitus. Methods: Residual serum was obtained from patients undergoing hemodialysis in August 2023 using L-type Wako ALP/IFCC and ALP/J2 by the IFCC and JSCC method, respectively. The reagents were tested for concomitant accuracy, reproducibility in the laboratory, accuracy, dilution linearity, limit of quantification, influence of coexisting substances, correlation test as reagent performance tests, and ALP isozyme test to determine the difference in activity values between the blood type A/AB and B/O groups and in the presence of diabetes mellitus. In the basic performance test, the IFCC method showed good results in all tests; however, the JSCC method showed a negative error at high hemoglobin concentrations only in the hemolytic hemoglobin of the influence of the coexisting substances test. As a characteristic of blood groups, there was no difference in activity between the A/AB and B/O groups in the IFCC method; however, in the JSCC method, the activity was higher in the B/O group than in the A/AB group (p = 0.022). Among the isozymes, the B/O group had a higher percentage of the small intestinal type than the A/AB group (p < 0.001). Regarding the characteristics of patients with or without diabetes mellitus, there was no difference in activity values between the DM and non-DM groups using either the IFCC or JSCC methods, and isozymes. Conclusion: L-type Wako ALP/IFCC showed good reagent performance in serum from patients undergoing hemodialysis, suggesting that the difference in ALP values between the A/AB and B/O types was smaller than that of the JSCC method.
血液透析患者におけるアルカリフォスファターゼ（ALP）測定は定期的に実施することが推奨されており，「慢性腎臓病における骨ミネラル代謝異常（chronic kidney disease-mineral and bone disorder; CKD-MBD）」の観点から骨代謝マーカーとして利用することが提言されている1)。従来，国内でのALP活性測定はEAE緩衝液を用いた旧JSCC勧告法であったが，国際臨床化学会法（IFCC法）に変更された2)。また，骨代謝マーカーとは関係なく，血液型がB/O型であることや糖尿病（DM）により小腸型ALP（ALP5）が上昇する報告もある3),4)。これまでに，旧JSCC標準化対応法（JSCC法）とIFCC標準化対応法（IFCC法）での試薬基礎性能試験の報告があるが，血液透析患者血清を対象とした報告はない。今回，我々は市販のIFCC法試薬とJSCC法試薬を用いて試料に血液透析患者血清とした場合の基礎性能試験，血液型による影響，糖尿病と非糖尿病のALP値とALPアイソザイム値の特徴について検討した。
対象は2023年8月の血液透析患者の透析前の残余血清（透析血清）とし，活性値は直線性範囲かつ外観的に綺麗かつ血液型がわかっている血清176検体とした。
2． 機器・試薬測定試薬は富士フイルム和光純薬株式会社のIFCC法のLタイプワコーALP・IFCC（IFCC法）と比較対照法としてのJSCC法のLタイプワコーALP・J2（JSCC法），キャリブレーターは試薬キット指定の酵素キャリブレーターを使用した。測定装置は株式会社日立ハイテクの7180形日立自動分析装置を使用し，IFCC法およびJSCC法の分析条件はTable 1に示した。
| Items | ALP·IFCC | ALP·JSCC |
|---|---|---|
| Main wave length (nm) | 405 | 405 |
| Sub wave length (nm) | 505 | 505 |
| Speciment volume (μL) | 4.0 | 2.5 |
| Reagent (R1) volume (μL) | 160 | 160 |
| Reagent (R2) volume (μL) | 40 | 40 |
IFCC法とJSCC法の基礎性能試験において併行精度，室内再現精度，正確さ，希釈直線性，共存物質の影響，定量限界，相関性を検討した。統計解析：基礎性能にはValidation-Support-V62を用い，2群の比較にはEZR. ver. 1.61を用い平均値の比較はMann-Whitney U test，比率の検定はFisher’s extract testにて行った。
①併行精度：透析血清にて低・中・高活性の3種に調製し，各20回連続で測定し変動係数（C.V.%）を算出した5)～7)。許容誤差限界は日本臨床化学会が定める精密さの限界値（C.V.%）に従い，3.9%とした8)。
②室内再現精度：透析血清にて低・中・高活性の3種に調製し，20日間，毎日2点校正後に5重測定して，標準偏差（SD），C.V.%を求めた。それぞれ20日間5重測定のC.V.%を算出した5)。許容誤差限界は日本臨床化学会が定める精密さの限界値（C.V.%）に従い，3.9%とした8)。
③正確さ：常用参照標準物質を10回連続測定し，平均値の95%信頼区間内に認証値が含まれていた場合に正確性ありとした6)。
④希釈直線性：透析血清を用いて低活性域および高活性域の直線性を確認するために，各2種の血清にて10段階の希釈系列を作製し各5重測定した。各5重測定して低活性域と高活性域の直線性を確認した5),7)。共分散分析を利用し残差動の分散と純誤差分散比からF検定を行いp < 0.001でなければ直線性ありと判断した7)。
⑤共存物質の影響：共存物質として干渉チェックAプラス（シスメックス株式会社），共存物質を溶解する血清として低・高活性の2種の透析血清を用い，干渉物質のビリルビンF 19.7 mg/dL（遊離型），ビリルビンC 20.1 mg/dL（抱合型），溶血ヘモグロビン480 mg/dL及び乳び1,480 FTU（混濁）を2種の透析血清で10段階希釈し各希釈系列を5重測定した。各希釈系列の5重測定の平均値と共存物質無添加値と比較して，日本臨床化学会が定める許容誤差限界値 ± 5%以内は影響なしとした8)。
⑥定量限界：低活性の透析血清を生理食塩水で5段階の希釈系列を作製し，希釈系列を5日間2重測定して，精密度プロファイル（precision profile; PP）を求めC.V.%が10%以下となる活性値を定量限界とした9)。
⑦相関性：透析血清176検体を対象として，Passing Babloc回帰式を用いIFCC法と比較対照のJSCC法との相関性をみた7)。
⑧ALP値およびALPアイソザイム値の比較：A/AB型群とB/O型群，DM群と非DM群の各2群間にてALP値やアイソザイム値を比較した。なお，ALPアイソザイム分析はIFCC法とし，高分子型ALP（ALP1），肝型ALP（ALP2），骨型ALP（ALP3），胎盤型ALP（ALP4），ALP5，免疫グロブリン結合型ALP（ALP6）とした。ALPアイソザイム値はALP値にALPアイソザイム分画値（%）を掛けて算出した。なお，ALPアイソザイム分析は株式会社岡山医学検査センターへ委託した。
①併行精度：低・中・高活性の3検体の平均値及び各C.V.%はそれぞれIFCC法で76.9 U/L，180.5 U/L，260.6 U/L，0.7%，0.5%，0.6%，JSCC法で199.7 U/L，433.6 U/L，759.2 U/L，0.7%，0.8%，0.5%であった（Table 2）。
| ALP·IFCC | ALP·JSCC | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| L | M | H | L | M | H | |
| Mean (U/L) | 76.9 | 180.5 | 260.6 | 199.7 | 433.6 | 759.2 |
| S.D. (U/L) | 0.6 | 0.9 | 1.6 | 1.5 | 3.4 | 4.0 |
| C.V. (%) | 0.7 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.5 |
②室内再現精度：低・中・高活性の3検体の平均値及び各C.V.%はIFCC法で52.1 U/L，119.9 U/L，367.6 U/L，1.7%，1.2%，1.0%，JSCC法で153.8 U/L，367.8 U/L，1,056.2 U/L，1.3%，1.2%，1.1%であった（Table 3）。
| ALP·IFCC Low | ALP·IFCC Middle | ALP·IFCC High | ALP·JSCC Low | ALP·JSCC Middle | ALP·JSCC High | |||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Mean (U/L) | S.D. (U/L) | C.V. (%) | Mean (U/L) | S.D. (U/L) | C.V. (%) | Mean (U/L) | S.D. (U/L) | C.V. (%) | Mean (U/L) | S.D. (U/L) | C.V. (%) | Mean (U/L) | S.D. (U/L) | C.V. (%) | Mean (U/L) | S.D. (U/L) | C.V. (%) | |
| Intermediate precision | 52.1 | 0.9 | 1.7 | 119.9 | 1.5 | 1.2 | 367.6 | 3.6 | 1.0 | 153.8 | 2.0 | 1.3 | 367.8 | 4.2 | 1.2 | 1,056.2 | 11.2 | 1.1 |
| Diurnal precision | 52.1 | 0.7 | 1.3 | 119.9 | 1.2 | 1.0 | 367.6 | 2.7 | 0.8 | 153.8 | 1.5 | 1.0 | 367.8 | 3.6 | 1.0 | 1,056.2 | 8.6 | 0.8 |
| Repeatability presision | 52.1 | 0.5 | 1.0 | 119.9 | 0.8 | 0.7 | 367.6 | 2.3 | 0.6 | 153.8 | 1.2 | 0.8 | 367.8 | 2.3 | 0.6 | 1,056.2 | 7.1 | 0.7 |
③正確さ：常用参照標準物質の認証値と10回連続測定の平均値（95%信頼区間）はIFCC法で153 U/L，150.4（144.2–156.6）U/L，JSCC法で424 U/L，419.6（405.7–433.5）U/Lであり95%信頼区間に認証値は含まれた（Table 4）。
| ALP·IFCC | ALP·JSCC | |
|---|---|---|
| Certified value (U/L) | 153 | 424 |
| Expanded uncertainly (U/L) | ±6 | ±13 |
| n | 10 | 10 |
| Mean | 150.4 | 419.6 |
| S.D. (U/L) | 0.7 | 2.5 |
| C.V. (%) | 0.5 | 0.6 |
| Relative error | −2.6 | −4.4 |
| 95% confidence interval (U/L) | 144.2–156.6 | 405.7–433.5 |
④希釈直線性：IFCC法において低活性域は49.0–302.0 U/L（p = 0.25），高活性域は48.4–1,195.4 U/L（p = 0.61），JSCC法において144.8–864.8 U/L（p = 0.10），高活性域は144.8–3,408.8 U/L（p = 0.12）の範囲で直線性があった（Figure 1）。
⑤共存物質の影響：IFCC法ではビリルビンF，C，溶血ヘモグロビン，乳びの最大濃度まで影響はなかった。JSCC法ではビリルビンF，C，乳びの最大濃度まで影響はなかったが，溶血ヘモグロビンによる漸減減少があり，低活性血清では192 mg/dLで−6.1%，高活性血清では288 mg/dLで−5.0%と負誤差があった（Figure 2）。
⑥定量限界：IFCC法でC.V.%が10%以下となる活性値は4.7 U/L，同様にJSCC法では10.4 U/Lであった（Figure 3）。
⑦相関性：x軸をJSCC法，y軸をIFCC法とした回帰式はy = 0.341x + 0.951，相関係数r = 0.9766であった（Figure 4）。
⑧ALP値およびALPアイソザイム値の比較：ALP活性値の中央値（四分位範囲）について，A/AB群とB/O型群の活性値を比較したところ，IFCC法では2群に有意差はなかったが，JSCC法ではA/AB型群で248.0 U/L（209.5–315.0），B/O型群で288.0 U/L（226.0–380.0）となり，B/O型群が有意に高値であった（p = 0.022）（Table 5）。さらにALP5値の中央値（四分位範囲）がA/AB型群で2.5 U/L（0.0–4.1），B/O型群で11.8 U/L（4.4–18.8）でありB/O型群で有意に高値であった（p < 0.001）（Table 5）。DM群と非DM群の比較ではALP値，ALPアイソザイム値に有意差はなかった（Table 6）。
| All cases (n = 176) |
A/AB type group (n = 79) |
B/O type group (n = 97) |
p-value | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Gender | n | (%) | male | 107 (60.8) | 54 (50.5) | 53 (49.5) | 0.087** |
| female | 69 (39.2) | 25 (36.2) | 44 (63.8) | ||||
| Age | (year) | Median | (IQR) | 71.3 (61.2–79.4) | 71.6 (61.4–79.1) | 70.6 (60.5–79.5) | 0.578* |
| Duration of dialysis | (year) | Median | (IQR) | 7.7 (3.6–13.4) | 7.3 (3.4–13.8) | 7.7 (4.4–12.8) | 0.806* |
| DM | n | (%) | 72 (40.9) | 30 (41.7) | 42 (58.3) | 0.575** | |
| non-DM | n | (%) | 104 (59.1) | 49 (47.1) | 55 (52.9) | ||
| ALP·IFCC | (U/L) | Median | (IQR) | 88.0 (72.8–115.0) | 85.0 (73.5–110.0) | 91.0 (72.0–121.0) | 0.357* |
| ALP·JSCC | (U/L) | Median | (IQR) | 268.0 (216.8–346.8) | 248.0 (209.5–315.0) | 288.0 (226.0–380.0) | 0.022* |
| ALP1 | (U/L) | Median | (IQR) | 0.6 (0.0–3.6) | 1.3 (0.0–3.8) | 0.0 (0.0–3.5) | 0.627* |
| ALP2 | (U/L) | Median | (IQR) | 44.5 (34.2–56.5) | 47.4 (36.7–56.7) | 42.9 (33.3–54.8) | 0.306* |
| ALP3 | (U/L) | Median | (IQR) | 30.1 (22.1–42.4) | 31.4 (24.2–44.1) | 28.9 (21.5–39.7) | 0.198* |
| ALP4 | (U/L) | Median | (IQR) | 0.0 (0.0–0.0) | 0.0 (0.0–0.0) | 0.0 (0.0–0.0) | 1.000* |
| ALP5 | (U/L) | Median | (IQR) | 4.9 (1.9–12.5) | 2.5 (0.0–4.1) | 11.8 (4.4–18.8) | < 0.001* |
| ALP6 | (U/L) | Median | (IQR) | 0.0 (0.0–0.0) | 0.0 (0.0–0.0) | 0.0 (0.0–0.0) | 0.269* |
*: Mann-Whitney U test, **: Fisher’s extract test
| All cases (n = 176) |
DM group (n = 72) |
non-DM group (n = 104) |
p-value | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Gender | n | (%) | male | 107 (60.8) | 49 (45.8) | 58 (54.2) | 0.177** |
| female | 69 (39.2) | 23 (33.3) | 46 (66.7) | ||||
| Age | (year) | Median | (IQR) | 71.3 (61.2–79.4) | 71.9 (62.0–79.7) | 70.4 (60.4–78.9) | 0.604* |
| Duration of dialysis | (year) | Median | (IQR) | 7.7 (3.6–13.4) | 7.0 (2.5–10.8) | 8.4 (4.4–15.7) | 0.009* |
| A/AB type | n | (%) | 79 (44.9) | 30 (38.0) | 49 (62.0) | 0.538** | |
| B/O type | n | (%) | 97 (55.1) | 42 (43.3) | 55 (56.7) | ||
| ALP·IFCC | (U/L) | Median | (IQR) | 88.0 (72.8–115.0) | 87.5 (73.5–115.3) | 88.0 (72.8–115.0) | 0.873* |
| ALP·JSCC | (U/L) | Median | (IQR) | 268.0 (216.8–346.8) | 271.0 (216.8–332.3) | 263.5 (216.8–359.0) | 0.921* |
| ALP1 | (U/L) | Median | (IQR) | 0.6 (0.0–3.6) | 0.0 (0.0–3.0) | 1.6 (0.0–4.3) | 0.146* |
| ALP2 | (U/L) | Median | (IQR) | 44.5 (34.2–56.5) | 42.9 (35.7–55.2) | 46.6 (34.1–57.0) | 0.600* |
| ALP3 | (U/L) | Median | (IQR) | 30.1 (22.1–42.4) | 31.8 (24.1–42.0) | 28.7 (21.5–43.0) | 0.247* |
| ALP4 | (U/L) | Median | (IQR) | 0.0 (0.0–0.0) | 0.0 (0.0–0.0) | 0.0 (0.0–0.0) | 1.000* |
| ALP5 | (U/L) | Median | (IQR) | 4.9 (1.9–12.5) | 4.4 (2.3–15.5) | 5.0 (0.0–11.8) | 0.336* |
| ALP6 | (U/L) | Median | (IQR) | 0.0 (0.0–0.0) | 0.0 (0.0–0.0) | 0.0 (0.0–0.0) | 0.333* |
*: Mann-Whitney U test, **: Fisher’s extract test
今回，試料として透析血清を用い，IFCC法とJSCC法の2種の試薬の基礎性能試験を行ったところ，併行精度，室内再現精度，希釈直線性，定量限界，相関性は良好であり，正確さにおいては常用参照標準物質の認証値の95%信頼区間内の測定値が得られ，共存物質の影響ではIFCC法では影響なし，JSCC法では強度の溶血ヘモグロビン濃度で若干の負誤差を認めたが，概ね既報と同様の結果であることから10)～17)，透析血清を用いても精確度は劣らないものと思われる。JSCC法が溶血ヘモグロビンで負誤差のあった原因としては試薬中の基質である4-ニトロフェニルリン酸と測定によって生じる反応物である4-ニトロフェノールを分解して負誤差を生じるという報告があり，明確な機序は記されていないが，亜鉛には溶血ヘモグロビンの影響を抑える働きがあると記されている18)。添付文書によると今回使用したLタイプワコーALP・IFCCには亜鉛成分として硫酸亜鉛が含まれていた一方でLタイプワコーALP・J2には含まれていなかった。また，試薬に含まれる界面活性剤の種類及び濃度により負誤差を受けるとの報告もあり19)，本研究で明らかにはできないものの両者の試薬の間で界面活性剤に何らかの違いがある可能性が考えられる。測定波長を原因と考える報告もあるが20)，今回のIFCC法及びJSCC法は同じ測定波長であることから負誤差の原因とは考えにくい。
JSCC法でのALP値の中央値（四分位範囲）がB/O型群で288.0 U/mL（226.0–380.0）であり，A/AB型群で248.0（209.5–315.0）と比較して有意に高く，IFCC法では有意差を認めなかった。これはJSCC法ではEAE（2-ethylamino-ethanol）緩衝液が使われておりALP5の反応性が高いが，IFCC法ではAMP（2-amino-2-methyl-1-propanol）緩衝液であるためALP5を一定低く抑えていることが要因と推察される2)。しかしながら，健常人を対象とした報告ではIFCC法でもALP5値はA/AB型と比較してB/O型で高く測定されるとされており21)，血液透析患者を対象とした本研究でもALP5値の中央値（四分位範囲）がB/O型群で11.8（4.4–18.8）U/Lであり，A/AB型群で2.5（0.0–4.1）U/Lと比較して有意に高く同様の結果となった。DMによりALP値の上昇及びALP5値の上昇・検出を認める報告があるが3),4)，ALP5値の上昇を認めなかった報告もある22)。前者の神田らの報告4)では対象が全て入院治療を必要としている症例であり，DM昏睡も含まれている。さらにALP値の上昇及びALP5の検出率は糖尿病の悪化に比例して認めると報告している。本研究のDM群はカルテを確認する限り少なくともDMに対して入院治療を要する症例はおらず，ALP値およびALP5値に有意差を認めなかった原因と推察できる。
本研究の制約としてはALP5値が高脂肪食で上昇するが23)，採血時の食事について把握していないことが挙げられる。また，ALP5値はB/O型の分泌型で上昇しやすいとされているが24)，本研究は分泌型／非分泌型の検査をしておらず，これらを調査することでさらに詳細な評価ができると考える。
今回，血液透析前血清を試料として，ALPのIFCC法とJSCC法の2法の試薬で，基礎性能試験および血液型による影響の検討を行ったところ，基礎性能試験ではJSCC法での溶血ヘモグロビンで負誤差を認めた以外は良好な結果であり，また，今回解析した結果では，IFCC法ではA/AB型群とB/O型群でALP活性値に有意差はなかったが，B/O型群に高値傾向はみられた。
本論文の要旨は第69回日本透析医学会において発表した。
本研究は幸町記念病院倫理委員会の承認を受け実施した（承認番号：2023-11）。
本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。
