【背景】CRISPR-Cas9を利用した受精卵のゲノム編集はノックアウトやノックインなどの遺伝子改変動物の作製に利用されている。一方，CRISPR-Cas9の標的配列にはPAMと呼ばれる特定の塩基配列が必要であり，標的設計を制限する一因となっている。一般的に利用されているS. pyogenes由来CRISPR-Cas9はNGGをPAMとして認識するが，近年，哺乳動物培養細胞および植物細胞においてNGをPAMとして利用することができるCas9変異体（SpCas9-NG）が報告された。本研究では，SpCas9-NGによる受精卵ゲノム編集によって遺伝子改変マウスの作製が可能であるか検証した。【方法】Tyr遺伝子座位においてNGNをPAMとする標的座位へguide RNAを設計し，C57BL/6NCr由来受精卵にSpCas9-NG mRNAと共注入し，着床前胚で変異導入率を調べた。また，一部の注入卵を胚移植し，産子の変異導入率と表現型を観察した。同様に，SpCas9-NG によってNr6a1を標的としたFlag-tag配列ノックインマウスの作製が可能か検討した。【結果】着床前胚の解析によって，SpCas9-NG を利用することでNGGと同等の効率でNGA，NGT，NGCをPAMとする座位への変異導入が認められた。また，得られた個体の大部分で標的座位への変異導入が認められ，チロシナーゼ欠失の表現型である白色毛が認められた。同じく，大部分の産子でNr6a1標的座位へのFlag-Tag配列のノックインが認められた。ノックイン個体の精巣を用いてRT-PCRとウェスタンブロッティングを行った結果，Flag-Tagが付加されたNr6a1の転写産物および翻訳産物の発現が認められた。また，ノックイン個体から自然交配を介して得た次世代個体の遺伝子型判定を行った結果，ノックインアレルの遺伝が認められた。【結論】SpCas9-NGは受精卵を介した遺伝子改変マウスの作製に利用可能であることが明らかとなった。
