ウシ凍結保存精子でのFull-typeハイパーアクチベーションに及ぼすプロテインホスファターゼ阻害剤Calyculin Aの影響

抄録

【目的】私たちは，人工授精用のウシ凍結保存精子に使用できる「Full-typeハイパーアクチベーション（F-HA）能力を指標とする新規の活力検査法」の開発を進めており，その確立には体外で効率よくF-HAを誘起するための手法が必要である。本研究では，ウシ凍結保存精子でのF-HA誘起に及ぼすプロテインホスファターゼ（PP）阻害剤Calyculin A（CL-A）処理の影響を検討した。またCL-A処理が精子の運動調節因子glycogen synthase kinase（GSK）-3α（51 kDa型）に及ぼす影響を観察した。【方法】ウシ凍結保存精子を洗浄後にCL-A（10～100 nM）を添加したcAMPアナログ含有mKRH液に浮遊させて60～300分間，38.5℃で処理した。処理の前後に試料の顕微鏡動画を撮影し，動画をコマ送り再生して運動率およびF-HA率を調べた。またウェスタンブロッティングにより，CL-A処理がGSK-3αおよびそのSer21でのリン酸化（不活性化）状態に及ぼす影響を観察した。【結果】（運動性への影響）運動率はCL-Aの添加の有無に関係なく処理時間とともに低下したが，F-HA率は60または120分間の処理後にCL-A（10～100 nM）添加区（22.2～28.9%）において無添加の対照区（2.4～3.1%）よりも有意に高い値を示した。（GSK-3αへの影響）処理前の試料ではGSK-3αは明瞭に検出され，そのSer21でのリン酸化は高い状態であった。処理60分間後のCL-A（10 nM）添加区においてGSK-3αの検出量は対照区よりも大きく低下したが，残存したGSK-3αのSer21でのリン酸化状態は対照区よりも高く維持される傾向を示した。（まとめ）短時間（60～120分間）のCL-A処理はウシ凍結保存精子でのF-HAの効率的な誘起に有効であった。またこの処理は精子でのGSK-3αの減少および不活性化維持に関与する可能性が示唆された。