マウス受精卵におけるbioRPOTACによるタンパク質分解能の評価

抄録

【目的】標的タンパク質分解による遺伝子機能の阻害は，DNAやRNAを標的とする方法とは異なり，迅速な阻害効果が期待できる。近年，E3ユビキチンリガーゼ結合配列とIntrabodyの融合遺伝子であるbioPROTACが，培養細胞内のタンパク質分解に利用可能であることが報告されている。本研究では，マウス受精卵の内在性タンパク質の分解にbioPROTACが利用可能か検討した。【方法】SunTagを付加した蛍光タンパク質をコードしたmRNAをC57BL/6由来マウス受精卵に顕微注入し，卵割後に片方の割球にSunTagを標的とするbioPROTACをコードしたmRNAを顕微注入し，注入・非注入割球の蛍光発現量をタイムラプス観察し，分解速度を測定した。続いて，受精卵における内在性タンパク質の分解が可能か検討するために，SunTagに加えて，I2PP2AおよびPCNAを標的とするbioPROTACを構築し，野生型マウスまたはSunTagノックインマウス由来の受精卵へbioPROTAC mRNAを注入し，24時間後にウェスタンブロットによって標的タンパク質の発現量を観察した。【結果】H2B-eGFP-SunTagを基質として利用し，SunTagを標的としたbioPROTACの分解能を評価した。その結果，bioPROTAC注入割球のみで注入後およそ3時間でeGFPシグナルが検出限界以下まで低下し，bioPROTACによる迅速な基質分解誘導が可能であることが明らかとなった。内在性I2PP2AまたはPCNAに対するbioPROTACの効果を検討した結果，非注入区に対して注入区で顕著なタンパク質発現量の低下が認められた。また，Cdk1-SunTagノックインマウスに由来する受精卵にSunTagに対するbioPROTACを注入した結果，CDK1タンパク質発現量の顕著な低下が認められた。以上より，bioPROTACは受精卵において内在性タンパク質の迅速な分解誘導に利用できることが明らかとなった。