マウス卵母細胞および初期胚におけるエレクトロポレーションを用いた複数遺伝子のノックダウン

抄録

【目的】哺乳動物の受精卵は，受精直後の発生では卵母細胞中に蓄えられた母性因子を用いて発生を維持している。初期胚の遺伝子発現の解析には1細胞期胚に標的とする遺伝子のmRNAを分解する低分子二本鎖RNA（siRNA）を注入し，RNA干渉を誘導して遺伝子をノックダウンする手法が一般的に用いられている。しかし，1細胞期にsiRNAを導入した場合，mRNAの分解はおもに2細胞期以降となるため，従来の手法では卵母細胞内のmRNAの機能解析は困難であった。そこで本研究では，受精前のGV期のマウス卵母細胞に対して遺伝子をノックダウンする簡便な手法の開発を目的とした（実験1）。また，多くの遺伝子は単一の遺伝子の機能を阻害しても，類似の機能を持った遺伝子がその機能を補完することで表現型が現れない場合がある。そこで本研究では上記に加え，マウス初期胚に対して複数遺伝子を同時にノックダウンする簡便な手法を開発することを目的とした（実験2）。【方法】siRNAの導入には，マウス卵巣から回収したGV期の卵母細胞（実験1）と受精後3時間のマウス1細胞期胚（実験2）に対して，ネッパジーン社のエレクトロポレーターNEPA21を用いてエレクトロポレーションによって行った。実験1ではエレクトロポレーションの後に体外成熟及び体外受精を行い，受精直前または受精後24時間で遺伝子発現の操作変化を検討した。実験2では，エレクトロポレーションの際に，2種類あるいは3種類のsiRNA溶液を混合してエレクトロポレーションを行い，受精後48時間でRT-qPCRにより遺伝子発現の変化を検討した。【結果】それぞれの標的遺伝子が8割以上の効率でノックダウンされていることを確認し，GV期の卵母細胞に存在するmRNAのノックダウンと受精卵における複数遺伝子の同時ノックダウンに成功した。