【目的】Cre-loxPシステムを用いた条件付きノックアウトは，遺伝子の機能解析に有効である。我々は，CRISPR-Cas9ゲノム編集システムを用い，1細胞期および2細胞期に左右2種類のloxPドナーを別々にエレクトロポレーション（EP）でノックイン（KI）すると，2種類のドナーを同時にKIした場合と比較してfloxマウス作製効率を上昇させることができることを報告した（Sci Rep. 7: 7891, 2017）。しかし，2細胞期でEPを行うと約20％の胚で割球融合が生じ，これらの胚は4倍体となり成育には至らないため，割球融合を抑制する方法の開発が必要であった。【方法】本研究では，MeCP2遺伝子座に対して，左右2種類のloxPドナーを設計し，1細胞期あるいは2細胞期にEPにより導入した。2細胞期の割球融合を阻害するために，EPの事前処理として，1）高張液処理，2）カルシウム（Ca）フリー処理，3）サイトカラシンBによるアクチン重合阻害の3条件を検討した。それぞれの実験において，割球融合率，胚盤胞または産仔への発生率，KI効率を未処理区と比較した。【結果】高張液処理においては，割球融合を完全に抑制することができたものの，KI効率は減少した。一方，Caフリー処理またはアクチン重合阻害では発生率やKI効率に悪影響を与えずに，割球融合だけを抑制することができた。最終的にB6D2F1およびC57BL/6J由来受精卵からflox産仔が効率良く得られた。以上より，2段階EPにおける2細胞期胚のCaフリー処理またはアクチン重合阻害は割球融合を抑制し，floxマウス作製効率を上昇させることが明らかとなった。現在，AMEDの創薬等先端技術支援基盤プラットフォームでは，本技術を使ったゲノム編集マウス作製支援を行なっており，作製依頼を受け付けている（https://www.binds.jp/supports/view/87）。
