APTTクロスミキシングテストにおける直接経口抗凝固薬（DOACs）の影響

Abstract

ループスアンチコアグラント（LA）は，個々の凝固因子活性を阻害することなく，リン脂質依存性凝固反応を阻害する免疫グロブリンと定義される。LAの検出は，抗リン脂質抗体症候群（APS）分類基準における検査所見の1つであり，活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）を用いたクロスミキシングテストは，臨床検査室で一般的に行われるLA検査である。近年，直接経口抗凝固薬（DOACs）が，APTTをはじめとする凝固関連検査に影響を及ぼすことが問題視されている。本研究は，4種類のDOACs（dabigatran・rivaroxaban・edoxaban・apixaban）がAPTTクロスミキシングテストに与える影響，DOAC除去剤の有効性，およびスタクロットLAを用いた確認試験の有用性を検討した。その結果，すべてのDOACモデル療法血漿でLA疑いパターンを呈し，index判定でも約98%（63/64例）でLAおよびインヒビター疑いと判定された。DOAC除去剤で処理した血漿では，APTTの短縮は認めたものの，クロスミキシングテストの即時型パターンおよびindex判定にてLA疑いが散見された。一方，APTT系LA検査の確認試験では全例でLA陰性と正しく判定できた。本研究成果より，DOAC療法施行中の患者にLA検査を実施する際は，スタクロットLA試薬を用いた確認試験を行うことが重要であると考えられる。

Translated Abstract

Lupus anticoagulant (LA) is defined as an immunoglobulin that inhibits phospholipid-dependent clotting reactions without inhibiting the activity of individual clotting factors. Detection of LA activity by phospholipid-dependent coagulation assay is one of the laboratory test findings in the antiphospholipid syndrome (APS) diagnostic criteria. among LA screening tests, APPT-based cross-mixing tests are common tests in clinical laboratories. The cross-mixing test differentiates whether the prolonged clotting time is due to a coagulation factor deficiency, coagulation factor inhibitor, or LA, based on the coagulation plot pattern. Recent clinical studies suggest that patient plasma on direct oral anticoagulant (DOAC) therapy may influence LA determination by APTT-based cross-mixing tests. This study investigated the effects of four DOACs (dabigatran, rivaroxaban, edoxaban, and apixaban) on APPT-based cross-mixing tests, the efficacy of DOAC removers, and the usefulness of confirmatory testing using Staclot LA. As a result, many of the DOAC model therapy plasma samples were judged to be false positive for LA, and treatment with a DOAC remover may not have led to correct results. On the other hand, an LA confirmation test using the addition of hexagonal (II) phase phospholipid correctly determined that all cases were LA negative. The results of this study suggest that when conducting LA tests on patients undergoing DOAC therapy, it is important to perform a confirmation test using Staclot LA reagent.

I　 はじめに

ループスアンチコアグラント（LA）は，in vitroにおいて個々の凝固因子活性を阻害することなくリン脂質依存性の凝固反応を阻害する免疫グロブリンと定義され¹⁾，抗リン脂質抗体症候群（APS）の国際分類基準（“Sapporo Criteria” Sydney改訂版）において，検査所見の1つとして採用されている²⁾。LA活性は，抗リン脂質抗体がリン脂質濃度の限られた試験管内において，リン脂質を介する血液凝固反応を阻害することにより凝固時間を延長させる現象であるが，生体内においては後天性血栓性素因として作用する。実臨床においては，活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）の延長が確認された場合に，APTT延長の原因が凝固因子欠乏やインヒビターによる出血性素因なのか，LAによる血栓性素因なのかを鑑別するためにクロスミキシング試験を実施する³⁾。

クロスミキシングテストは，被検血漿と正常血漿を種々の割合で混和し，即時反応（混和血漿を作製後速やかにAPTT測定）と遅延反応（混和血漿を37℃・2時間インキュベーション後にAPTT測定）の凝固時間をグラフ上にプロットして，そのパターンからAPTT延長の原因を鑑別する検査法である^4),5)。凝固因子欠乏では，混和した正常血漿により凝固因子が補われることにより，APTTの延長が改善され，即時反応ならびに遅延反応ともに十分に補正される（下に凸の）パターンを呈する（Figure 1A）。遅延型の凝固因子インヒビターを有している場合は，即時反応では下に凸のパターンあるいは直線的なパターンのように混和直後では上に凸のパターンを示さないが，遅延反応で阻害される（上に凸の）パターンを呈する（Figure 1B）。一方，大部分のLAはリン脂質に対する即時型インヒビターであり，正常血漿混和による凝固因子の補正に関係なく即時反応，遅延反応ともに上に凸のパターン（Figure 1C）あるいはともに直線性を示す。クロスミキシングテストにおいて，1ポイントでも上に凸のポイントがあれば，LAの存在を否定できない。

Figure 1　 APTTクロスミキシングテストにおけるプロットパターン

A：凝固因子欠損症では，即時・遅延反応ともに下に凸のグラフとなる。特に50%のポイントが大きく下に凸となるのが特徴である。

B：凝固因子インヒビターパターンでは，即時反応と比較して遅延反応でより上に凸の傾向が強くなる。LAパターンとの違いは，50%のポイントが大きく離れることである。

C：大部分のLAはリン脂質に対する即時型インヒビターであり，正常血漿混和による凝固因子の補正に関係なく即時反応と遅延反応ともに上に凸のパターンを呈する。一方，LAの一部に即時反応，遅延反応ともに直線的なパターンを呈する症例が存在しており，凝固因子インヒビターと判定に困惑するケースがある。このような症例は，確認試験でLAか凝固因子インヒビターか診断することが重要である。

近年，直接経口抗凝固薬（DOACs）がLA検査をはじめ，様々な凝固関連検査に影響を及ぼすことが問題視されている⁶⁾。DOACには，Xa阻害薬であるrivaroxaban・edoxaban・apixabanに加え，トロンビン阻害薬であるdabigatranがあるが，それぞれがLAの検査結果に影響を及ぼす可能性が危惧される。

本研究では，DOACの種類や血中濃度が，APTTクロスミキシングテスト判定に及ぼす影響を明らかにするとともに，DOAC化合物を除去できる薬剤の有効性およびAPTT系LA試薬を用いた確認試験の有用性を検討した。

II　 材料および方法

1． 材料

1） 正常血漿・被検血漿

正常血漿はコアグトロールN（Sysmex）を用いた。被検血漿としてDOACモデル療法血漿を自施設にて作製した。DOACモデル療法血漿は，健常人プール血漿に4種類のDOAC（dabigatran・rivaroxaban・edoxaban・apixaban）を，終濃度がTable 1に示した2濃度（低濃度・高濃度）になるように添加した。高濃度は各種DOAC服用時における患者血中濃度のピーク値の上限値を超える値に設定した。低濃度はトラフ値の上限値－ピーク値の下限値の値で設定した⁷⁾。

Table 1　4種類のDOACの被検血漿濃度

	Dabigatran［ng/mL］	Rivaroxaban［ng/mL］	Edoxaban［ng/mL］	Apixaban［ng/mL］
低濃度	274	262	242	317
高濃度	516	526	489	632

DOACモデル療法血漿の作製において，健常人プール血漿に4種類のDOAC（dabigatran・rivaroxaban・edoxaban・apixaban）を2濃度（低濃度・高濃度）になるように添加した。

2） APTT測定試薬

日本血栓止血学会標準化委員会にてAPTT-LA検査試薬として推奨されているトロンボチェックAPTT-SLA（Sysmex），コアグピアAPTT-N（積水メディカル），ヒーモスアイエルAPTT-SP（アイ・エル・ジャパン），PTT-LA試薬「FR」（ロシュ・ダイアグノスティックス）の4種類を用いた（Table 2）。

Table 2　APTT測定試薬

	トロンボチェック APTT-SLA（Sysmex）	コアグピアAPTT-N （積水メディカル）	ヒーモスアイエル APTT-SP （アイ・エル・ジャパン）	PTT-LA試薬「FR」 （ロシュ・ダイアグノスティックス）
活性化剤	エラグ酸	エラグ酸	コロイダルシリカ	シリカ
リン脂質	合成リン脂質	リン脂質（ウサギ脳由来）	合成リン脂質	セファリン

日本血栓止血学会標準化委員会にてAPTT-LA検査試薬として推奨されている4種類の試薬を用いた。

3） DOAC除去血漿の作製

DOAC-Remove^TM（5-diagnostics）を用い，4種類のDOAC療法モデル血漿を添付文書に従って処理し，DOAC化合物を除去した。DOAC-Remove^TMは，凝固因子に対して有意な影響を与えず，血漿から95%以上のDOACを除去することが可能である。これは，特別に調製された添加剤を含む活性炭によりDOACを吸収することでDOACの作用を除去する仕組みであると考えられる。

2． 方法

1） APTTクロスミキシングテスト

正常血漿と4種類のDOACモデル療法血漿あるいはDOAC除去処理血漿を用いてAPTTクロスミキシングテストを実施した。International Society on Thrombosis and HaemostasisのLA診断ガイドライン改訂版³⁾では，クロスミキシングテストにおける血漿混合比率は（正常血漿：被験血漿）について，（10:0）・（5:5）・（0:10）の3ポイントを許可している。本研究では各種DOACがLAの凝固時間プロットパターン判定に及ぼす影響を検討することが目的であることからLA判定に重要な即時反応については，正常血漿と被験血漿の混和を（10:0）・（9:1）・（8:2）・（5:5）・（0:10）の5ポイントとした。遅延反応については，LA診断ガイドライン改訂版に従って血漿混合比率は（正常血漿：被験血漿）＝（10:0）・（5:5）・（0:10）の3ポイントとした。即時反応は血漿混和直後のAPTT［s］を，遅延反応は混合血漿を37℃・2時間インキュベーションした後のAPTT［s］を測定した。

2） クロスミキシングテストパターンおよびIndexによる判定

縦軸をAPTT［s］，横軸を被検血漿混合比率［%］とし，凝固時間プロットパターンを示すグラフを作成した。グラフを基に，4種類のDOACモデル療法血漿あるいはDOAC除去血漿のクロスミキシンググラフが，正常血漿添加により補正される（下に凸）パターンか，インヒビターにより阻害される（上に凸）パターンかを視覚的に判定した。

客観的なパターン判定に加え，国際血栓止血学会が推奨するindex（index of circulating anticoagulant; ICA）⁸⁾を用いた評価も併せて実施した（Figure 2）。Indexの算出方法を以下に示す。

Figure 2　 Indexの算出方法

国際血栓止血学会が推奨しているindex（index of circulating anticoagulant; ICA）を用いた評価法。Index＝（被検血漿比率50%のAPTT［s］－正常血漿100%のAPTT［s］）①／患者血漿比率100%のAPTT［s］×100 ②によって算出した。

Index＝（被検血漿比率50%のAPTT［s］－正常血漿100%のAPTT［s］）①／被検血漿比率100%のAPTT［s］×100 ②

Indexのカットオフ値は既報の値を採用し，カットオフ値となる < 15である場合に凝固因子欠乏，index値が15 ≤ である場合にLA及びインヒビター陽性と判定した⁸⁾。

3） APTT系LA確認試験

市販のスタクロットLA（富士レビオ，Japan）を測定に用い，市販の添付文書に従って，凝固時間を測定した。緩衝液を添加した方のAPTT時間をCT1［s］，リン脂質剤を添加した方のAPTT時間をCT2［s］とし，CT1とCT2の凝固時間の差が8［s］以上であった場合に，APTT-LA陽性と判定した。

本研究は，山口大学大学院医学系研究科保健学専攻医学系研究倫理審査委員会の承認（管理番号：734-2）を得て実施した。

III　 結果

1． クロスミキシングテストの目視判定

クロスミキシングテストにおける凝固プロットパターンを目視で判定した結果，4種類すべてのDOAC（dabigatran・rivaroxaban・edoxaban・apixaban）モデル療法血漿（低濃度・高濃度）において，即時および遅延反応ともに，LA疑いパターンを呈した（Figure 3–6）。

Figure 3　 トロンボチェックAPTT-SLAを用いたクロスミキシングテスト結果

トロンボチェックAPTT-SLAでは，即時反応において，低濃度／高濃度関係なく，すべてのDOACsでLAの存在を疑うパターンを呈した。DOAC除去血漿では，APTTの延長は改善されたものの，クロスミキシング試験のパターンは判定不能であった。

Figure 4　 コアグピアAPTT-Nを用いたクロスミキシングテスト結果

コアグピアAPTT-Nでは，DOAC療法モデル血漿では，即時反応で，すべてのDOACsでLA疑いパターンを呈した。DOAC除去処理血漿では，多くのケースでAPTTの延長は改善されたが，apixaban含有血漿では，DOACの影響を除去できず，LA疑いパターンを呈した。

Figure 5　 ヒーモスアイエルAPTT-SPを用いたクロスミキシングテスト結果

ヒーモスアイエルAPTT-SPでは，即時反応において，すべてのDOACsでLA疑いパターンを呈した。そして，DOAC除去処理血漿apixaban・rivaroxaban・dabigatran含有血漿では，DOACの影響を除去できず，LA疑いパターンを呈した。

Figure 6　 PTT-LAを用いたクロスミキシングテスト結果

PTT-LAでは，すべてのDOAC療法モデル血漿でLA疑いパターンを呈した。DOAC除去処理血漿では，DOACの影響を除去できず，全てでLA疑いパターンを呈した。

DOAC除去血漿では，トロンボチェックAPTT-SLAにおいて，APTTの延長は改善されたものの，クロスミキシング試験のパターンは判定不能であった。コアグピアAPTT-Nでは，DOAC除去処理血漿において，多くのケースでAPTTの延長は改善されたが，apixaban含有血漿では，DOACの影響を除去できず，LA疑いパターンを呈した。ヒーモスアイエルAPTT-SPでは，apixaban・rivaroxaban・dabigatran含有血漿において，DOACの影響を除去できず，LA疑いパターンを呈した。PTT-LAでは，DOACの影響を除去できず，全てでLA疑いパターンを呈した（Figure 3–6）。

2． ICAを用いた判定

ICAを用いた数値的な判定では，PTT-LAを用いたrivaroxaban含有血漿（低濃度）のクロスミキシング試験において，凝固因子欠乏パターンを示したが，残る全てのDOACモデル療法血漿・試薬においてLAおよびインヒビター疑いのindexを呈した（Table 3）。

Table 3　ICAを用いた判定結果

試薬		トロンボチェック APTT-SLA		コアグピア APTT-N		ヒーモスアイエル APTT-SP		PTT-LA試薬 「FR」
		即時	遅延	即時	遅延	即時	遅延	即時	遅延
Dabigatran	低濃度	28.4	28.4	31.4	30.8	29.1	34.4	26.0	30.5
	高濃度	37.9	34.8	36.0	28.4	44.1	37.3	32.1	34.4
Rivaroxaban	低濃度	28.4	23.6	25.1	23.9	22.5	22.1	13.9	20.4
	高濃度	30.0	35.1	27.2	25.6	25.3	26.6	16.7	26.4
Edoxaban	低濃度	23.9	26.4	26.9	22.6	24.7	25.5	25.5	26.0
	高濃度	27.1	23.9	27.6	27.0	29.7	28.0	26.0	30.1
Apixaban	低濃度	21.2	20.1	18.1	19.0	16.6	18.9	17.8	20.8
	高濃度	22.9	22.1	16.2	20.6	19.7	21.2	19.0	23.3

ICAを用いた数値的な判定では，PTT-LA を用いたrivaroxaban含有血漿（低濃度）のクロスミキシング試験において，凝固因子欠乏パターンを示したが，残る全てのDOACモデル療法血漿・試薬においてLAおよびインヒビター疑いのindexを呈した。

3． スタクロットLAによる確認試験

4種類のDOAC高濃度含有血漿に加え，コントロールとしてLA陽性血漿及び凝固因子欠乏血漿を用いて確認試験を実施した結果，4種類のDOAC含有血漿全てにおいて，CT1 − CT2が8秒以内であり，LA陰性と判定できた（Table 4）。

Table 4　スタクロットLAによる確認試験

被検血漿	Staclot-LA試薬
	CT1 − CT2（秒）
Dabigatran高濃度含有血漿	< 8
Rivaroxaban高濃度含有血漿	< 8
Edoxaban高濃度含有血漿	< 8
Apixaban高濃度含有血漿	< 8
LA陽性血漿	> 28.2
凝固因子欠乏血漿	< 8

4種類のDOAC高濃度含有血漿に加え，コントロールとしてLA陽性血漿及び凝固因子欠乏血漿を用いて確認試験を実施した結果，4種類のDOAC含有血漿全てにおいて，CT1 − CT2が8秒以内であり，LA陰性と判定できた。

IV　 考察

実臨床においてAPTT延長の原因が凝固因子欠乏や凝固因子インヒビターなど出血性素因なのか，LAによる血栓性素因なのかを鑑別するクロスミキシングテストは極めて重要である⁴⁾。

しかし，DOACs療法患者血漿でAPTT-クロスミキシングテストを実施した場合，凝固プロットパターンおよびindex値ともに，多くのケースでLA偽陽性パターンを呈するため，正しい診断を導けないことが危惧された。これは，DOACが凝固カスケードのProthrombinase複合体のⅩaや転換されるトロンビンを直接阻害することによりAPTTを延長させる機序と，LAがリン脂質を介してProthrombinaseやTenase活性を阻害する作用機序が類似するためだと考えられる。また，DOAC除去処理血漿を使用しても，DOACの影響を回避できるケースとできないケースが認められ，実臨床で使用するには大きなリスクを伴うことが危惧される。その理由として，活性炭による除去はDOACの種類によって効果が異なり完全には取り除けない可能性がある。APTTクロスミキシングテストにおいて，血漿中に残存するDOACが凝固抑制効果を発揮し続け，LAおよび凝固因子インヒビターの判定に影響を及ぼすと考えられる。

一方，スタクロットLAによる確認試験では，4種類のDOAC含有血漿全てにおいてCT1 − CT2が8秒以内でありLA陰性と正しく判定でき，LA陽性血漿ではCT1 − CT2 = 28.2秒で明らかな陽性判定だった。したがって，DOAC療法患者でLA検査を実施する場合はAPTTクロスミキシングテストだけでは不十分であり，APTT系LA検査の確認試験であるスタクロットLAを実施することが重要であると考えられる。

V　 結語

LA活性は，APSの検査診断所見の1つであるとともに，APSにおける最も重要な血栓症リスク因子である^5)～7)。したがってLA活性を正確に測定する検査は極めて重要である。本研究成果が実臨床におけるLA検査に少しでも貢献できれば幸いである。

COI開示

本論文に関連し，開示すべきCOI 状態にある企業等はありません。

文献

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